課題 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

課題微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）培養(yǎng)基1、概念人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。2、培養(yǎng)基的類型和用途（1）按物理性質(zhì)劃分：①液體培養(yǎng)基③半固體培養(yǎng)基②固體培養(yǎng)基注：（固體、半固體培養(yǎng)基需添加凝固劑，如瓊脂；兩者的差別是添加量的多、少；液體培養(yǎng)基不加凝固劑。）（用于工業(yè)生產(chǎn)）（微生物保存、分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)）（觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類、鑒定）第2頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基第3頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）按化學(xué)成分劃分：①合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分明確（用化學(xué)成分已知的化合物配制）（微生物的分類、鑒定）②天然培養(yǎng)基含化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)（工業(yè)生產(chǎn)）（3）按用途劃分：①選擇培養(yǎng)基加入某化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要微生物的生長(zhǎng)。（作用：分離微生物、進(jìn)行選擇培養(yǎng)，進(jìn)行選擇培養(yǎng)可以增加所需目的菌的濃度。）第4頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天青霉素抗青霉素基因基因工程，對(duì)導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌的篩選第5頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基:分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素的培養(yǎng)基:分離到酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌②鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物。第6頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天伊紅－美藍(lán)AABBCCDD大腸桿菌在伊紅－美藍(lán)培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)黑色

注：病毒專性活細(xì)胞寄生，目前不能利用人工培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)，需接種在動(dòng)植物組織中才能增值。常用于培養(yǎng)動(dòng)物病毒的是活雞胚。第7頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、培養(yǎng)基的成分不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽。（1）碳源為微生物提供所需碳元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，需要量最大。①概念：②來(lái)源：無(wú)機(jī)碳源：CO2、NaHCO3等有機(jī)碳源：糖類（常用的碳源尤其是葡萄糖）

、脂肪酸、花生粉餅、石油等③作用：構(gòu)成細(xì)胞的物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物；有些是異養(yǎng)微生物的能源；思考：大腸桿菌，硝化細(xì)菌，藍(lán)藻，乳酸菌分別選用哪種碳源？糖類，二氧化碳，二氧化碳，糖類第8頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）氮源①概念：為微生物提供所需氮元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。②來(lái)源：無(wú)機(jī)氮源：N2、NH3、NH4+、NO3-等。有機(jī)氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等③作用：主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮的代謝產(chǎn)物。注：“含C、N”的有機(jī)物常是異養(yǎng)微生物的氮源，也是碳源，即有些化合物作為營(yíng)養(yǎng)要素成分時(shí)并不是單一方面的作用。思考：培養(yǎng)根瘤菌、大腸桿菌、硝化細(xì)菌時(shí)分別需要哪一類氮源？N2，銨鹽或硝酸鹽，NH3第9頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）水（4）無(wú)機(jī)鹽（5）培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條件①概念：微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物。注：并不是所有微生物都需要添加特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有些需要添加，原因是它們自身缺乏合成這些物質(zhì)的酶或合成能力有限。如：培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素。②來(lái)源：維生素、氨基酸、堿基等。③作用：酶、核酸的組成成分。Ⅰ、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（生長(zhǎng)因子）第10頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天Ⅱ、pH值如:培養(yǎng)霉菌需酸性、培養(yǎng)細(xì)菌需中性或微堿性。Ⅲ、氧氣的含量如:培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)需要提供無(wú)氧的條件。4、培養(yǎng)基的配制原則（1）目的要明確（根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的）（2）營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)（注意營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例）（3）pH適宜第11頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天例1：為了檢測(cè)飲用水中是否含有某種細(xì)菌，配制的培養(yǎng)基的配方如下表：

(1)該培養(yǎng)基所含的碳源有________________，其功能是________________。

(2)該培養(yǎng)基所含的氮源是________________，其功能是________________。

(3)該培養(yǎng)基除含碳源、氮源外，還有微生物需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是________________。

(4)該細(xì)菌在同化作用上的代謝類型是________________。

(5)該培養(yǎng)基可用來(lái)鑒別哪種細(xì)菌(

)

A．霉菌 B．大腸桿菌C．酵母菌D．乳酸菌乳糖、蔗糖、蛋白胨構(gòu)成微生物的細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物蛋白胨合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物水、無(wú)機(jī)鹽異養(yǎng)型C第12頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）無(wú)菌技術(shù)1、概念

泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵（目的）:防止外來(lái)雜菌的入侵。2、無(wú)菌技術(shù)包括的四個(gè)方面（措施）（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；（3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近旁進(jìn)行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。第13頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、消毒與滅菌（1）消毒①概念：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。在生物體的一定部位產(chǎn)生一種特殊的生殖細(xì)胞叫孢子。孢子的特點(diǎn)是能直接長(zhǎng)成新個(gè)體。第14頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天②常用方法:a、煮沸消毒法100℃煮沸5-6min，用于一般物品的消毒。b、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min，對(duì)一些不耐高溫的液體，如牛奶的消毒。c、化學(xué)藥劑消毒酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等，如酒精擦拭雙手、氯氣消毒水源等。d、紫外線消毒對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒。只適用于表面滅菌和空氣滅菌。第15頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）滅菌使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。常用方法:a、灼燒滅菌用于金屬用具（接種環(huán)、接種針）、接種過(guò)程中試管口和瓶口的滅菌；b、干熱滅菌160～170℃，1～2h。能耐高溫的需要保持干燥的物品，用于玻璃器皿、金屬用具的滅菌，所用設(shè)備是干熱滅菌箱

；c、高壓蒸汽滅菌121℃，100kPa，15-30分鐘。用于培養(yǎng)基、無(wú)菌水等的滅菌，所用設(shè)備是高壓蒸汽滅菌鍋。第16頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、實(shí)驗(yàn)操作(以培養(yǎng)大腸桿菌為例)（一）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1、計(jì)算2、稱量注意：①牛肉膏比較黏稠，天平稱量時(shí)，放等大的稱量紙，防止牛肉膏粘在托盤上；②牛肉膏和蛋白胨都易吸潮，稱取時(shí)動(dòng)作迅速，稱后要及時(shí)蓋上瓶蓋。第17頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、溶化牛肉膏和稱量紙+水取出稱量紙加熱加蛋白胨和氯化鈉攪拌加瓊脂（不斷攪拌，防止糊底而導(dǎo)致燒杯破裂）補(bǔ)加蒸餾水至100ml思考溶化時(shí)為什么要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱?可保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也能溶于水中,減少誤差。加瓊脂的目的是什么?作為凝固劑第18頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、滅菌①培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌②培養(yǎng)皿：干熱滅菌思考在滅菌前,用牛皮紙、舊報(bào)紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是什么？滅菌時(shí)能避免水蒸汽凝結(jié)時(shí)浸濕棉塞；取出培養(yǎng)基錐形瓶時(shí)也能起到隔絕空氣中雜菌污染的作用。培養(yǎng)皿能否用高壓蒸汽滅菌？不能,因?yàn)榕囵B(yǎng)皿要保持干燥,應(yīng)該用干熱滅菌。在培養(yǎng)微生物時(shí)，由于不同微生物適應(yīng)的PH不同，因此在熔化后必須條件PH，那么是先調(diào)PH還是先滅菌?先調(diào)PH，后滅菌。第19頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、倒平板第20頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時(shí)即可開(kāi)始倒平板。灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。思考培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50℃時(shí)倒平板。用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？第21頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，將平板倒置，既可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染,又可以避免培養(yǎng)基中的水分過(guò)快地?fù)]發(fā)?？諝庵械奈⑸锟赡茉诿笊w與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。平板冷凝后，為什么要將平板倒置？在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？第22頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）純化大腸桿菌1、純化培養(yǎng)技術(shù)：自然環(huán)境中，微生物混在一起生長(zhǎng)，要想純培養(yǎng)，首先要將單個(gè)細(xì)胞與其他細(xì)胞分離開(kāi)，進(jìn)而培養(yǎng)成可見(jiàn)的群體（即菌落）。2、細(xì)菌的菌落①定義：?jiǎn)蝹€(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體。②特征：大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等。③功能：菌種鑒定的重要依據(jù)。第23頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天形態(tài)各異的菌落第24頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、常用接種方法平板劃線法稀釋涂布平板法（主要用于純化培養(yǎng)）（主要用于分離菌種并計(jì)數(shù)）(1)平板劃線法：通過(guò)接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的菌落。接種環(huán)第25頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天第26頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長(zhǎng)情況第27頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作結(jié)束后灼燒：殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境及感染操作者。思考第一步灼燒：消滅接種環(huán)上的微生物避免污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒：為了殺死上一次劃線結(jié)束后，接種環(huán)殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。第28頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。第29頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)稀釋涂布平板法：將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋后，分別涂布到固體培養(yǎng)基表面。稀釋度足夠高時(shí)，能培養(yǎng)出單個(gè)菌落。稀釋涂布平板法操作過(guò)程分兩個(gè)步驟，即系列稀釋操作和涂布平板操作。涂布器第30頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天系列稀釋操作101102103104105106第31頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天涂布平板操作第32頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)涂布器進(jìn)行灼燒滅菌；吸管頭不要接觸任何物體；在火焰周圍迅速操作。接種過(guò)程中如何進(jìn)行無(wú)菌操作？思考

將接種后和未接種（作為對(duì)照組）的培養(yǎng)基均放到370C的恒溫箱中，培養(yǎng)12～24h后進(jìn)行觀察并記錄結(jié)果。第33頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長(zhǎng)？如果有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明了什么？2、在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨(dú)立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？第34頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、菌落的不斷生長(zhǎng)，使菌落不斷增大。無(wú)菌操作未達(dá)到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時(shí)發(fā)生了污染；也可能是在培養(yǎng)的過(guò)程中受到了污染。3、培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同嗎？如果不同，請(qǐng)分析產(chǎn)生差異的原因？4、如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請(qǐng)分析其可能的原因。第35頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基，放入4℃冰箱中保存。以后每3~6個(gè)月，要將菌種轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基。四、課題延伸1、菌種的臨時(shí)保存：2．菌種的長(zhǎng)期保存：3ml甘油瓶中裝入1ml甘油后滅菌，再加入1ml菌液，混勻后放入-20℃冷凍箱保存。第36頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天例2：高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，在接種時(shí)不進(jìn)行嚴(yán)格無(wú)菌操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大的一項(xiàng)是 （）A．將少許干酵母加入到新鮮的葡萄汁中 B．將毛霉菌液接種在切成小塊的鮮豆腐上C．將轉(zhuǎn)基因植物葉片接種到無(wú)菌培養(yǎng)基上 D．將土壤浸出液涂布在無(wú)菌的選擇培養(yǎng)基上C第37頁(yè),共40頁(yè)，2024年2月25日，星期天例3：下列有關(guān)細(xì)菌培養(yǎng)的敘述，正確的是（）A．在瓊脂固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單個(gè)菌落含有多種細(xì)菌B．在培養(yǎng)基