基因工程的基本操作程序（教學(xué)課件）高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

3.2基因工程的基本操作程序1.轉(zhuǎn)化指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過(guò)程，此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。2.轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞受體細(xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞①用______________將________________________直接注入_______中。微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去______，將____________滴加在_________上，使目的基因借助________________進(jìn)入_______。柱頭DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊子房花粉柱頭花粉管精子卵細(xì)胞胚囊（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞--花粉管通道法我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的將Bt基因?qū)朊藁?xì)胞的方法花粉管通道法是我國(guó)科學(xué)家周光宇在1987年獨(dú)創(chuàng)的。將重組DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道內(nèi)，進(jìn)入卵細(xì)胞、合子或早期胚胎細(xì)胞中。此方法直接、簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)，已應(yīng)用于水稻、小麥、棉花、大豆等多種植物中。03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞冠癭瘤農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤等。（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞②農(nóng)桿菌特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染_____________和___________，而對(duì)大多數(shù)____________沒(méi)有侵染能力。雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有______，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將______上的______（____________）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其________________________Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA整合到該細(xì)胞的染色體DNA上將目的基因插入__________________中，通過(guò)農(nóng)桿菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)。③利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞--農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。載體：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（T-DNA)03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞閱讀P81資料卡，完成以下填空表現(xiàn)出新性狀的植株植物組織培養(yǎng)第一次導(dǎo)入第二次導(dǎo)入第一次拼接第二次拼接將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上。(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上。(非人工操作)含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌。Ti質(zhì)粒T—DNA目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片__________________，然后________________，并_____________。受體細(xì)胞為_(kāi)______與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株體細(xì)胞b.可以將_______直接浸沒(méi)在___________________中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得_______，再進(jìn)行________、_________等。受體細(xì)胞為_(kāi)______花序含有農(nóng)桿菌的溶液種子篩選鑒定受精卵（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞--農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞操作程序：（2）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞--顯微注射法構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植（移植到同期發(fā)情的母畜子宮內(nèi)）獲得具有新性狀的動(dòng)物03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞拓展：【其他方法】科學(xué)家也用病毒DNA

與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動(dòng)物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)。如慢病毒載體、腺病毒載體等。（2）將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞選講（3）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞----Ca2+處理法過(guò)程Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞(細(xì)胞膜通透性增強(qiáng))表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞Ca2+的作用：使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（感受態(tài)細(xì)胞）。種類項(xiàng)目植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2＋處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞DNA中→表達(dá)目的基因表達(dá)載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸DNA分子【小結(jié)】03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞成熟mRNA相應(yīng)酶去除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄翻譯真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）多肽鏈前體mRNA蛋白質(zhì)加工如果把一個(gè)真核生物的基因?qū)朐思?xì)胞中表達(dá)，一定會(huì)產(chǎn)生原來(lái)的蛋白質(zhì)嗎？提示：一般不能產(chǎn)生原來(lái)的蛋白質(zhì)原因：①原核生物細(xì)胞里沒(méi)有相應(yīng)的酶來(lái)去除內(nèi)含子；②原核生物沒(méi)有真核的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等）03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞選講將基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞后，如何判斷導(dǎo)入是否成功？即使導(dǎo)入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達(dá)？檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。思考你認(rèn)為可以從哪些方面/水平進(jìn)行檢測(cè)？（1）檢測(cè)目的基因是否已經(jīng)導(dǎo)入（檢測(cè)DNA）（2）檢測(cè)目的基因是否已經(jīng)轉(zhuǎn)錄（檢測(cè)mRNA）（3）檢測(cè)目的基因是否已經(jīng)表達(dá)（檢測(cè)蛋白質(zhì)）（4）檢測(cè)目的基因是否已經(jīng)發(fā)揮作用（檢測(cè)個(gè)體是否獲得某種特性）04目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因檢測(cè)方法：利用PCR對(duì)目的基因擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定檢測(cè)內(nèi)容及方法----分子水平檢測(cè)04目的基因的檢測(cè)與鑒定例：提取棉花細(xì)胞DNA用與Bt基因相關(guān)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)①制作基因探針；②提取受體細(xì)胞全部DNA并用PCR擴(kuò)增，與基因探針置于同一培養(yǎng)液；③高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂湥^察是否出現(xiàn)雜交DNA片段。探針與受體中的DNA分子雜交出現(xiàn)雜交帶：不出現(xiàn)雜交帶：已插入未插入或PCR擴(kuò)增后用DNA分子雜交技術(shù)檢測(cè)DNA分子雜交技術(shù)：

DNA分子雜交技術(shù)原理（基因探針）變性1、提取目的基因的DNA片段用放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記，作為基因探針；2、提取受體細(xì)胞全部DNA并用PCR擴(kuò)增，與基因探針置于同一培養(yǎng)液；3、高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂湥^察是否出現(xiàn)雜交DNA片段。若出現(xiàn)雜交帶，則導(dǎo)入成功。04RT-PCR2.檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測(cè)內(nèi)容及方法----分子水平檢測(cè)04目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)方法：PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或分子雜交技術(shù)檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳過(guò)程:提取生物材料RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA后檢測(cè)是否有目的基因。RNA分子雜交技術(shù)1、制作基因探針；2、探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明轉(zhuǎn)錄出了mRNA。變性探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交分子（可檢測(cè)）原理：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則3.檢測(cè)目的基因是否翻譯——通過(guò)抗原-抗體雜交檢測(cè)從轉(zhuǎn)基因生物提取出來(lái)的蛋白質(zhì)和相應(yīng)的抗體進(jìn)行雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，說(shuō)明目的基因已經(jīng)翻譯。蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白抗原抗體雜交脫分化04目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)目的基因是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀檢測(cè)抗蟲(chóng)棉是否具有抗蟲(chóng)性狀采摘抗蟲(chóng)棉葉片飼喂棉鈴蟲(chóng)觀察棉鈴蟲(chóng)存活情況04目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)內(nèi)容及方法----個(gè)體水平鑒定轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲(chóng)植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲(chóng)（抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)）害蟲(chóng)死亡病毒（菌）接種實(shí)驗(yàn)未染病鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等檢測(cè)內(nèi)容及方法----個(gè)體水平鑒定04目的基因的檢測(cè)與鑒定類型步驟檢測(cè)內(nèi)容方法分子水平檢測(cè)第一步轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因PCR或DNA分子雜交技術(shù)第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAPCR或分子雜交技術(shù)第三步目的基因是否翻譯形成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個(gè)體水平鑒定抗蟲(chóng)或抗病的接種實(shí)驗(yàn)抗性以及抗性程度

抗性檢測(cè)，基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性比較

功能活性。檢測(cè)內(nèi)容及方法總結(jié):03目的基因的檢測(cè)與鑒定04目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定前提核心關(guān)鍵保證利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動(dòng)物)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法(微生物);分子檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個(gè)體水平：是否具有抗性以及抗性強(qiáng)度等。第一步第二步第三步第四步半期復(fù)習(xí)周末完成3-2大書(shū)1.在實(shí)際種植過(guò)程中，棉鈴蟲(chóng)是否對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性？證據(jù)是什么？

科研人員對(duì)長(zhǎng)江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種的抗蟲(chóng)性屬于中抗及高抗水平。2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護(hù)所，靶標(biāo)害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)、紅鈴蟲(chóng)等并未對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲(chóng)棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國(guó)、澳大利亞、印度等國(guó)的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，通過(guò)毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個(gè)高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種。

到社會(huì)中去2.科研工作者在沒(méi)有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對(duì)。他們想出的延緩棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

科研人員想出的延緩棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt抗蟲(chóng)蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個(gè)方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)性和抗蟲(chóng)持久性。包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個(gè)殺蟲(chóng)基因、構(gòu)建組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子、提高殺蟲(chóng)基因的表達(dá)量等。（2）田間策略。這是在種植時(shí)采取的措施，如提供庇護(hù)所、與其他作物（非抗品種）輪作或套種等。（3）國(guó)家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實(shí)施分區(qū)種植管理、加強(qiáng)抗性監(jiān)測(cè)、進(jìn)行嚴(yán)格的安全生評(píng)價(jià)等。

到社會(huì)中去【例5】用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到以下電泳圖譜，其中1號(hào)為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker)，10號(hào)為蒸餾水。PCR時(shí)加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此做出分析不合理的是(

)A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250至500bp之間B.3號(hào)樣品為不含目的基因的載體DNAC.9號(hào)樣品對(duì)應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D.10號(hào)的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有干擾B選講【例6】下圖為轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過(guò)程的示意圖（其中ampr為抗氨芐青霉素基因）。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．④過(guò)程中可利用目的基因作為探針對(duì)植株進(jìn)行篩選B．可同時(shí)選用限制酶PstI、SmaI對(duì)含目的基因的DNA進(jìn)行剪切C．過(guò)程②可采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將含目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D．質(zhì)粒上的抗性基因有利于篩選含目的基因的細(xì)胞和促進(jìn)目的基因的表達(dá)D選講【例7】通過(guò)引物設(shè)計(jì)運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)突變.圖1為基因工程中獲取突變基因的過(guò)程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì)，但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì)，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5'端分別設(shè)計(jì)增加限制性內(nèi)切酶a和限制性內(nèi)切酶b的識(shí)別位點(diǎn).有關(guān)敘述正確的是（

）A.兩種引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的基因的定向插入B.在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等C.第2輪PCR，引物1與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因D.在第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占1/8A選講【例9】實(shí)時(shí)熒光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸檢測(cè)，其原理是∶在PCR復(fù)性過(guò)程中探針和引物一起與模板結(jié)合，探針兩側(cè)分別帶有熒光基團(tuán)和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(tuán)，新鏈延伸過(guò)程中，DNA聚合酶會(huì)破壞探針，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)出熒光。利用RT-PCR進(jìn)行核酸檢測(cè)的相關(guān)過(guò)程如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（

）A．做RT-PCR之前，需要先根據(jù)cDNA的核苷酸序列合成引物和探針B．RNA不能作為PCR擴(kuò)增的模板，故需要將樣本中的RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA后再進(jìn)行擴(kuò)增C．若檢測(cè)結(jié)果有強(qiáng)烈熒光信號(hào)發(fā)出，說(shuō)明被檢測(cè)者沒(méi)有感染病毒D．病毒的檢測(cè)還可以