單甲氧基聚乙二醇丙醛分子量20kDa（M-ALD-20K）質(zhì)量要求與測試方法

1T/CMEASXXXX-XXXX單甲氧基聚乙二醇丙醛,分子量20KDa(M-ALD-20K)質(zhì)量要求與測試本文件規(guī)定了單甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量20KDa（M-ALD-20K）原料的術(shù)語和定義、質(zhì)量要求、試驗(yàn)方法。本文件適用于單甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量20KDa（M-ALD-20K）的質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件?！吨腥A人民共和國藥典》2020版，四部3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1羥基聚乙二醇二乙基丙縮醛（PDA-PEG20K-OH）化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：n=407498單甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量20KDa（M-ALD-20K）由PDA-PEG20K-OH通過端基修飾得到的產(chǎn)物?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如下：n=407~4982號濁度標(biāo)準(zhǔn)液《中華人民共和國藥典》2020版，四部通則0902溶液澄清度檢查法項(xiàng)下規(guī)定的2號濁度標(biāo)準(zhǔn)溶液。4質(zhì)量要求4.1性狀單甲氧基聚乙二醇丙醛應(yīng)為白色至類白色粉末。不含可見異物。4.2結(jié)構(gòu)確認(rèn)核磁氫譜測試結(jié)果與附錄A譜圖對照，主要吸收峰的位置應(yīng)相對應(yīng)。4.3分子量分子量應(yīng)為20,000±2,000Da。4.4酸度2T/CMEASXXXX-XXXXpH值應(yīng)為4.0~7.0。4.5澄清度與2號濁度標(biāo)準(zhǔn)液比較，不得更濃。4.6取代率取代率不得少于95.0%。4.7BHT含量不得過300ppm。4.8目標(biāo)分子量含量、二醇含量目標(biāo)分子量含量不得少于95.0%，二醇含量不得過3.0%。4.9多分散度多分散度不得過1.05。4.10殘留溶劑異丙醇不得過5000ppm，二氯甲烷不得過600ppm，乙酸乙酯不得過5000ppm，甲基叔丁基醚不得過5000ppm，甲苯不得過890ppm。4.11水分水分不得過1.0%。4.12細(xì)菌內(nèi)毒素內(nèi)毒素不得過0.1EU/mg。5試驗(yàn)方法5.1性狀目測判斷樣品外觀。取1-2g樣品置于白紙上，攤開鋪平，置于白色背景下肉眼觀察觀察是否有可見異物。測試結(jié)果應(yīng)符合4.1的要求。5.2結(jié)構(gòu)確證按照《中華人民共和國藥典》四部2020年版0441“核磁共振波譜法”測定，樣品配制使用氘代DMSO配制成20mg/0.5mL濃度進(jìn)行測試，300M掃描。5.3分子量按分子量的測定按照《中華人民共和國藥典》四部2020年版0431“質(zhì)譜法”測定，采用MALDI-TOF法測試，300M掃描。按照附錄A規(guī)定的條件進(jìn)行測試，測試結(jié)果應(yīng)符合4.2的要求。5.4酸度按照《中華人民共和國藥典》四部2020年版0631“pH值測定法”測定，測試結(jié)果應(yīng)符合4.4的要求。5.5澄清度溶液澄清度的測定按照《中華人民共和國藥典》四部2020年版0902“澄清度檢查法”第一法（目視法）檢測，測試結(jié)果應(yīng)符合4.5的要求。5.6取代率3T/CMEASXXXX-XXXX按照《中華人民共和國藥典》四部2020年版0512“高效液相色譜法”規(guī)定，采用電噴霧檢測器（CAD按照附錄B規(guī)定的條件測試，測試結(jié)果應(yīng)符合4.6的要求。5.7BHT含量采用《中華人民共和國藥典》四部2020年版0512“高效液相色譜法”測定，采用UV檢測器，按照附錄C的方法進(jìn)行測試，測試結(jié)果應(yīng)符合4.7的要求。5.8目標(biāo)分子量含量、二醇含量按照《中華人民共和國藥典》四部2020年版0514“分子排阻色譜法”規(guī)定，按照附錄E規(guī)定的條件測試，用面積歸一化法計(jì)算結(jié)果，測試結(jié)果應(yīng)符合4.8的要求。5.9多分散度（PDI）按照《中華人民共和國藥典》四部2020年版0514“分子排阻色譜法”規(guī)定，按照附錄D規(guī)定的條件測試，測試結(jié)果應(yīng)符合4.9的要求。5.10殘留溶劑按照《中華人民共和國藥典》四部2020年版0861“殘留溶劑法”中第二法測定，按照附錄E規(guī)定的條件測試，測試結(jié)果應(yīng)符合4.10的要求。5.11水分按照《中華人民共和國藥典》四部2020年版0832“水分測定法”第一法測定，測試結(jié)果應(yīng)符合4.11的要求。5.12細(xì)菌內(nèi)毒素采用《中華人民共和國藥典》四部2020年版1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”中第二法的濁度法，按照附錄F的方法進(jìn)行測試，測試結(jié)果應(yīng)符合4.12的要求。4T/CMEASXXXX-XXXX（規(guī)范性）分子量的測定A.1原理MALDI-TOF的原理是將樣品分析物分散在小分子基質(zhì)中并形成共結(jié)晶晶體。當(dāng)用脈沖激光照射晶體時(shí)，基質(zhì)強(qiáng)烈吸收激光能量并轉(zhuǎn)化為晶格的激發(fā)能，脈沖激光使樣品表面升溫至或接近基質(zhì)發(fā)生相變或升華，基質(zhì)中的樣品因振動激發(fā)而發(fā)生解析附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，電離的樣品飛過飛行管，根據(jù)飛行時(shí)間不同而被檢測，離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比，進(jìn)而測定樣品的分子量。A.2設(shè)備與試劑儀器：MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀、分析天平、移液槍；試劑：乙腈（HPLC級）、水（HPLC級）、三氟乙酸（HPLC級）、乙醇（HPLC級）、BovineSerumAlbumin(BSA，≥98%)、Apomyoglobin,ProteinSequebcingGrade（APSG）、IFBP（牛胰島素）、CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamicacid）、P14RA.3實(shí)驗(yàn)步驟a）BSA儲備液的配制：取BSA溶于稀釋劑（乙腈：水：TFA=50：50：0.1）溶液中，制成500fmol/μL的溶液；b）APSG儲備液的配制：取APSG溶于稀釋劑（乙腈：水：TFA=50：50：0.1）溶液中，制成1mg/ml的溶液；c）校準(zhǔn)品溶液：用APSG和BSA混合物(V:V=1:1)作為校準(zhǔn)品。d）樣品處理：取樣品用稀釋劑30mg/mL氯化鈉水溶液制成20mg/ml的溶液，取0.5uL樣品和0.5uL基質(zhì)溶液于靶位上混合，晾干；e）激光多點(diǎn)轟擊，信號累加。A.4結(jié)果計(jì)算根據(jù)軟件處理譜圖得出數(shù)均分子量Mn。5T/CMEASXXXX-XXXX（規(guī)范性）取代率的測定B.1原理采用高效液相色譜法測定，電噴霧檢測器（CAD）檢測，采用自身對照法計(jì)算單個(gè)雜質(zhì)的含量，樣品取代率%=100%-單個(gè)雜質(zhì)含量總和。B.2儀器與試劑儀器：液相色譜儀（配備電噴霧檢測器）、分析天平、C18色譜柱（4.6mm×250mm,5μm試劑：甲醇（HPLC級）、水、M-PDA-20K工作標(biāo)準(zhǔn)品B.3溶液的配制a)樣品溶液的配制：取供試品約20mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，b)對照溶液的配制：精密量取樣品溶液1mL，置100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。c)M-PDA-20K貯備液的配制：取M-ALD-20K工作對照品約10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。d)系統(tǒng)適用性的配制：取供試品約20mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加入M-PDA-20K貯備液0.1ml，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。B.4操作條件柱溫40℃,流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL，流動相A為水，B為甲醇。CAD檢測器，檢測器溫度35℃,Filter10.0sec,Range500pA。B.5步驟按照B.4操作條件逐一進(jìn)空白、系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液、對照溶液。B.6結(jié)果計(jì)算a)根據(jù)自身對照法測定單個(gè)雜質(zhì)含量;b)樣品取代率為：樣品取代率%=100%-所有單雜之和6T/CMEASXXXX-XXXX（規(guī)范性）BHT含量的測定C.1原理采用高效液相色譜法測定，紫外（UV）檢測，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算BHT的含量。C.2儀器和試劑儀器：HPLC-UV、分析天平、C18色譜柱(4.6×250mm,5μm)。試劑：乙腈（HPLC）、水（超純水）、三氟乙酸（HPLC）、萘（分析純）、BHT（分析純）。C.3溶液的制備a)萘內(nèi)標(biāo)溶液取20.0mg萘，用乙腈配制成2mg/mL的溶液。b)BHT標(biāo)樣溶液取20.0mgBHT，用乙腈配制成2mg/mL的溶液c)對照溶液取0.1mL萘內(nèi)標(biāo)溶液，0.1mLBHT標(biāo)樣溶液，置同一10mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。d)樣品溶液樣品500.0mg，置10mL容量瓶中，精密加萘內(nèi)標(biāo)溶液100uL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。C.4操作條件柱溫40℃,流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20μL，紫外檢測器，檢測器波長280nm，分析時(shí)間10分鐘。C.5步驟a)按照B.4操作條件逐一進(jìn)空白、對照溶液；b)按照B.4操作條件進(jìn)樣品溶液；C.6結(jié)果計(jì)算C.6.1校正系數(shù);Y=[C(BHT)/C(萘)]/[Area(BHT)/Area(萘)]其中：C(BHT)：對照溶液中BHT濃度（mg/mL）C(萘)：對照溶液中萘濃度（mg/mL）Area(BHT)：對照溶液中BHT峰面積Area(萘)：對照溶液中萘峰面積C.6.2樣品中BHT含量為：C(BHT)=YC(萘)[Area(BHT)/Area(萘)]其中：C(BHT)：樣品溶液中BHT濃度（mg/mL）7T/CMEASXXXX-XXXXC(萘)：樣品溶液中萘濃度（mg/mL）Area(BHT)：樣品溶液中BHT峰面積Area(萘)：樣品溶液萘峰面積8T/CMEASXXXX-XXXX（規(guī)范性）目標(biāo)分子量含量、二醇含量和多分散度的測定D.1原理GPC原理為基于凝膠柱的分子篩效應(yīng)。凝膠柱是由交聯(lián)聚合物制成，具有一定的孔徑大小和分布范圍。分子在柱中的分離是基于其分子量大小和形狀的不同，體積大的高分子無法進(jìn)入凝膠孔，最先從凝膠顆粒間流出，淋出體積（時(shí)間）最小；體積小的進(jìn)入凝膠顆粒，淋出體積（時(shí)間）最大，高聚物按分子量從大到小的順序出峰。通過做出已知分子量的高分子化合物出峰時(shí)間與分子量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，就能分析未知待測物的分子量。D.2設(shè)備與試劑設(shè)備：分析天平、示差檢測器、HPLC泵、柱溫箱、凝膠色譜柱7.8×300mm試劑：甲醇（HPLC級）、一水合溴化鋰、聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)品（分子量范圍為2000Da~40000Da的5-6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品）D.3E溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：取聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)品配制成2.0mg/mL的甲醇溶液。樣品溶液：將樣品配制成2.0mg/mL的甲醇溶液。D.4操作條件柱溫30℃,流動相為10mMLiBr甲醇溶液，等度洗脫，流速0.5mL/min，進(jìn)樣量20μL，示差檢測器溫度30℃,運(yùn)行時(shí)間30min。D.5步驟a）按照C.4操作條件逐一進(jìn)空白、標(biāo)準(zhǔn)曲線，并制備校準(zhǔn)曲線。b）按照C.4操作條件進(jìn)樣樣品溶液。D.6結(jié)果計(jì)算a）按照《中華人民共和國藥典》四部2020年版0514“分子排阻色譜法”中大分子聚合物分子量和分子量分布測定法中的規(guī)定使用GPC處理軟件處理得到多分散度。b）按照《中華人民共和國藥典》四部2020年版0514“分子排阻色譜法”中高分子雜質(zhì)測定法的面積歸一化法計(jì)算目標(biāo)分子量含量及二醇含量。9T/CMEASXXXX-XXXX（規(guī)范性）殘留溶劑的測定E.1原理采用頂空氣相色譜法，F(xiàn)ID檢測器，外標(biāo)法計(jì)算異丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、甲苯的含量。E.2儀器和試劑儀器：氣相色譜儀（配備FID檢測器、頂空進(jìn)樣器）、分析天平、色譜柱：6%氧丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細(xì)管柱為色譜柱；試劑：異丙醇（分析純）、二氯甲烷（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、甲基叔丁基醚（分析純）、甲苯（分析純）和二甲基亞砜（DMSO，GC）。E.3溶液的制備E.3.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制a)二氯甲烷儲備液：取二氯甲烷適量，加DMSO制成每1mL約含6mg的溶液。b)異丙醇儲備液：取異丙醇適量，加DMSO制成每1mL約含50mg的溶液。c)乙酸乙酯儲備液：取乙酸乙酯適量，加DMSO制成每1mL約含50mg的溶液。d)甲基叔丁基醚儲備液：取甲基叔丁基醚適量，加DMSO制成每1mL約含50mg的溶液。甲苯儲備液：取甲苯適量，加DMF制成每1mL約含8.9mg的溶液。e)混合對照品儲備液：精密量取二氯甲烷、異丙醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、甲苯貯備液各1mL置于同一100mL量瓶中，加DMSO稀釋至刻度，搖勻，即得。f)對照品溶液：精密量取混合對照品貯備液10mL置于同一100mL量瓶中，加DMSO稀釋至刻度，搖E.3.2樣品溶液取樣品約100mg，精密稱定，置于10mL量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻。取5ml置于20ml頂空瓶中，加蓋密封。E.4操作條件頂空進(jìn)樣器設(shè)置：加熱溫度85℃,平衡20min，定量環(huán)溫度95℃,傳輸管線溫度105℃,分流比5:1；檢測器溫度260℃。程序升溫程序如下：/E.5步驟a)取空白（DMSO）、對照品溶液各取5mL置頂空瓶中，分別進(jìn)樣；T/CMEASXXXX-XXXXb)按照E.4操作條件進(jìn)樣品溶液；E.6結(jié)果計(jì)算殘留溶劑含量C（ppm）=XX1000000其中：C：樣品中各組分的含量ppm；Ai：樣品溶液中各組分的峰面積；As：對照品溶液中各組分的峰面積；Conc(s)：對照品溶液中各組分的濃度ug/mL;Conc(i)：樣品溶液的濃度ug/mLT/CMEASXXXX-XXXX（規(guī)范性）細(xì)菌內(nèi)毒素的測定F.1原理在適宜的條件下（溫度pH值及無干擾物質(zhì)）細(xì)菌內(nèi)毒素激活鱟試劑中C因子，被激活的凝固酶切斷凝固原蛋白中的精氨酸肽鏈，形成凝固蛋白，在產(chǎn)生凝膠過程中發(fā)生濁度變化，用細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀檢測反應(yīng)混合物的吸光度（OD值）的變化。OD值增加的速度與內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)。據(jù)此，可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。F.2儀器和試劑儀器：細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀、分析天平、旋渦混合儀、移液槍、內(nèi)毒素測定小管。試劑：內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、鱟試劑緩沖液、細(xì)