海參及其制品中海參多糖的測(cè)定 高效液相色譜法-編制說(shuō)明

《海參中海參多糖的測(cè)定高效液相色譜

法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

編制說(shuō)明

中國(guó)海洋大學(xué)

二零二一年二月

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國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

《海參中海參多糖的測(cè)定高效液相色譜法》

編制說(shuō)明

1任務(wù)來(lái)源

本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)是根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)下達(dá)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定計(jì)劃《海參中

海參多糖的測(cè)定高效液相色譜法》項(xiàng)目（計(jì)劃號(hào)為20205073-T-424）起草。本項(xiàng)目為2017

年國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃NQI項(xiàng)目《主要農(nóng)業(yè)廢棄物提取加工與功效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)研究》

（2017YFF0207800）中一個(gè)任務(wù)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃《海參中海參多糖的測(cè)定高效液相色譜法》

由中國(guó)海洋大學(xué)上報(bào)，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院歸口上報(bào)及執(zhí)行，主管部門(mén)為國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總

局。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)海洋大學(xué)、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、大連棒棰島海產(chǎn)股份有限公司、山東好當(dāng)

家海洋發(fā)展股份有限公司、大連獐子島漁業(yè)集團(tuán)股份有限公司、山東東方海洋科技股份有限

公司、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所共同起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王靜鳳、薛長(zhǎng)湖、樊

燕。

2標(biāo)準(zhǔn)目的和意義

2.1海參相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要

海參(seacucumber)，屬棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinodermata)，海參綱(Holothurioider)，是棘皮動(dòng)

物中經(jīng)濟(jì)價(jià)值最大的一綱。全世界海參約有1100多種，我國(guó)有100多種，可供食用的有20

多種，其中以仿刺參的品質(zhì)和口感最佳。海參含有蛋白質(zhì)、多糖、微量元素和維生素等多種

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，已經(jīng)作為功能食品而被引起關(guān)注。更重要的是，它們含有大量的生物活性物質(zhì)如

海參皂甙、粘多糖和膠原蛋白等，具有潛在的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值。

隨著人們生活水平的提高，與海參相關(guān)的食品、保健品和藥品日益成為市場(chǎng)消費(fèi)的熱點(diǎn)

和主流。2019年海參產(chǎn)值達(dá)600億元。市售海參產(chǎn)品種類(lèi)紛繁，干海參（淡干、鹽干、凍干）、

海參口服液、海參膠囊、海參酒、海參牛奶充斥市場(chǎng)，名產(chǎn)品牌效應(yīng)日益突顯。為改善產(chǎn)品

良莠不齊，避免以次充好的現(xiàn)象出現(xiàn)，保證海參產(chǎn)品安全，建立控制體系顯得尤為必要。

海參多糖作為主要的活性成分，其含量對(duì)其食用及藥用價(jià)值影響很大，是不可或缺的海

參營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)指標(biāo)。海參中多糖類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且因海參種類(lèi)和生長(zhǎng)環(huán)境的不同而有差別。

不同種類(lèi)海參中的多糖結(jié)構(gòu)不同，而不同產(chǎn)地的同種海參中海參巖藻聚糖硫酸酯（SC-FUC）

和海參硫酸軟骨素（SC-CHS）的含量也不盡相同。另外，海參中蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、微量

元素等復(fù)雜成分的存在，會(huì)給海參多糖的測(cè)定帶來(lái)很多困難，采用簡(jiǎn)單的分光光度法或稱(chēng)重

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法很難滿足以海參多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)建立海參制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。因此，制訂簡(jiǎn)單可信的海

參多糖的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和緊迫性。

2.2完善國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的需要

經(jīng)查詢，目前ISO、AOAC的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中都沒(méi)有海參及其制品中海參多糖含量測(cè)定方法

的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。而我國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中有一項(xiàng)與之相關(guān)，為《刺參及其制品中海參多糖的測(cè)定高效

液相色譜法》（SC/T3049-2015），該標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)刺參及其制品中海參多糖含量給出了明確的測(cè)

定方法，并對(duì)該方法對(duì)刺參及其制品中海參多糖的檢出限和定量限進(jìn)行了說(shuō)明。

2.3維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益的需要

海參富含糖蛋白、酸性多糖、海參皂甙、神經(jīng)節(jié)苷酯等多種生物活性物質(zhì)，因具有抗腫

瘤、抗凝血、降血脂、消除疲勞，提高免疫力等功效，已成為一種深受大眾喜愛(ài)的時(shí)尚消費(fèi)

品。目前市場(chǎng)上的海參，每斤少則1000多元，多則數(shù)千元不等，價(jià)格差異較大。由于檢驗(yàn)方

法標(biāo)準(zhǔn)的滯后，海參的優(yōu)劣只能從一些外觀指標(biāo)上評(píng)判。目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的各類(lèi)海參制品，

往往不能從外觀判斷其中海參含量到底有多少。為了維護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益，制訂有效的海

參多糖檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

2.4應(yīng)對(duì)國(guó)際貿(mào)易的需要

海參是全球華人喜愛(ài)的食品，東南亞是海參的主要市場(chǎng)，消費(fèi)量占全球的90%左右。海

參由于其品種和生長(zhǎng)水域的不同，其營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分的含量也大不相同，黃渤海域出產(chǎn)

的日本刺參品質(zhì)優(yōu)良，我國(guó)亦是海參生產(chǎn)和進(jìn)出口大國(guó)，為了保證進(jìn)出口產(chǎn)品的質(zhì)量，制訂

與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)水平相當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

2.5統(tǒng)一檢測(cè)方法的需要

我國(guó)尚未確定對(duì)海參多糖的檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，目前多糖的檢測(cè)方法，無(wú)

法實(shí)現(xiàn)對(duì)海參及其制品中海參多糖準(zhǔn)確的定性和定量分析，為了做到科學(xué)、準(zhǔn)確地測(cè)定海參

多糖的含量，制訂一個(gè)統(tǒng)一的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

2.6完善國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的需要

中國(guó)海參市場(chǎng)已經(jīng)全面成型，海參消費(fèi)正在從北方擴(kuò)展到南方，直至到全國(guó)市場(chǎng)。但海

參品種之間、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值之間均有較大差別，而我國(guó)現(xiàn)有的海參多糖檢測(cè)方法存在較大的局限

性，也不能滿足復(fù)雜海參制品中海參多糖的檢測(cè)需要。因此，制訂海參多糖的檢測(cè)方法也是

完善食品檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的需要。

3海參多糖研究現(xiàn)狀

海參多糖是海參體內(nèi)一種重要的生物活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)存在于海參體壁的多糖主要分

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兩類(lèi)：一類(lèi)為巖藻糖基化的海參硫酸軟骨素（SC-CHS），是由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄

糖醛酸和L-巖藻糖組成的分支雜多糖，相對(duì)分子質(zhì)量為4萬(wàn)-5萬(wàn)；另一類(lèi)為海參巖藻多糖

（SC-FUC），是由L-巖藻糖所構(gòu)成的直鏈多糖，相對(duì)分子質(zhì)量為8萬(wàn)-10萬(wàn)。兩者的組成糖

基雖不同，但糖鏈上都有部分羥基發(fā)生硫酸酯化，并且硫酸酯基類(lèi)多糖含量均在32%左右，

兩種海參多糖的特殊結(jié)構(gòu)，均為海參所特有。

海參中多糖類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且因海參種類(lèi)和生長(zhǎng)環(huán)境的不同而有差別。不同種類(lèi)海

參中的多糖結(jié)構(gòu)不同，而同種海參中海參硫酸軟骨素（SC-CHS）和海參巖藻聚糖硫酸酯

（SC-FUC）的含量也不盡相同。另外，海參中還含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、微量元素等復(fù)雜

成分，必然會(huì)給海參中總多糖的測(cè)定帶來(lái)很多困難。隨著人們生活水平的提高，與海參相關(guān)

的食品、保健品和藥品日益成為市場(chǎng)消費(fèi)的熱點(diǎn)和主流。海參多糖作為主要的活性成分，其

含量對(duì)其食用及藥用價(jià)值影響很大，是不可或缺的海參營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)指標(biāo)。市面上目前的海參品

種復(fù)雜，而采用簡(jiǎn)單的分光光度法或稱(chēng)重法很難滿足以海參多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)建立海參制品質(zhì)

量標(biāo)準(zhǔn)的要求。因此迫切需要建立一種簡(jiǎn)便可信的海參多糖測(cè)定方法。

已有的關(guān)于多糖含量的測(cè)定方法，如“測(cè)定海參多糖含量的方法”，對(duì)干海參樣品經(jīng)堿溶，

超聲提取，二次醇沉等步驟，最后對(duì)樣品干燥至恒重后測(cè)得多糖含量，該方法對(duì)目標(biāo)測(cè)定物

的選擇性不強(qiáng)，樣品中的雜質(zhì)如鹽、微量元素、蛋白質(zhì)等成分易引起較大的測(cè)定誤差，易給

測(cè)定結(jié)果帶來(lái)進(jìn)一步的誤差，且不適合添加了海參或海參酶解物的樣品中海參多糖含量的測(cè)

定；“測(cè)定蘆薈多糖的新方法”采用了分光光度法測(cè)定了蘆薈多糖，具有較好的重復(fù)性和精密

度，然而因?yàn)楹⒍嗵侵泻衅咸烟侨┧岷桶被?，二者在該種方法中不顯色，所以也不適

合海參多糖含量的測(cè)定；董平等采用以巖藻聚糖硫酸酯（Fucoidan）作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用次甲

基蘭法測(cè)定了海參多糖的含量，結(jié)果表明，該法能夠應(yīng)用于測(cè)定海參多糖的含量，但是由于

海參多糖同時(shí)含有巖藻聚糖硫酸酯和硫酸軟骨素，而且兩者與次甲基蘭結(jié)合后的顯色強(qiáng)度不

同，因此難以以單一多糖作為顯色標(biāo)準(zhǔn)品，且分光光度法本身存在一定的誤差，易受溶液中

色素、皂苷等其他雜質(zhì)的影響，只適合比較純的樣品的多糖含量測(cè)定，不適合成分較復(fù)雜的

海參制品中的多糖含量的測(cè)定。

近年來(lái)以高效液相色譜為基礎(chǔ)的多糖的定量方法發(fā)展較快，如“一種多糖定量檢測(cè)方法與

系統(tǒng)”靈敏準(zhǔn)確，但對(duì)設(shè)備要求較高，且通常該方法適用于糖組成以中性糖含量為主的多糖。

海參多糖中有較高含量的糖醛酸和氨基糖，用該方法不能夠柱后顯色。另外，海參多糖中兩

種糖的種間差異大，無(wú)法確定具體以何種多糖作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分光光度或者液相色譜測(cè)定。

文獻(xiàn)表明，1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮（PMP）可以修飾糖環(huán)的還原端，使其具有高度紫外吸

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收，修飾糖能在反相高效液相色譜柱上得到很好的分離，并且衍生過(guò)程簡(jiǎn)便快捷，用于單糖

組成測(cè)定非常有效，目前已有許多相關(guān)報(bào)道。

本方法采用PMP-柱前衍生高效液相色譜法和巖藻糖對(duì)不同海參制品中海參總糖進(jìn)行定

量。巖藻糖是SC-CHS和SC-FUC中都存在的一種單糖，且同一種海參中巖藻糖占多糖總量

的百分含量一定，因此同種海參中的多糖含量和巖藻糖含量之間存在固定的轉(zhuǎn)換系數(shù)。巖藻

糖衍生物在254nm有強(qiáng)吸收，并且能夠與其他種類(lèi)單糖較好分離，高效液相可以達(dá)到很好的

分析定量效果。而葡萄糖醛酸亦可以作為海參鑒定海參多糖的一個(gè)重要指標(biāo)。因此能夠以本

方法為基礎(chǔ)，建立以海參多糖為指標(biāo)的海參產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。

4標(biāo)準(zhǔn)主要起草過(guò)程

4.1標(biāo)準(zhǔn)制定工作組的成立

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目立項(xiàng)后，2017年11月10日在北京市西藏大廈召開(kāi)了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《海參

中海參多糖的測(cè)定高效液相色譜法》第一次工作會(huì)。參加單位有中國(guó)海洋大學(xué)、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)

化研究院、中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心等。會(huì)議成立了由中國(guó)海洋大學(xué)、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化

研究院、中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心等單位參加的標(biāo)準(zhǔn)工作組，主要由從事標(biāo)準(zhǔn)制修

訂、儀器分析、具有豐富技術(shù)經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)研究人員組成，工作組制定了初步的標(biāo)準(zhǔn)編制工作

計(jì)劃。

4.2工作計(jì)劃和標(biāo)準(zhǔn)制定原則的確定

按照工作任務(wù)要求，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組制定了標(biāo)準(zhǔn)起草工作計(jì)劃和任務(wù)分工。在充分研究

與討論的基礎(chǔ)上，制定了標(biāo)準(zhǔn)制定原則：

（1）先進(jìn)性：其準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度達(dá)到較高水平。

（2）適用性：要適應(yīng)我國(guó)植物提取物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求，滿足植物提取物現(xiàn)代化的需要。

（3）可操作性：符合我國(guó)目前檢測(cè)儀器設(shè)備和試劑、材料的供應(yīng)條件。

（4）實(shí)用性：符合檢測(cè)從業(yè)人員的技術(shù)水平，能被國(guó)內(nèi)主要的環(huán)境分析實(shí)驗(yàn)室所使用并達(dá)到

所規(guī)定的要求。要有利于提高農(nóng)業(yè)廢棄物綜合利用，為植物提取物質(zhì)量控制部門(mén)、有關(guān)企業(yè)

和三農(nóng)服務(wù)。

4.3國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)的檢索

目前，CAC、AOAC、ISO的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中都沒(méi)有海參及其制品中海參多糖測(cè)定方法的相關(guān)

標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為“刺參及其制品中海參多糖的測(cè)定高效液相色譜法（SC/T

3049-20l5）”。在本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，僅僅標(biāo)明了刺參中海參多糖的含量測(cè)定方法，未能有海參其

他種類(lèi)的測(cè)定方法。目前，市場(chǎng)中存在海地瓜、梅花參、黃海參、石參、黑參等產(chǎn)品，因而

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不能滿足現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的要求?，F(xiàn)有的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為“刺參及其制品中海參多糖的測(cè)定高效液相色

譜法（SC/T3049-20l5）”是本單位制定，具有操作較為簡(jiǎn)便、靈敏度高、穩(wěn)定性好、分離效

果好、適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。本方法可同時(shí)測(cè)定海參制品中葡萄糖醛酸的含量及各單糖的比例，

可同時(shí)用于海參制品中海參多糖存在及實(shí)際添加量的輔助判定。但是，在本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，僅

僅標(biāo)明了刺參中海參多糖的含量測(cè)定方法，未能有海參其他種類(lèi)的測(cè)定方法。目前，市場(chǎng)中

存在海地瓜、梅花參、黃海參、石參、黑參等產(chǎn)品，因而不能滿足現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的要求，迫切需

要擴(kuò)大本標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍和適用對(duì)象。本標(biāo)準(zhǔn)將適用范圍和適用對(duì)象擴(kuò)大升級(jí)后，將有利于

維護(hù)消費(fèi)者健康的需求、統(tǒng)一監(jiān)測(cè)方法的需求、完善國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的需要、應(yīng)對(duì)國(guó)際貿(mào)易的需求。

高效液相色譜-質(zhì)譜法具有準(zhǔn)確度好、精密度高、檢出限與定量限低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，

因此確定采用液相色譜法檢測(cè)海參中的海參多糖。以海參及其制品為樣品，經(jīng)過(guò)初步試驗(yàn)，

證明方法是可行的。而后對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明方法的準(zhǔn)確性、回收

率、精密度等方面都能達(dá)到國(guó)家可標(biāo)準(zhǔn)的要求，并且基本符合制定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的條件，并于2019

年向國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)提出立項(xiàng)申請(qǐng)。

4.4標(biāo)準(zhǔn)方法的建立

標(biāo)準(zhǔn)工作組按照計(jì)劃任務(wù)書(shū)的要求，結(jié)合制定標(biāo)準(zhǔn)的要求，研究建立標(biāo)準(zhǔn)方法的實(shí)驗(yàn)方

案，并進(jìn)行方法前處理?xiàng)l件的選擇、儀器條件的確定和方法精密度、準(zhǔn)確度及檢出限的測(cè)定

等試驗(yàn)。

2018年3月開(kāi)始，標(biāo)準(zhǔn)起草工作組針對(duì)不同海域地區(qū)進(jìn)行海參主產(chǎn)地進(jìn)行調(diào)研，獲取了

大量相關(guān)信息與數(shù)據(jù)。原料樣品采集后，開(kāi)始開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證工作，建立海參及其制品中海

參多糖的測(cè)定高效液相色譜法，包括線性范圍、相關(guān)系數(shù)、加標(biāo)回收率、準(zhǔn)確度、精密度、

檢出限、定量限等，以及樣品中海參多糖的提取條件的優(yōu)化，如提取溶劑種類(lèi)、提取溶劑體

積、超聲提取時(shí)間等。

4.5標(biāo)準(zhǔn)草案的形成

標(biāo)準(zhǔn)起草工作組查閱、收集和整理了國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究進(jìn)展和專(zhuān)利、標(biāo)準(zhǔn)、法規(guī)等文獻(xiàn)資料，

掌握了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)狀；對(duì)文獻(xiàn)中海參多糖測(cè)定方法進(jìn)行了對(duì)比和總結(jié)，為標(biāo)準(zhǔn)文本的編制

奠定理論基礎(chǔ)。在《海參及其制品中海參多糖的測(cè)定高效液相色譜法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第一次起

草工作會(huì)議的基礎(chǔ)上，起草工作組相關(guān)單位共同討論起草形成了《海參及其制品中海參多糖

的測(cè)定高效液相色譜法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)框架和主要內(nèi)容，初步形成了《海參及其制品中

海參多糖的測(cè)定高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)草案。

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4.6標(biāo)準(zhǔn)討論稿和標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)明的形成

2019年7月5日，起草工作組組織相關(guān)單位和專(zhuān)家，在山東青島中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物

理研究所召開(kāi)第二次標(biāo)準(zhǔn)起草工作會(huì)。參會(huì)單位包括中國(guó)海洋大學(xué)、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、中

國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所、浙江大學(xué)、中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心等。

與會(huì)專(zhuān)家對(duì)《海參中海參多糖的測(cè)定高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)草案的英文名稱(chēng)、范圍、術(shù)

語(yǔ)和定義、基本要求、主要技術(shù)指標(biāo)、附錄等章條逐一進(jìn)行了修改，會(huì)后根據(jù)修改意見(jiàn)形成

了《海參中海參多糖的測(cè)定高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)討論稿及其編制說(shuō)明。

4.7標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿和編制說(shuō)明的形成

在前期工作的基礎(chǔ)上，起草工作組組織相關(guān)單位和專(zhuān)家于2019年10月22日在北京中國(guó)

標(biāo)準(zhǔn)化研究院召開(kāi)第三次標(biāo)準(zhǔn)起草工作會(huì)。參會(huì)單位包括中國(guó)海洋大學(xué)、中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)

院、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、浙江大學(xué)等。與會(huì)成員認(rèn)真討論《海參中海參多糖的測(cè)定高效液

相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)討論稿后，根據(jù)討論結(jié)果修改形成了《海參中海參多糖的測(cè)定高效液相色

譜法》征求意見(jiàn)稿及編制說(shuō)明。會(huì)議同時(shí)討論了下一階段征求意見(jiàn)的單位和專(zhuān)家名單。

4.8方法驗(yàn)證

2020年9～11月，對(duì)“海參及其制品中海參多糖的測(cè)定高效液相色譜法”進(jìn)行驗(yàn)證。參

加本標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿方法驗(yàn)證的三個(gè)實(shí)驗(yàn)室，分別屬于國(guó)家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（中國(guó)

水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所）、農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（煙臺(tái)）、青島市

產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，均通過(guò)了“雙認(rèn)證（計(jì)量認(rèn)證/審查認(rèn)可）”評(píng)審或復(fù)審，具備進(jìn)行本

標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目驗(yàn)證工作的條件。通過(guò)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)技術(shù)確認(rèn)外部實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5本標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)內(nèi)外分析方法的關(guān)系

本標(biāo)準(zhǔn)研究旨在建立一項(xiàng)滿足我國(guó)海參及其制品中海參多糖檢測(cè)的要求，在質(zhì)量控制目

標(biāo)和技術(shù)手段上，適應(yīng)我國(guó)大部分質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備和技術(shù)能力的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)查

閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料，制定條件優(yōu)化方案，確保本方法前處理所采用的裝置操作簡(jiǎn)便，能

夠滿足國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室的條件要求。本標(biāo)準(zhǔn)擬采用高效液相色譜法測(cè)定海參多糖。樣品的前處理，

即對(duì)提取時(shí)間、提取溶劑種類(lèi)、提取次數(shù)等因素進(jìn)行優(yōu)化。檢測(cè)方法在穩(wěn)定、可靠和實(shí)用的

基礎(chǔ)上，達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，以適應(yīng)我國(guó)海參及其制品中海參多糖含量檢測(cè)、質(zhì)控與管理的

需要。

目前已有很多關(guān)于多糖含量測(cè)定方法的申請(qǐng)專(zhuān)利及文獻(xiàn)報(bào)道，如專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?/p>

200410036250.7的“測(cè)定海參多糖含量的方法”，該方法對(duì)于海參樣品經(jīng)堿溶，超聲提取，二

次醇沉等步驟，最后將樣品干燥至恒重后測(cè)得多糖含量，但該方法對(duì)目標(biāo)測(cè)定物的選擇性不

9

強(qiáng)，樣品中的雜質(zhì)如鹽、微量元素、蛋白質(zhì)等成分易引起較大的測(cè)定誤差，且不適合海參制

品中海參多糖含量的測(cè)定；專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00410052907.9的“一種多糖定量檢測(cè)方法與系統(tǒng)”，

該方法靈敏準(zhǔn)確，但對(duì)設(shè)備要求較高，而且該方法通常適用于以中性糖含量為主的多糖，海

參多糖中含有較高含量的糖醛酸和氨基糖，用該方法不能夠柱后顯色。另外，也有文獻(xiàn)報(bào)道

采用分光光度法測(cè)定海參多糖含量，以巖藻聚糖硫酸酯作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用次甲基蘭顯色法測(cè)

定了海參多糖的含量，結(jié)果表明，該法能夠應(yīng)用于測(cè)定海參多糖的含量，但是由于海參多糖

同時(shí)含有海參巖藻聚糖硫酸酯和海參硫酸軟骨素兩種組分，而且兩者與次甲基蘭結(jié)合后的顯

色強(qiáng)度不同，因此難以以單一多糖作為顯色標(biāo)準(zhǔn)品，且分光光度法本身存在一定的誤差，易

受溶液中色素等其他雜質(zhì)的影響，只適合比較純的樣品的多糖含量測(cè)定，不適合成分較復(fù)雜

的海參制品中的多糖含量的測(cè)定。最重要是以上方法都不能很好排除市場(chǎng)上的摻假摻雜現(xiàn)象，

因此準(zhǔn)確性難以保證。

本標(biāo)準(zhǔn)方法的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）靈敏度高，巖藻糖衍生物在254nm有很強(qiáng)的吸收，濃度為

8.0×10-4mg/mL時(shí)即可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。（2）穩(wěn)定性好，24小時(shí)內(nèi)巖藻糖衍生物峰面積穩(wěn)定，

RSD≤5％。（3）分離效果好，在此高效液相色譜條件下，巖藻糖能夠與其它單糖明顯分離，

有效避免其它單糖對(duì)巖藻糖的檢測(cè)帶來(lái)的干擾，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。（4）適用范圍較廣，可應(yīng)用

于固態(tài)、液態(tài)等多種刺參制品中海參多糖含量的測(cè)定。（5）本方法能有效排除市場(chǎng)上向刺參

制品中摻入其它來(lái)源多糖而干擾海參多糖準(zhǔn)確定量的問(wèn)題。

6本標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)指標(biāo)的依據(jù)與說(shuō)明

6.1標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)

本標(biāo)準(zhǔn)主要解決海參及其制品中海參多糖含量測(cè)定的技術(shù)問(wèn)題，所以將本標(biāo)準(zhǔn)的名稱(chēng)定

為：《海參中海參多糖的含量測(cè)定高效液相色譜法》，翻譯為“Determinationofseacucumber

polysaccharidesinseacucumber-Highperformanceliquidchromatography”。

6.2前言

明確了本標(biāo)準(zhǔn)的歸口單位及主要起草單位、起草人。

6.3主體內(nèi)容

標(biāo)準(zhǔn)的主體內(nèi)容包括：范圍、規(guī)范性引用文件、原理、試劑、儀器和設(shè)備、測(cè)定步驟、

結(jié)果計(jì)算與表示、精密度和回收率等。

6.4“范圍”的界定

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了海參及以海參為原料加工而成的干海參、即食海參、膠囊、漿液等深加工

制品中海參多糖含量的高效液相色譜測(cè)定方法。

10

本標(biāo)準(zhǔn)適用于海參及以海參及其制品中海參多糖含量的測(cè)定。

6.5檢測(cè)方法的原理

海參多糖（seacucumberpolysaccharides）包含海參巖藻聚糖硫酸酯（seacucumberfucoidan,

SC-FUC）和海參硫酸軟骨素（seacucumberchondroitinsulfate,SC-CHS）兩種成分。在同一

種海參中海參巖藻聚糖硫酸酯和海參硫酸軟骨素的比例基本恒定。海參硫酸軟骨素，是一種

具有巖藻糖支鏈的硫酸化多糖，主要由D-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-巖藻糖構(gòu)

成。同一海參中海參多糖組成的特定性以及海參硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)的特定性，決定了海參多糖

與海參硫酸軟骨素中含有的巖藻糖之間存在固定的質(zhì)量轉(zhuǎn)換系數(shù)，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定

得到海參硫酸軟骨素中巖藻糖含量后可按照公式C=CFuc×K(K為質(zhì)量轉(zhuǎn)換系數(shù))計(jì)算得出海

參多糖的含量。

海參硫酸軟骨素與其它來(lái)源硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)存在明顯差異，其具備巖藻糖基化的特定結(jié)

構(gòu)。本標(biāo)準(zhǔn)利用乙酸鉀沉淀法沉淀得到供試樣品中海參硫酸軟骨素組分，有效避免各種摻假

摻雜干擾，可準(zhǔn)確的測(cè)定出刺參及其相關(guān)制品中海參多糖含量。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮

（PMP）可以修飾糖環(huán)的還原端，使其具有高度紫外吸收，修飾糖能在反相高效液相色譜柱

上得到很好的分離，并且衍生過(guò)程簡(jiǎn)便快捷，用于單糖組成測(cè)定非常有效。巖藻糖衍生物在

254nm有強(qiáng)吸收，并且在實(shí)驗(yàn)色譜條件下能夠與其他種類(lèi)單糖較好分離，高效液相可以達(dá)到

很好的分析定量效果。

6.6方法主要技術(shù)參數(shù)確定依據(jù)

6.6.1海參硫酸軟骨素分離方法的確定

本方法通過(guò)測(cè)定供試樣品所含有的海參硫酸軟骨素中巖藻糖的含量，經(jīng)質(zhì)量轉(zhuǎn)換系數(shù)K

換算得到海參多糖含量。乙酸鉀可專(zhuān)一沉淀出供試樣品多糖酶解液中的硫酸軟骨素組分，使

其與巖藻聚糖硫酸酯分離。J.E.Scott曾經(jīng)用乙酸鉀沉淀出哺乳動(dòng)物的肝素。衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院生化

教研室的蕭惠連證明類(lèi)肝素也可用乙酸鉀沉淀得到。因肝素或非海參來(lái)源的類(lèi)肝素物質(zhì)中并

不含有巖藻糖，故其沉淀后并不影響海參硫酸軟骨素中巖藻糖的定量。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，乙酸

鉀濃度達(dá)到2.5mol/L時(shí)可保證樣品中海參硫酸軟骨素組分的完全沉淀，而不影響巖藻聚糖硫

酸酯等其它多糖的溶解性。故本標(biāo)準(zhǔn)中分離供試樣品海參硫酸軟骨素組分的條件確定為2.5

mol/L乙酸鉀溶液。

6.6.2水解條件的確定

將鮮參去腸腺，灰嘴，剪成0.5cm×0.5cm的小塊，70℃烘干12h，小型粉碎機(jī)粉碎，

混勻。準(zhǔn)確稱(chēng)取（1.00±0.05g）刺參粉，置于50mL三角瓶中，加入25mL0.1mol/LpH6.0

11

乙酸鈉緩沖液、100mg木瓜蛋白酶、37mg乙二胺四乙酸和22mg半胱氨酸鹽酸鹽，渦旋混

合，60℃恒溫水浴振蕩反應(yīng)24h，將酶解液轉(zhuǎn)移入50mL離心管，于9000rpm離心10min。

棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管中，加入1.6mL10%的氯化十六烷基吡啶溶液，

渦旋混合，室溫放置24h，于9000rpm離心10min。棄去上清液，沉淀溶解于25mL蒸餾

水中，再加入6.13g乙酸鉀，渦旋混合，超聲至乙酸鉀完全溶解，4℃放置24h，于9000rpm

離心10min。沉淀分別用25mL80%乙醇溶液和95%乙醇溶液洗兩次，最后將沉淀于60℃

干燥2h，用適量蒸餾水溶解，用截流分子量為6kDa的真空纖維膜超濾并脫鹽，濃縮，凍干，

得到刺參海參硫酸軟骨素。

準(zhǔn)確稱(chēng)取2mg海參硫酸軟骨素樣品于5mL安培瓶中，分別加入1mL2mol/L三氟乙酸

溶液，1mL2mol/L硫酸溶液，1mL2mol/L三氟乙酸和2mol/L硫酸等體積混合溶液，充氮

封管，分別于110℃水解反應(yīng)4h、6h、8h、10h、12h，14h、16h，70℃下氮?dú)獯蹈桑?/p>

2mL超純水超聲溶解殘余物，用0.3mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)單糖水解液至pH為7.0后轉(zhuǎn)移

入5mL容量瓶，稀釋至刻度，即得刺參硫酸軟骨素水解液。準(zhǔn)確移取海參硫酸軟骨素水解液

400μL于10mL具塞試管中，加入50μL2mmol/L乳糖溶液，450μL0.5mol/L1-苯基-3-甲

基-5-吡唑啉酮（PMP）-甲醇溶液和450μL0.3mol/L氫氧化鈉溶液，渦旋混合均勻后于70℃

水浴反應(yīng)30min，取出冷卻至室溫，加入450μL0.3mol/L鹽酸溶液，渦旋混合。加1mL三

氯甲烷，充分振蕩，靜置分層，吸棄下層三氯甲烷層，按上述方法用三氯甲烷重復(fù)萃取3次。

將上層水相過(guò)0.45μm濾膜，供高效液相色譜分析。

不同酸與不同水解時(shí)間對(duì)刺參海參硫酸軟骨素水解程度及單糖檢測(cè)的影響結(jié)果見(jiàn)圖1，

圖2，圖3。

圖1刺參海參硫酸軟骨素2mol/L三氟乙酸水解作用圖

12

圖2刺參海參硫酸軟骨素2mol/L硫酸水解作用圖

圖3刺參海參硫酸軟骨素2mol/L混酸水解作用圖

不同條件下，單糖水解情況變化很大。氨基葡萄糖（GlcN）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、氨

基半乳糖（GalN）、半乳糖（Gal）和巖藻糖（Fuc）在三種條件下都能水解釋放出來(lái)，而甘露

糖（Man）只能在2mol/L三氟乙酸溶液的作用條件下水解釋放出來(lái)。除半乳糖（Gal）在2mol/L

三氟乙酸溶液作用6h后達(dá)到最大值外，其余單糖都是在2mol/L三氟乙酸溶液作用8h后達(dá)

到最高含量。故確定水解條件為：2mol/L三氟乙酸溶液，110℃，8h。

6.6.3色譜條件的確定

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用水和乙腈做流動(dòng)相不能達(dá)到完全分離，而且峰拖尾、譜帶擴(kuò)展嚴(yán)重，這

是因?yàn)榻?jīng)PMP衍生化后的糖類(lèi)是易離解的弱堿性有機(jī)物，C18柱固定相中的鍵合相表面殘存

的硅羥基與堿的陰離子有親和力，所以會(huì)引起峰形拖尾并干擾分離。當(dāng)加入了磷酸鹽緩沖液

后，鹽效應(yīng)減弱了殘存的硅羥基的干擾作用，抑制峰形拖尾并改善分離效果，使用pH6.9的

磷酸鹽緩沖液，單糖衍生物的峰形和分離效果良好。乙腈比例影響分離效果，乙腈比例降低，

出峰時(shí)間延長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)確定色譜條件為：色譜柱：XDB-C18，5μm，250mm×4.6mm（內(nèi)徑）

或相當(dāng)者；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：20μL；流速：1.0mL/min；流動(dòng)相：

A：0.05mol/LpH6.9磷酸鹽緩沖液磷酸鹽-乙腈（85:15，v/v）溶液，B：0.05mol/LpH6.9磷

13

酸鹽緩沖液磷酸鹽-乙腈（60:40，v/v）溶液；梯度洗脫程序：0→10min→40min→45min，B

0→8%→37%→0。

在實(shí)驗(yàn)確定梯度洗脫條件下，溶劑峰與PMP的出峰時(shí)間均超前于單糖衍生物峰，不會(huì)

對(duì)分析結(jié)果造成影響，同時(shí)，各單糖可以得到有效分離，有效避免其它單糖對(duì)巖藻糖的檢測(cè)

帶來(lái)的干擾，見(jiàn)圖4。

圖4單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物液相色譜圖

6.6.4質(zhì)量轉(zhuǎn)換系數(shù)K的確定

6.6.4.1不同產(chǎn)地海參中海參多糖含量的測(cè)定

選取中國(guó)沿海6個(gè)不同產(chǎn)地的刺參作為研究對(duì)象，每個(gè)產(chǎn)地采樣8個(gè)。將鮮刺參去腸腺，

灰嘴，剪成0.5cm×0.5cm的小塊，70℃烘干12h，小型粉碎機(jī)粉碎，混勻。準(zhǔn)確稱(chēng)?。?.00

±0.05g）刺參粉，置于50mL三角瓶中，加入25mL0.1mol/LpH6.0乙酸鈉緩沖液、100mg

木瓜蛋白酶、37mg乙二胺四乙酸和22mg半胱氨酸鹽酸鹽，渦旋混合，60℃恒溫水浴振蕩

反應(yīng)24h，將酶解液全部轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，于9000rpm離心10min。棄去沉淀，上

清液轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管中，加入1.6mL10%的氯化十六烷基吡啶溶液，渦旋混合，室

溫放置24h，于9000rpm離心10min。棄去上清液，沉淀溶解于25mL蒸餾水中，再加入

75mL無(wú)水乙醇，渦旋混合，4℃放置24h，于9000rpm離心10min。沉淀分別用25mL80%

乙醇溶液和95%乙醇溶液洗兩次，最后將沉淀于60℃干燥2h，蒸餾水溶解，用截流分子量

為6kDa的真空纖維膜超濾并脫鹽，濃縮，凍干，得到海參多糖并稱(chēng)重，詳見(jiàn)表1。

6.6.4.2不同產(chǎn)地刺參海參硫酸軟骨素中巖藻糖含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取（1.00±0.05g）試樣，置于50mL三角瓶中，加入25mL0.1mol/LpH6.0乙酸

鈉緩沖液，加入100mg木瓜蛋白酶、37mg乙二胺四乙酸和22mg半胱氨酸鹽酸鹽，渦旋混合，

60℃恒溫水浴振蕩酶解24h，將酶解液全部轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，于9000rpm離心10min。

14

棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)移至50mL燒杯中，加入6.13g乙酸鉀，渦旋混合，超聲至乙酸鉀完全溶

解，于4℃靜置12h后轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管，于9000rpm離心10min，棄去上清液，沉淀

用5mL蒸餾水超聲溶解后轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度，即得海參硫酸軟骨素

溶液。取1mL海參硫酸軟骨素溶液于5mL安培瓶中，加入1mL4mol/L三氟乙酸溶液，充氮

封管，110℃水解8h后，于70℃氮?dú)獯蹈?，?mL蒸餾水超聲溶解殘余物，用0.3mol/L氫氧

化鈉溶液調(diào)節(jié)水解液pH至6.5~7.5后轉(zhuǎn)移入5mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，即得海參硫

酸軟骨素水解液。準(zhǔn)確移取400μL海參硫酸軟骨素水解液于10mL具塞試管中，加入50μL2

mmol/L乳糖溶液，450μL0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液，450μL0.3mol/L氫

氧化鈉溶液，渦旋混合，70℃水浴反應(yīng)30min，取出冷卻至室溫，加450μL0.3mol/L鹽酸溶

液，渦旋混合。加1mL三氯甲烷，充分振蕩，靜置分層，吸棄下層三氯甲烷層，按上述方法

用三氯甲烷重復(fù)萃取3次。將上層水相過(guò)0.45μm濾膜，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定得到刺參中海

參硫酸軟骨素所含巖藻糖含量，詳見(jiàn)表1。

6.6.4.3質(zhì)量轉(zhuǎn)換系數(shù)K的確定

根據(jù)6.6.3.4.1和6.6.4.2測(cè)定的刺參中海參多糖含量及其海參硫酸軟骨素中巖藻糖的含量計(jì)

算得到質(zhì)量轉(zhuǎn)換系數(shù)K=20.0，詳見(jiàn)表1。

表1質(zhì)量轉(zhuǎn)換系數(shù)K的確定

刺參取海參多糖含量HPLC法測(cè)定海參硫酸軟骨素質(zhì)量轉(zhuǎn)換質(zhì)量轉(zhuǎn)換

序號(hào)平均值

樣地mg/g中巖藻糖含量mg/g系數(shù)K系數(shù)K

1105.9325.39519.64

2113.6655.91419.22

3108.6975.50919.73

4111.3135.71619.47

遼寧19.43

5112.4515.92518.98

盤(pán)錦

6108.8055.63519.31

7110.3945.59019.75

8114.2875.90719.35

198.9324.96519.93

20.00

2101.6655.06320.08

398.6975.01919.66

山東

498.3134.89620.08

煙臺(tái)20.06

597.4514.92719.78

牟平

697.8054.93519.82

798.3944.85120.28

8102.2874.90720.85

15

189.5344.34520.61

287.5284.36820.04

391.9044.73119.43

山東484.5754.21920.05

19.85

蓬萊590.2544.60519.60

688.0334.51519.50

795.2654.77319.96

887.3814.45219.63

1104.3825.22919.96

2105.1375.31319.79

397.6034.78720.39

遼寧4100.7315.17419.47

19.94

大連596.4674.89019.73

698.7564.97319.86

7103.3205.10220.25

8101.9525.08520.05

194.4254.80119.67

291.3914.53220.17

395.7184.76620.08

山東496.4864.83919.94

20.09

威海592.7534.66419.89

695.0524.60520.64

790.9684.47520.33

894.3164.71520.00

173.5323.48521.10

283.9514.11820.39

374.8083.61720.68

浙江475.8603.68920.56

20.61

溫州576.2043.80620.02

683.7953.97521.08

779.6303.86220.62

881.4173.99020.41

6.6.5樣品測(cè)定

6.6.5.1試樣制備

鮮參去腸腺，灰嘴，剪成約0.5cm×0.5cm的小塊，70℃烘干12h，粉碎，過(guò)10目篩，

混勻備用；干刺參，粉碎，過(guò)10目篩，混勻備用；即食刺參，剪成約0.5cm×0.5cm的小塊，

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70℃烘干12h，粉碎，過(guò)10目篩，混勻備用；膠囊，取內(nèi)容物混勻備用；漿液，混勻備用。

6.6.5.2鮮參、干參、即食參、海參粉及參膠囊等固體制品

依照6.6.4.2所述方法對(duì)鮮刺參、干刺參、即食刺參及刺參膠囊等固體制品進(jìn)行前處理。

6.6.5.3海參原漿液、海參口服液、海參酒、海參乳飲料等液體制品

準(zhǔn)確移取25mL試樣，加入25mL0.1mol/L乙酸鈉緩沖液，加入100mg木瓜蛋白酶、73mg

乙二胺四乙酸和44mg半胱氨酸鹽酸鹽，渦旋混合，60℃恒溫水浴振蕩酶解24h，將酶解液轉(zhuǎn)

移至50mL離心管中，于9000rpm離心10min。棄去沉淀，上清液經(jīng)0.45μm水膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移

至100mL燒杯中，加入12.27g乙酸鉀，渦旋混合，超聲至乙酸鉀完全溶解，以下按6.6.4.2自“于

4℃靜置12h……”起依法操作。

6.7方法驗(yàn)證

6.7.1實(shí)驗(yàn)室內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

6.7.1.1線性關(guān)系及精密度

在實(shí)驗(yàn)確定色譜檢測(cè)條件下，以巖藻糖（Fuc）衍生物的峰面積與乳糖（Lac）衍生物的

峰面積之比（Y）對(duì)巖藻糖（Fuc）相應(yīng)濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線

方程：Y=6.032X+0.2084，R2≥0.9984，線性范圍為5.0×10-3mmol/L~6.0mmol/L。

吸取1.8mmol/L巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，衍生后，連續(xù)進(jìn)樣6次，利用內(nèi)標(biāo)校正，巖藻糖衍生

物RSD=2.19％，表明儀器精密度良好，方法精密度符合要求。

6.7.1.2重復(fù)性

六組巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品平行樣（1.2mmol/L）用同樣的儀器和試劑于當(dāng)天進(jìn)行衍生測(cè)定。巖藻

糖-PMP衍生物RSD=3.80%，表明該方法對(duì)巖藻糖衍生物的檢測(cè)重復(fù)性良好。

6.7.1.3檢出限和定量限

方法的檢出限一般是根據(jù)信噪比外推得到，然而由于基質(zhì)干擾等因素的影響，在進(jìn)行實(shí)

際樣品測(cè)定時(shí)，檢出限通常很難實(shí)現(xiàn)。方法的測(cè)定低限是指在保證具有一定可靠性(準(zhǔn)確度和

精密度)的前提下，分析方法能夠測(cè)定出的樣品中目標(biāo)物的最低濃度。經(jīng)測(cè)定得該方法巖藻糖

衍生物的檢出限（R/N=3）和定量限（R/N=10）分別為1.0×10-3mmol/L和4.8×10-3mmol/L。

6.7.1.4穩(wěn)定性

測(cè)定的24h內(nèi)，巖藻糖衍生物的峰面積穩(wěn)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于2.5%。表明

該測(cè)定方法在24h內(nèi)是穩(wěn)定的。

6.7.1.5回收率

選取刺參粉和刺參口服液作為研究對(duì)象以考察低濃度（0.05mmol/L）、中濃度（0.9

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mmol/L）和高濃度（6.0mmol/L）三個(gè)水平的方法回收率。各濃度水平的加標(biāo)回收率和相對(duì)

標(biāo)準(zhǔn)差，詳見(jiàn)表2和表3。

表2刺參粉加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

樣品添加量mmol/L檢測(cè)值mmol/L回收率%平均回收率%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%

1.0.041583.0

2.0.039077.9

3.0.041282.3

0.0578.94.50

4.0.036973.7

5.0.040480.8

6.0.038276.4

1.0.82491.5

2.0.89299.1

3.0.84093.3

0.992.24.31

4.0.79187.9

5.0.82992.1

6.0.80489.3

1.5.2787.8

2.5.0884.6

3.4.7879.7

6.087.04.98

4.5.4190.2

5.5.5191.8

6.5.2787.9

表3刺參口服液加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

樣品添加量mmol/L檢測(cè)值mmol/L回收率%平均回收率%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%

10.042384.5

20.045991.8

30.043486.7

0.0588.94.95

40.041582.9

50.046091.9

60.047895.6

10.83292.4

20.84593.9

30.89699.6

0.994.84.82

40.78186.8

50.87897.5

60.88898.7

15.5692.6

25.7195.2

6.092.34.88

35.5692.6

45.9599.1

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55.3989.8

65.0884.7

6.7.1.6變異系數(shù)

批內(nèi)變異系數(shù)在4.31%~4.98%之間；批間變異系數(shù)在5.22%~6.71%之間，證明該方法

精確性良好。

6.7.1.7市售刺參制品中海參多糖的測(cè)定

對(duì)市售的具有代表性的刺參制品進(jìn)行了方法適用性驗(yàn)證，色譜圖見(jiàn)圖5~圖8，該方法能

夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)刺參制品中海參多糖的準(zhǔn)確定量。

圖5單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物液相色譜圖圖6空白試樣液相色譜圖

圖7刺參口服液液相色譜圖譜圖8刺參粉液相色譜圖譜

6.7.2實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析

國(guó)家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（煙臺(tái)）、青島市

產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所三家單位的液相色譜檢測(cè)技術(shù)人員，按照上述測(cè)定步驟，參照上述色譜

條件，用配有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀，分別進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)各自的驗(yàn)證

試驗(yàn)報(bào)告，四個(gè)實(shí)驗(yàn)室的主要試驗(yàn)結(jié)果歸納如下：

6.7.2.1線性范圍

四家實(shí)驗(yàn)室測(cè)定巖藻糖的濃度線性范圍見(jiàn)表4，從表中可知，呈線性的濃度最低可至本

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方法規(guī)定的5.0×10-3mmol/L，最高能達(dá)到本方法規(guī)定的6.0mmol/L。

表4巖藻糖測(cè)定的濃度線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)

實(shí)驗(yàn)室線性范圍（mmol/L）線性方程相關(guān)系數(shù)相關(guān)顯著性水平濃度點(diǎn)數(shù)

本實(shí)驗(yàn)室5.0×10-3~6.0Y=6.032X+0.210.9984<0.0110

國(guó)家水產(chǎn)品質(zhì)

量監(jiān)督檢驗(yàn)中5.0×10-3~6.0Y=5.595X-0.170.9995<0.0110

心

農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)

品質(zhì)量監(jiān)督檢

5.0×10-3~6.0Y=5.639X-0.280.9986<0.0110

驗(yàn)測(cè)試中心

（煙臺(tái)）

青島市產(chǎn)品質(zhì)

5.0×10-3~6.0Y=5.529X-0.340.9998<0.0110

量監(jiān)督檢驗(yàn)所

6.7.2.2檢出限和定量限

高效液相色譜法一般以信噪比≥3作為檢出限，以信噪比≥10作為定量限。四家實(shí)驗(yàn)室

用本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法測(cè)定時(shí)，巖藻糖檢出限均達(dá)到1.2×10-3mmol/L，定量限均達(dá)到5.0×10-3

mmol/L（見(jiàn)表5），符合本方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限和定量限。

表5巖藻糖的檢出限和定量限

實(shí)驗(yàn)室檢出限（mmol/L）定量限（mmol/L）

本實(shí)驗(yàn)室1.2×10-35.0×10-3

國(guó)家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心1.2×10-35.0×10-3

農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中

1.2×10-35.0×10-3

心（煙臺(tái)）

青島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所1.2×10-35.0×10-3

6.7.2.3方法回收率

用刺參口服液做為本底，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，添加三個(gè)水平的巖藻糖，即0.05mmol/L、

0.9mmol/L和6.0mmol/L，每種試樣每個(gè)添加量測(cè)六份。根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)報(bào)告統(tǒng)計(jì)的加標(biāo)

回收率見(jiàn)表6。從表6可見(jiàn)，用本方法測(cè)定巖藻糖三個(gè)加標(biāo)水平的回收率最低為71.9%，最

高為104.7%，符合檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的制定要求。

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表6巖藻糖加標(biāo)回收率（%）范圍和平均值

加標(biāo)水平（mmol/L）

實(shí)驗(yàn)室

0.050.96.0

本實(shí)驗(yàn)室82.9~95.6(88.9)86.8~99.6(94.8)84.7~99.1(92.3)

國(guó)家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督

71.9~83.6(78.4)