【生物】基因表達載體的構建課件-2023-2024學年高二下學期生物人教版（2019）選擇性必修3

學習目標基礎目標：說出基因表達載體的組成，分別描述單酶切和雙酶切的不同連接方式，比較總結出雙酶切的優(yōu)點；拓展目標：通過課堂當堂練習，掌握雙酶切中限制酶的選擇原則；挑戰(zhàn)目標：結合例題，對于重組DNA分子的篩選方法有初步認識?；虮磉_載體的構建一

基因表達載體的構建二蘇云金桿菌中的Bt基因普通棉花細胞含Bt基因的棉花細胞能產生Bt抗蟲蛋白的棉花植株轉入植物組織培養(yǎng)技術形成使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；使目的基因能夠在受體細胞中表達和發(fā)揮作用?；蚬こ痰暮诵墓ぷ?目的：獲取Bt基因后能不能直接將它導入受體細胞呢？一

基因表達載體的構建二2組成：DNA復制的起始位點位于基因的上游；RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA。位于基因的下游；終止轉錄便于重組DNA分子的篩選和鑒定。構建基因表達載體時目的基因插入的位置應該在哪里？為什么？拓展延伸誘導型啟動子：當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達。環(huán)境雌激素（EEs）會影響動物和人類的性腺發(fā)育。斑馬魚在EEs的誘導下，會表達出卵黃蛋白原（vtg)。已知綠色熒光蛋白（GFP）基因能使斑馬魚發(fā)光，欲獲得能檢測水中是否含有EEs的轉基因斑馬魚，下列操作合理的是（

）A.將EEs基因的啟動子與GFP基因重組B.將vtg基因的啟動子與GFP基因重組C.將GFP基因的啟動子與GFP基因重組D.將GFP基因的啟動子與vtg基因重組B①

用一定的限制酶切割載體，使其出現(xiàn)一個切口。②

用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③

將切下的Bt基因片段拼接到載體的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子。一

基因表達載體的構建二3構建過程：分析基因表達載體構建的方法任務一（1）構建基因表達載體時，能否用SmaⅠ限制酶切割質粒？為什么？不能因為SmaⅠ切割會破壞質粒的抗生素抗性基因。請結合下圖，回答問題：質粒上的抗性基因是標記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無法進一步篩選。分析基因表達載體構建的方法任務一（2）用同一種限制酶分別切割質粒和外源DNA構建重組DNA的方法，稱為“單酶切法”。如使用限制酶EcoRⅠ分別切割質粒和外源DNA，其結果如下：①黏性末端1與2能被DNA連接酶連接嗎？黏性末端3與4呢？②黏性末端1與3、2與4能被DNA連接酶連接嗎？1與4、2與3呢？分析基因表達載體構建的方法載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質粒自連目的基因與質粒連接目的基因與目的基因連接質粒與質粒連接正向連接

反向連接341242132134問題：使用同種限制酶進行切割，理論上共有幾種連接情況?任務一分析基因表達載體構建的方法任務一請結合下圖，回答問題：分析基因表達載體構建的方法任務一（3）用兩種能產生不同黏性末端的限制酶分別同時切割質粒和外源DNA構建重組DNA的方法，稱為“雙酶切法”。如使用限制酶BamHⅠ和HindⅢ分別同時切割質粒和外源DNA，結果如下：①黏性末端1與2能被DNA連接酶連接嗎？黏性末端3與4呢？②黏性末端1與3、2與4能被DNA連接酶連接嗎？1與4、2與3呢？分析基因表達載體構建的方法任務一（4）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、

外源DNA的優(yōu)點是什么？雙酶切較單酶切有什么好處？①可以防止質粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②防止目的基因與載體的反向連接。(2023·新課標，6)某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點)和質粒進行切割、連接，以構建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構建方案合理且效率最高的是

A.質粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli

DNA

連接酶連接B.質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用

T4DNA連接酶連接C.質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D.質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接√課堂練習限制酶的選擇任務二(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。限制酶的選擇任務二(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則；質粒作為載體必須具備標記基因，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。（2021?遼寧節(jié)選）為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡稱phb2基因),利用大腸桿菌表達該蛋白。圖1為所用載體圖譜示意圖。為使phb2基因(該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列)與載體正確連接，在擴增的phb2基因兩端分別引入

和

兩種不同限制酶的識別序列。課堂練習PvｕⅡ、EcoRⅠ(2023·湖北，4改編)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體(重組質粒)，并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，

不一定含有目的基因C.若用ScaⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Tet(四環(huán)素)的培養(yǎng)基中能形成菌落D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet（四環(huán)素）的培養(yǎng)基中能形成菌落√課堂練習限制酶的選擇任務二(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則；若載體上有兩個及以上的標記基因，則可合理對其中一些標記基因進行酶切破壞，從而達到比1個標記基因更高的篩選成功率，防止只有1個標記基因時出現(xiàn)的“假陽性”(即未成功導入目的基因的載體也能正常表達標記基因，造成無效篩選)。如圖所示的質粒中，Tetr為四環(huán)素抗性基因，LacZ′基因的表達產物能使白色的大腸桿菌菌落變成藍色?，F(xiàn)用EcoRⅠ切割目的基因及質粒載體并進行連接，將得到的重組質粒轉化大腸桿菌，以對目的基因進行保存和擴增。請回答下列問題：(2)標記四環(huán)素白色(3)啟動子終止子目的基因與質粒載體反向連接兩種限制酶(2)LacZ′基因在基因工程中起__________基因的作用。為篩選導入重組質粒的大腸桿菌，應在培養(yǎng)基中加入___________，篩選________(填“藍色”或“白色”)菌落。(3)若需要將這個質粒改造成基因工程表達載體，還需要插入________和________部分。將改造后的表達載體和目的基因經EcoRⅠ酶切連接，并成功導入受體細胞后，發(fā)現(xiàn)仍有部分細胞不能表達出目的蛋白，最可能的原因是_______________________________。為了避免上述情況發(fā)生，最好用________________切割目的基因和表達載體。課堂練習限制酶的選擇任務二(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點時，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點的兩種不同的限制酶，對目的基因所在序列和載體進行剪切，即“雙酶切法”。若要利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構建重組DNA(圖丙)，限制性內切核酸酶的酶切位點分別是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列正確的是()A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體課堂練習限制酶的選擇任務二(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產生相同黏性末端的限制酶。當不適合選擇某種限制酶時，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。課堂小結限制酶的選擇(1)不破壞目的基因原則；(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：若載體上有兩個及以上的標記基因，則可合理對其中一些標記基因進行酶切破壞，提高篩選成功率。(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點時，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點的兩種不同的限制酶，對目的基因所在序列和載