（高清版）GBT 38490-2021 微生物高通量適應性進化測定 微流控芯片法

微生物高通量適應性進化測定微流控芯片法2021-12-31發(fā)布2022-07-01實施國家標準化管理委員會I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國標準化研究院提出并歸口。本文件起草單位：清華大學、洛陽華清天木生物科技有限公司、中國標準化研究院。1微生物高通量適應性進化測定微流控芯片法本文件規(guī)定了用微流控芯片法測定微生物高通量適應性進化的方法。本文件適用于利用微流控芯片法對不產生表面活性劑的單細胞形態(tài)可培養(yǎng)微生物的高通量適應性進化的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。適應性進化adaptiveevolution在實驗室條件下通過對微生物在某一特定環(huán)境下進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，來模擬微生物對環(huán)境的長期適應過程。適合度fitness生物體或生物群體對環(huán)境適應的量化特征，是評估生物所具有的各種特征的適應性，以及在進化過程中繼續(xù)往后代傳遞能力的指標。4原理在微生物培養(yǎng)芯片上生成培養(yǎng)基包裹菌體的微液滴，通過液滴在芯片主管道中的往復運動使微生物在芯片上生長繁殖，通過液滴分割融合操作實現(xiàn)培養(yǎng)基的不斷補充和更換，實現(xiàn)微生物連續(xù)傳代，以實現(xiàn)微生物對特定培養(yǎng)條件的適應性進化，獲得生長速率提高或者對特定環(huán)境獲得耐受性提高的菌株。5試劑和材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。25.2培養(yǎng)基根據(jù)不同菌株的需求配置相應的培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3油相配制含10g/L司盤-80的礦物油作為液滴生成的油相，混合均勻，室溫保存?zhèn)溆谩?儀器設備6.1微生物微液滴培養(yǎng)儀。6.2微生物培養(yǎng)芯片。7適應性進化操作步驟7.1菌體準備與培養(yǎng)從凍存管中蘸取菌液涂布于固體培養(yǎng)基上活化，在菌體最適生長條件下培養(yǎng)，直至固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)便于挑取的單菌落。在無菌條件下挑取固體培養(yǎng)基上單菌落放入相應的液體培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床在最適條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期。7.2微生物培養(yǎng)芯片安裝及初始化操作如下：a)使用0.22μm的濾膜過濾礦物油，油相進樣瓶在121℃下高溫高壓滅菌15min。用無菌針管吸取過濾后的礦物油沖洗微生物培養(yǎng)芯片內部2次～3次。將盛有60mL～80mL過濾后的礦物油的油相進樣瓶和沖洗后的微生物培養(yǎng)芯片置于紫外燈下照射超過1h后，安裝至微生物微液滴培養(yǎng)儀相應位置。b)設定油水檢測激光光壓值，設定合適的培養(yǎng)溫度，進行初始化操作。初始化時間應大于6h。7.3樣品準備準備三個試劑進樣瓶并編號A、B、C,清洗后在121℃下高溫高壓滅菌15min。準備新鮮培養(yǎng)基和含一定濃度(根據(jù)實驗要求而定)脅迫因子的培養(yǎng)基各8mL～10mL;準備用無菌培養(yǎng)基稀釋50倍的生長到對數(shù)生長中后期的菌液3mL～5mL。用無菌針管先向三個試劑進樣瓶側管注入4mL～8mL油相。注射完畢旋轉進樣瓶，讓油相浸濕整個進樣瓶內部，以同樣方式向A瓶注入菌液約3mL～4mL,向B瓶和C瓶分別注入新鮮培養(yǎng)基和含脅迫因子的培養(yǎng)基6mL～8mL,最后注入油相將進樣瓶裝滿；再將試劑進樣瓶對應安裝進微生物微液滴培養(yǎng)儀中。再次初始化排出試劑進樣瓶中的空氣，時間應不少于10min。7.4傳代條件設置和液滴生成選擇“適應性進化”功能，設定所需生成液滴的數(shù)量和菌體濃度檢測波長。設定傳代方式。傳代方式有兩種：一是根據(jù)細菌光密度(opticaldensity,OD)設定，即菌株生長至GB/T38490—2021所設定的OD值后進行傳代；二是按時間傳代，即培養(yǎng)菌株至所設定的時間后進行傳代?？筛鶕?jù)實驗需求設定傳代方式及相應參數(shù)。設定脅迫因子濃度梯度。根據(jù)實驗需求設定在每次傳代過程中所要施加的脅迫因子濃度梯度(最多可設置8個梯度)。運行液滴生成功能，微生物微液滴培養(yǎng)儀自動生成液滴，液滴的體積為2μL。7.5菌體芯片培養(yǎng)和生長狀況監(jiān)測液滴生成后，運行液滴培養(yǎng)功能，進行菌體生長狀況監(jiān)測。7.6數(shù)據(jù)處理和結果計算7.6.1繪制菌體生長曲線根據(jù)液滴內菌體生長狀況監(jiān)測數(shù)據(jù)，繪制不同傳代批次時菌體生長隨時間變化的曲線。7.6.2計算菌體的比生長速率比生長速率可按式(1)計算：μ——比生長速率，單位為每小時(h-1);t?——菌體對數(shù)生長后期所處的時間，單位為小時(h);t?——菌體對數(shù)生長前期所處的時間，單位為小時(h);X?——t?時刻微生物細胞量，以微生物濁度(OD)計；X?——t?時刻微生物細胞量，以微生物濁度(OD)計。根據(jù)第一代的微生物生長隨時間變化的曲線，觀察對數(shù)期，選擇對數(shù)期內的曲線上兩點(t?,X?)和(t?,X?),利用式(1)計算得到適應性進化前菌體的比生長速率μ(0)。根據(jù)第n次傳代后的微生物生長隨時間變化的曲線，觀察對數(shù)期，選擇對數(shù)期內的曲線上兩點(t?,X?)和(t?,X?),利用式(1)計算得到適應性進化n代后菌體的比生長速率μ(n)。7.6.3計算菌體適應性進化的適合度菌體適應性進化的適合度可由菌體比生長速率的增長率來表示，按式(2)計算： (2)R(n)——傳代培養(yǎng)第n代后菌體比生長速率的增長率；μ(n)——傳代培養(yǎng)第n代后菌體的比生長速率；μ(0)——初始菌體的比生