轉(zhuǎn)基因育種與方法課件

作物轉(zhuǎn)基因育種就是根據(jù)育種目標，從供體生物中分離目的基因，經(jīng)DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運載進入受體作物，經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定表達的遺傳工程體，并經(jīng)過田間試驗與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。轉(zhuǎn)基因作物（GMC，geneticallymodifiedcrops）什么是轉(zhuǎn)基因育種?轉(zhuǎn)基因育種與方法與常規(guī)育種技術相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術上較為復雜，要求也很高，但是具有常規(guī)育種所不具備的優(yōu)勢：1.拓寬可利用的基因資源；2.培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗優(yōu)良品種提供了嶄新的育種途徑；3.可以對植物的目標性狀進行定向變異和定向選擇；4.可以大大提高選擇效率，加快育種進程。此外，還可將植物作為生物反應器生產(chǎn)藥物等生物制品。轉(zhuǎn)基因育種與方法TraditionalcrossbreedingRecombinantDNAtechniques轉(zhuǎn)基因育種與方法

一、轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展現(xiàn)狀第一節(jié)作物的轉(zhuǎn)基因技術自從1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來，至今已有120種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。1996年全球大面積種植，并不斷擴大。國際農(nóng)業(yè)生物技術應用服務局（ISAAA）統(tǒng)計結(jié)果轉(zhuǎn)基因育種與方法世界銀行下屬機構(gòu)預測，世界范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)的交易額：2005年達到60億美元；2010年達到200億美元，1500萬農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物種植國家先后有30多個國家批準了3000多例田間試驗，涉及的植物種類有40多種；2000年有13個國家種植商品化轉(zhuǎn)基因植物；2004年有17個國家種植商品化轉(zhuǎn)基因植物。（2004年）美國（59%），阿根廷（20%），加拿大（6%）中國（5%），歐洲5%2004年3月英國批準大面積種植轉(zhuǎn)基因，但要求非常嚴格。2005年德國通過法案，嚴格限制（包括實驗室研究）。轉(zhuǎn)基因育種與方法美國：3900萬公頃加拿大：350萬公頃阿根廷：1350萬公頃中國：210萬公頃轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因作物種類主要為大豆、玉米、棉花和油菜等，以轉(zhuǎn)基因大豆面積最大。根據(jù)美國農(nóng)業(yè)部（USDA）2011年6月30日發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，按種植面積計算，美國種植的88%的玉米、90%的棉花、94%的大豆，都是轉(zhuǎn)基因品種。

目標性狀抗除草劑，抗蟲和抗病毒病轉(zhuǎn)基因育種與方法美國三大轉(zhuǎn)基因作物歷年種植面積轉(zhuǎn)基因育種與方法Firstbiotechplantproduct–Flav’rSav’rtomato轉(zhuǎn)基因育種與方法我國轉(zhuǎn)基因作物研究與利用概況

我國是世界上主要商品化種植轉(zhuǎn)基因作物的國家。自行培育的雙價轉(zhuǎn)基因煙草的抗病蟲性達到60％，產(chǎn)量比對照增加15％，產(chǎn)值增加20％，1992年每畝增收200元，遺憾的是由于市場的原因現(xiàn)已不推廣。

到1999年我國已批準中試的轉(zhuǎn)基因作物有48項：包括水稻、小麥、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、煙草、廣藿香等11種作物；主要目標性狀是抗蟲、抗病、耐鹽、抗凍、耐儲藏和抗衰老等。已批準環(huán)境釋放的有49個品種，涉及水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、甜椒、線辣椒、棉花、楊樹、煙草等10種作物。

轉(zhuǎn)基因育種與方法經(jīng)全國基因工程安全委員會批準商品化生產(chǎn)的作物已有：我國自行研制開發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花（轉(zhuǎn)Bt及Bt+CpTI雙價抗蟲棉）；

2004年種植轉(zhuǎn)基因棉花370萬公頃，占棉花種植面積的50%

美國Monsanto公司開發(fā)的Bt抗蟲棉；延遲成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄；抗黃瓜花葉病毒(CMV)轉(zhuǎn)基因番茄；抗CMV轉(zhuǎn)基因甜椒；轉(zhuǎn)查爾酮合酶（CHS）反義RNA基因矮牽牛；轉(zhuǎn)Bt毒蛋白基因的水稻轉(zhuǎn)ACC反義合成酶的水稻轉(zhuǎn)基因育種與方法由中國農(nóng)科院生物工程中心開發(fā)的Bt棉對棉鈴蟲有顯著的抗性。與對照相比減少農(nóng)藥用量80％，并減少用工150個/hm2，以上兩者可使每公頃節(jié)省1500元，Bt轉(zhuǎn)基因棉種深受棉農(nóng)的歡迎。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因技術簡介轉(zhuǎn)基因研究技術的中心環(huán)節(jié)即為DNA重組技術，其最終目的是將DNA片段轉(zhuǎn)入為一個生物體，從而使該生物體具有表現(xiàn)某種性狀。轉(zhuǎn)基因通過獲取基因、重組基因和表達基因等過程來實現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因打破了物種的界限，使不同種的生物的遺傳物質(zhì)在分子水平上重新組合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，實現(xiàn)對生物體的改造。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因的方法和原理1目的基因制備和載體系統(tǒng)2幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法3定點突變和受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因育種與方法基本步驟1.分離獲得目的基因；2.在體外進行DNA重組，將外源DNA連接到能自我復制又帶有選擇標記的載體上；3.將重組DNA轉(zhuǎn)移入受體細胞；4.篩選出含有目的DNA的受體細胞克?。晦D(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法分離基因克隆到某中間載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒限制酶切/連接克隆到植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌基因槍轉(zhuǎn)化pKS,pBR332,pGEM-TJM109,TOP10…HindIII/EcroI…T4ligasepBI121,pCAM1001…LBA4404,EHA轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法目的基因制備和載體系統(tǒng)目的基因來源：基因組DNA分離、化學合成、PCR擴增、cDNA文庫及DNA文庫中制得。載體：質(zhì)粒、λ噬菌體、柯氏質(zhì)粒、YAC載體等工具酶：限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶等轉(zhuǎn)基因育種與方法(一)目的基因的獲得根據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類：根據(jù)基因表達的產(chǎn)物—蛋白進行基因克??；從基因組DNA或mRNA序列克隆基因。1.根據(jù)基因表達的產(chǎn)物—蛋白進行基因克隆

主要步驟如下：利用這種方法人類首次人工合成了胰島素基因。雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。局限性：兼并密碼子效率低未知基因及產(chǎn)物分離蛋白質(zhì)明確氨基酸序列推導核苷酸序列人工合成轉(zhuǎn)基因育種與方法2.從基因組DNA或mRNA序列克隆基因

(1)同源序列法(HomologyBasedCandidateGeneMethod)根據(jù)基因家族成員所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有保守氨基酸序列的特點克隆基因家族未知成員。氨基酸序列比較設計簡并引物PCR擴增文庫篩選/RACE轉(zhuǎn)基因育種與方法

(2)表達序列標簽EST是指能夠特異性標記某個基因的部分序列，通常包含了該基因足夠的結(jié)構(gòu)信息區(qū)，可以與其它基因相區(qū)分。主要是通過cDNA的途徑獲得。獲得EST的途徑:大規(guī)模cDNA文庫測序各種mRNA水平的分析手段mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄酶cDNA文庫PCR差異顯示抑制消減雜交…ESTRACE/文庫篩選dbESTGenBank轉(zhuǎn)基因育種與方法(3)根據(jù)連鎖圖譜克隆目的基因

圖位克隆技術(Map-basedcloning)轉(zhuǎn)基因育種與方法MarkercM10.8aGenecbpBAC染色體步移亞克隆cDNA文庫篩選互補實驗精細定位染色體步移候選基因轉(zhuǎn)基因育種與方法(4)轉(zhuǎn)座子標簽法

轉(zhuǎn)座子是染色體上一段可復制、移動的DNA片段。當轉(zhuǎn)座子插入到某個功能基因內(nèi)部時，就會引起該基因的失活，并誘導產(chǎn)生突變型；當轉(zhuǎn)座子再次轉(zhuǎn)座或切離這一位點時，失活基因的功能又可得到恢復。目前應用最為廣泛的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是Ac/Ds玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。插入突變體篩選突變DNA文庫，PCR，RACE鑒定性狀遺傳分析轉(zhuǎn)座子DNA探針基因部分DNA探針篩選野生型DNA文庫，PCR，RACE完整目的基因互補實驗轉(zhuǎn)基因育種與方法(5)差異顯示法

在生物個體發(fā)育不同階段，或不同的組織與細胞中或不同環(huán)境下，基因表達差異。即不同基因有序的時空表達方式，叫做基因的差異表達。差異顯示PCR(differentialdisplay-PCR,DD-PCR)是指通過對來源特定組織類型的總mRNA進行PCR擴增、電泳，并找出待測組織和對照之間的特異擴增條帶。葉mRNA根mRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR隨機引物+3’

錨定poly(t)引物PCRPAGE葉根轉(zhuǎn)基因育種與方法(6)cDNA微陣列,cDNA芯片cDNA序列（純樣）機器點樣在支持物,與熒光標記的不同mRNA樣品分別進行雜交,通過激光共聚焦掃描分析不同cDNA序列的雜交信號強度,判斷該cDNA在不同mRNA樣品中的表達豐度.mRNA1mRNA2轉(zhuǎn)基因育種與方法(6)電子克隆insilicocloning

借助于電子計算機，利用公布的核酸序列資料，進行序列的拼接和組裝最終獲得完整基因序列的技術，類似于cDNA文庫的篩選但更加方便和快速。轉(zhuǎn)基因育種與方法PCR反應PCR技術就是在體外通過酶促反應或自發(fā)地擴增一段目的基因的技術。PCR要求反應體系具有以下條件：1、要有與被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補的DNA引物(約20個堿基左右)；2、具有熱穩(wěn)定性的酶如TaqDNA聚合酶；3、4種dNTP；4、作為模板的目的DNA序列。PCR反應可擴增出100～5000bp的目的基因。轉(zhuǎn)基因育種與方法PCR反應過程1、變性，即將模板DNA置于95℃的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開變成單鏈DNA；2、退火，將反應體系的溫度降低至55℃左右，使得一對引物分別與變性后的兩條模板鏈相配對；3、延伸，將反應體系溫度調(diào)整到TaqDNA聚合酶作用的最適溫度72℃，然后以目的基因為模板，合成新的DNA鏈。反復進行約30個循環(huán)左右，即可擴增得到目的DNA序列。轉(zhuǎn)基因育種與方法利用cDNA法由于真核生物的mRNA具有polyA這一結(jié)構(gòu)特點，可以用結(jié)合長度大約為15bp的短鏈多聚DT的纖維素填充的柱子，根據(jù)堿基配對原則，將其吸附，從真核細胞的總RNA中提取出來，再用能打斷A-T氫鍵的緩沖液洗脫。在mRNA群體中，有高豐度的mRNA，拷貝數(shù)多；也有低豐度的mRNA，但種類多，高豐度的mRNA容易合成cDNA。要保證構(gòu)建的cDNA文庫中要含有目的克隆，可利用瓊脂糖凝膠電泳、非變性蔗糖梯度離心和羥甲基蔗糖剃度離心等分級分離不同長度的mRNA，也可以利用cDNA的大小分級分離。轉(zhuǎn)基因育種與方法cDNA鏈的合成得到純化的mRNA后，再利用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶I，緩沖液和4種脫氧核糖核苷三磷酸及短的digo（dT）分子作為引物，合成cDNA。這些cDNA是由該種生物的各種mRNA分子逆轉(zhuǎn)錄得到的，因此是混合物，它們可以通過末端連接或是加入銜接物等其它方法克隆進入質(zhì)粒載體，形成cDNA文庫。然后，采用DNA雜交或免疫分析的方法來篩選目的基因轉(zhuǎn)基因育種與方法（二）目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

目的基因體外重組到適當?shù)囊迅脑斓馁|(zhì)粒中包括保存用中間載體（大腸桿菌寄主）：pBR322、pUC、pBluescriptK、pKS,pGEM-T

繁殖載體（大腸桿菌寄主）：JM109,TOP10

植物轉(zhuǎn)化載體（農(nóng)桿菌寄主）：pBI121,pCAM1001轉(zhuǎn)基因育種與方法質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasmid）是能自我復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們在細菌中以獨立于染色體外的方式存在。每個質(zhì)粒都有一段DNA復制起始位點的序列，它能幫助質(zhì)粒DNA在宿主細胞中復制。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細胞中能達10～100個拷貝；低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細胞中只有1－4個拷貝。質(zhì)粒要成為克隆載體，就必須進行遺傳改造，使之成為一個具有單一的限制性內(nèi)切酶識別位點、多個選擇性標記。轉(zhuǎn)基因育種與方法質(zhì)粒載體pBR3221.大小為4361bp，含有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素這樣兩個抗生素抗性基因2.在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，還具有BamHI、HindⅢ和SalI三個識別位點。3.PstI識別位點在氨芐青霉素抗性基4.pBR322帶有一個復制起點，可以保證質(zhì)粒只在大腸桿菌里進行復制功能。轉(zhuǎn)基因育種與方法pUC19質(zhì)粒長2686bp，帶有pBR322的復制起始位點，一個氨芐青霉素抗性基因和一個大腸桿菌乳糖操縱子β－半乳糖苷酶基因（lacZ’）的調(diào)節(jié)片段，一個調(diào)節(jié)lacZ’基因表達的阻礙蛋白的基因lacI，還有多個單克隆位點。pUC19的篩選將轉(zhuǎn)化細胞涂布到含有氨芐青霉素、IPTG和X－gal的固體培養(yǎng)基上，那些帶有自身環(huán)化質(zhì)粒的細胞由于能夠形成具活性的β－半乳糖苷酶，所以菌落是藍色，如果插入有目的DNA片段，無法形成雜合β－半乳糖苷酶，菌落時白色的。轉(zhuǎn)基因育種與方法λ噬菌體λ噬菌體染色體是長約49kb的雙鏈DNA，該DNA的兩個5’末端都是由12個bp組成的單鏈互補粘性末端，當λ噬菌體DNA進入宿主細胞后，這兩個粘性末端互相結(jié)合，在連接酶作用下封閉成環(huán)在λ噬菌體基因組中位于左邊的基因（A-J）編碼噬菌體頭部和尾部的蛋白質(zhì)，中間的基因（J-N）與重組和生長過程有關，但與裂解生長過程無關，因此對裂解生長過程來說，中間區(qū)的DNA是非必需的，可以被缺失或置換，因此可以在這個區(qū)域克隆外源DNA，右邊的基因涉及λ基因的表達、調(diào)節(jié)、DNA合成晚期功能調(diào)節(jié)以及宿主細胞裂解等。轉(zhuǎn)基因育種與方法λ噬菌體載體分類：插入型載體和置換型載體。插入型載體：具有單一的酶切位點，可供外源DNA的插入。置換型載體：有成對的酶切位點，在兩個酶切位點之間的DNA片段，可被外源DNA片段置換。λ噬菌體載體可以克隆較大DNA片段，最大長度約為24kb，只需將λ噬菌體DNA、尾巴和純化的空的頭，混在一起就可以在體外產(chǎn)生具有侵染性的噬菌體顆粒。轉(zhuǎn)基因育種與方法柯氏質(zhì)粒Cosmid柯氏質(zhì)?？煽寺y帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復制保存，綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)點?？率腺|(zhì)粒上帶有多個單克隆位（RE2），兩個cos位點，DNA復制起始位點和抗生素抗性基因，在兩個cos位點之間還有一個限制性內(nèi)切酶位點（RE1）。轉(zhuǎn)基因育種與方法分離基因克隆到某中間載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒限制酶切/連接克隆到植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌基因槍轉(zhuǎn)化pKS,pBR332,pGEM-TJM109,TOP10…HindIII/EcroI…T4ligasepBI121,pCAM1001…LBA4404,EHA轉(zhuǎn)基因育種與方法幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法概括起來說主要有兩類：第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。基因轉(zhuǎn)移（transgenosis）是借助于物理、化學或生物的手段將外源基因?qū)胧荏w細胞，并檢查其在該細胞內(nèi)表達情況的一種技術，是細胞工程中一項重要而應用廣泛的技術。第二類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。細胞直接攝取外源DNA的過程稱為轉(zhuǎn)化（transformation），如果通過噬菌體的釋放和感染將DNA從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞的過程，稱為轉(zhuǎn)導(transduction)轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因技術動物

TransgenicAnimal1976年Jaenisch等獲得含有SV40DNA的嵌合體小鼠。1980年，Gordon應用顯微注射法首次成功地將重組的外源DNA直接注入小鼠受精卵雄原核中，獲得了攜帶外源基因小鼠。1982，Palmiter將大鼠的生長激素基因用微注射方法導入小鼠的受精卵中獲得巨型小鼠（supermouse），從而在理論上和實踐意義上都將轉(zhuǎn)基因技術提高一步，引起生物學界極大的關注，為基因工程育種提供誘人的前景。早期以提高生長為主，以生產(chǎn)藥用蛋白和可移植的器官轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法談家楨院士（左）、著名老中醫(yī)徐蔚霖教授（右），曾溢滔院士（中），轉(zhuǎn)基因試管牛“滔滔”轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因熊貓狗轉(zhuǎn)基因育種與方法動物轉(zhuǎn)基因的方法1.細胞融合<10－62.微細胞介導的基因轉(zhuǎn)移≤10－63.染色體介導的基因轉(zhuǎn)移<10－6

4.脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移≈2×10－4

5.磷酸鈣沉淀物介導的基因轉(zhuǎn)移10－3－10－7

6.顯微注射DNA≈1－10％7.電脈沖介導的基因轉(zhuǎn)移10～30％8.激光，超聲波介導的基因轉(zhuǎn)移10～50％9.重組RNA病毒感染≈10～100％10.重組DNA病毒感染≈100％轉(zhuǎn)基因育種與方法顯微注射DNA顯微注射DNA一般是用微吸管加DNA溶液在顯微鏡下準確地插入受體細胞核中，并將DNA注射進去的方法，在動物細胞轉(zhuǎn)移中較常使用?，F(xiàn)在，多利用顯微鏡操作器在相差顯微鏡下進行操作。每個細胞的注射量約為10－11ml，熟練的操作者每10分鐘可注射200個細胞。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法顯微操作儀轉(zhuǎn)基因育種與方法顯微操作儀的使用顯微操作儀使用杠桿操作而移動，它能靠杠桿操作把微吸管的先端在顯微鏡的視野中作平面移動。上下的運動靠設在顯微操縱儀支柱上的上下微動，粗動調(diào)節(jié)裝置進行。它與顯微鏡牢固地連接起來。右側(cè)的顯微操作儀是裝在顯微鏡本體上，左側(cè)的顯微操作儀是裝在顯微鏡的機械臺上，隨機械臺的移動而移動，一般在進行操作時，先將平皿放置在顯微注射儀上，移動載物臺，把視野移到細胞處，先用緩慢移

動顯微操縱儀上固定細胞的微吸管，同時使注射器緩慢減壓，吸引目標受精卵并固定之，再用另一側(cè)顯微操縱儀移動微注射針，對準細胞核刺入，導入目的基因，完成顯微注射。轉(zhuǎn)基因育種與方法顯微注射法的優(yōu)點1）轉(zhuǎn)化率高達20％，特別是在沒有合適的DNA載體系統(tǒng)時更有價值；2）對各種受體細胞均適用，從體細胞、淋巴細胞到受精卵；3）對轉(zhuǎn)移物質(zhì)沒有限制，可以是DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒、代謝物或代謝底物以至細胞器、染色體、細胞核；4）可以控制轉(zhuǎn)移的量和轉(zhuǎn)移物的濃度；5）可選擇受體細胞的核的接受位點，可研究物質(zhì)在細胞內(nèi)的運轉(zhuǎn)，區(qū)隔化和依賴區(qū)隔的修飾；6）受體不用特殊的選擇系統(tǒng)；7）要求的樣品量少，2ml樣品足夠作顯微注射；8）實驗細胞與對照細胞可以化同樣的條件下比較。但也有缺點，如設備和技術的要求較高，一次處理細胞數(shù)量不能太多，對細胞有損傷轉(zhuǎn)基因育種與方法2）逆轉(zhuǎn)錄病毒介導法轉(zhuǎn)基因育種與方法3）胚胎干細胞法轉(zhuǎn)基因育種與方法4）精子載體法意大利Lavitrano等1989年首次報道利用精子作為載體獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因育種與方法5）細胞核移植法277次乳腺細胞核移植實驗；獲得29個發(fā)育為8細胞的“胚”；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。轉(zhuǎn)基因育種與方法6）生殖細胞轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)基因育種與方法DNA-磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀反應是將外源DNA轉(zhuǎn)移并整合到細胞株中去的最常用方法，主要用于將基因?qū)雱游锛毎?。由于核酸以磷酸鈣－DNA共沉淀物的形式存在，培養(yǎng)細胞對DNA的吸收會大大提高，細胞通過內(nèi)吞作用，使DNA進入細胞質(zhì)，并轉(zhuǎn)移整合到細胞核內(nèi)的染色體內(nèi)。一般是將DNA與CaCl2溶液混合后，同時加入HEPES緩沖的鹽溶液（HeBS）混合，靜置后形成DNA－磷酸鈣沉淀物，然后用來轉(zhuǎn)染受體細胞。這個過程中，pH值、Ca2＋濃度等都會對轉(zhuǎn)染的效率有所影響。方法簡單，效率較高，可達培養(yǎng)細胞的20％，但缺點是受體細胞有限。轉(zhuǎn)基因育種與方法脂質(zhì)體（liposome）介導的基因轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體是一種內(nèi)部包裝DNA的球狀磷脂雙分層膜結(jié)構(gòu)，能與細胞膜融合將DNA送入細胞的。用脂質(zhì)體介導DNA轉(zhuǎn)染各種不同的類型的真核細胞的方法具有較高的轉(zhuǎn)化效率和可重復性。脂質(zhì)體制備的基本方法是以一定比例稱取磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸，放于氯仿中之后加入待轉(zhuǎn)移的DNA分子制成懸液，經(jīng)超聲化處理后，即形成包含DNA分子的脂質(zhì)體，然后與培養(yǎng)細胞作用2小時左右，就可望實現(xiàn)DNA導入受體細胞。脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染率受脂質(zhì)體的組成及理化性質(zhì)的影響。脂質(zhì)體可以實現(xiàn)體內(nèi)和體外的瞬時穩(wěn)定表達。轉(zhuǎn)基因育種與方法基因槍介導的DNA轉(zhuǎn)移

基因槍法最早是由美國康奈爾大學的Sanford最先提出的。它通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導入到受體細胞內(nèi)，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是通過該法獲得的。轉(zhuǎn)基因育種與方法基因槍轉(zhuǎn)化的原理轉(zhuǎn)基因育種與方法(2)基因槍轟擊法（微彈轟擊技術micro-projectilebombardment)將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，借助高壓動力射入受體細胞或組織，最后整合到植物基因組并得以表達。步驟簡單易行：適合于大多數(shù)細胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當廣泛的應用范圍，已經(jīng)成為植物細胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法決定基因槍使用成功的因素第一因素是動力系統(tǒng)。根據(jù)動力系統(tǒng)，基因槍分為三大類：一類是以火藥爆炸力作為動力加速微彈；第二類是以電弧放電蒸發(fā)浪作為動力；第三類是以高壓氣體作為動力。第二因素是微彈的制備過程。用的微載體有兩類：一是鎢粉，另一個是金粉，直徑一般為0.6－4μm。常用的將DNA包被到微載體上所用的沉淀試劑有亞精胺、氯化鈣、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等。第三個因素是受體材料的選擇。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因植物方法第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。第二類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因育種與方法1.載體介導轉(zhuǎn)移系統(tǒng)最常見的轉(zhuǎn)基因方法。將外源基因重組進入適合的載體系統(tǒng)，通過載體將攜帶的外源基因?qū)胫参锛毎?，整合在核染色體組中并隨核染色體復制和表達。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（tumor-inducingplasmid）或Ri質(zhì)粒(root-indcing

plasmid)介導法是迄今為止植物基因工程中應用最多、機理最清楚、最理想的載體轉(zhuǎn)移方法。轉(zhuǎn)基因育種與方法農(nóng)桿菌與植物細胞相互作用的機制

轉(zhuǎn)基因育種與方法土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)基因育種與方法農(nóng)桿菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti質(zhì)粒

Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),

可以轉(zhuǎn)移進入植物基因組.TumorinducedbyA.tumefaciens轉(zhuǎn)基因育種與方法TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori已知農(nóng)桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間隙中。T-DNA首先在細菌中被加工、剪切、復制，然后轉(zhuǎn)入植物細胞。auxin轉(zhuǎn)基因育種與方法Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為95～156×106D,約有200kb組成。根據(jù)其誘導的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)粒可以被分成四種類型：章魚堿型(octopine)胭脂堿型(nopaline)農(nóng)桿堿型（agropine）農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型轉(zhuǎn)基因育種與方法Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域

（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：

農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關。（2）Vir區(qū)（virulenceregion）

該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。（3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations）

該區(qū)段上存在著與細菌接合轉(zhuǎn)移的有關基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）

該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復制，故稱之為復制起始區(qū)。轉(zhuǎn)基因育種與方法2.外源基因直接導入法（1）化學刺激法細胞融合劑：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）轉(zhuǎn)基因育種與方法(2)基因槍轟擊法

（微彈轟擊技術micro-projectilebombardment)將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，借助高壓動力射入受體細胞或組織，最后整合到植物基因組并得以表達。步驟簡單易行：適合于大多數(shù)細胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當廣泛的應用范圍，已經(jīng)成為植物細胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。單子葉植物轉(zhuǎn)基因育種與方法1.Pericarpsholudbepulledbackandtheimmatureembryos(0.5-1.0mm)areremoved.2.TheimmatureembryosareplacedonacallusinductionmediumhighosmoticmediapreparecallifortransfomationTransformationisperformedbygenegunmethod轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法(3)微注射法

細胞操作：利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式將受體細胞（原生質(zhì)體或生殖細胞）固定，然后將供體DNA或RNA直接注射進入受體細胞。子房注射法或花粉管通道法：具有較大子房或胚囊的植株可在田間進行活體操作。操作簡便、成本低。轉(zhuǎn)基因育種與方法（五）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定1.轉(zhuǎn)化體的篩選外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低目的基因已被整合到核基因組并表達轉(zhuǎn)化細胞更少使用特異性選擇標記基因（selectablemarkergenes）進行標記，有效地選擇出真正轉(zhuǎn)化細胞。常用選擇標記基因：抗生素抗性基因除草劑抗性基因?qū)⑦x擇標記基因與適當啟動子構(gòu)成嵌合基因，克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時進行轉(zhuǎn)化。標記基因在受體細胞表達，使轉(zhuǎn)化細胞具有抵抗相應抗生素或除草劑的能力而存活下來。非轉(zhuǎn)化細胞則被抑制、殺死。轉(zhuǎn)基因育種與方法載體構(gòu)建中常用的選擇標記

如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體同樣是一個重要問題?？茖W家家一直試圖把轉(zhuǎn)化體帶上一個標記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了許多標記基因，并已插入各種轉(zhuǎn)化載體中，作為一種標記基因。轉(zhuǎn)基因育種與方法作為標記基因，必須具備以下四個條件：①編碼一種不存在于正常植物細胞中的酶；②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；③能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達；④檢測容易，并且能定量分析。細菌篩選標記基因：產(chǎn)物給予細胞產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細胞不能生長、發(fā)育與分化。而轉(zhuǎn)化細胞對該標記產(chǎn)生抗性，不影響其生長等，從而將轉(zhuǎn)化細胞選擇出來，例如，Cat（氯霉抗性基因）。植物篩選標記基因：強調(diào)給轉(zhuǎn)化細胞帶上一種標記，起報告和識別作用，故稱報告基因。轉(zhuǎn)基因育種與方法報告基因:

Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因）在植物細胞中所產(chǎn)生的葡糖苷酸酶在檢測上具有以下特點：①在一定條件下與X-G1ucuionicacid（5-bromo-4-chioro-3-indoyl-β-D-glucuronicacid）底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍色沉淀，既可以用分光光度計法測定，又可以直接觀察到植物組織中形成的藍色斑點。②當加入4-甲基傘形酮基和葡萄糖苷酸時生成4-甲基傘形酮，發(fā)熒光（λ=465nm）。因而可以用熒光光譜法測定。由于熒光強度高，本底低，故熒光檢測極為靈敏。③檢測容易、迅速并能定量，只需少量植物組織抽提液即可在短時間內(nèi)測定完畢。④價格便宜。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法GFP（綠色熒光蛋白基因）;

LUC(螢火蟲熒光素酶基因);報告基因:轉(zhuǎn)基因育種與方法表達熒光的轉(zhuǎn)基因魚轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法啟動子的選擇35S,cauliflowermosaicvirus35Spromoter

CaMV35S

isastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.

轉(zhuǎn)基因育種與方法(三〕受體材料的選擇

受體是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應滿足如下條件：1、高效穩(wěn)定的再生能力；2、受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；3、外植體來源方便，如胚和其它器官等；4、對篩選劑敏感；5、轉(zhuǎn)化率高轉(zhuǎn)基因育種與方法常用的受體材料有以下幾大類型:1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點：外植體來源廣，繁殖快，易接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率高。缺點：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因育種與方法2.直接分化再生系統(tǒng)

外植體材料細胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點：周期短、操作簡單，體細胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體恢復細胞壁具有分化再生能力，是應用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點：高效、廣泛地攝取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得基因型一致的克隆細胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點：不易制備、再生困難和變異程度高。轉(zhuǎn)基因育種與方法4.胚狀體再生系統(tǒng)是指具有胚胎性質(zhì)的個體。優(yōu)點：個體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強，嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點：技術含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。5.生殖細胞受體系統(tǒng)以生殖細胞如花粉粒、卵細胞等受體細胞進行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術進行小孢子和卵細胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)化體的鑒定

通過篩選得到的再生植株初步證明標記基因整合進入受體細胞。至于目的基因是否整合到受體核基因組、是否表達，還必須對抗性植株進一步檢測。DNA水平的鑒定

檢測內(nèi)容：是否整合、拷貝數(shù)、整合位置。檢測方法：特異性PCR（以外源基因兩側(cè)序列設計引物）

Southern雜交（外源目的基因序列為探針）轉(zhuǎn)基因育種與方法特異性PCR檢測外源基因整合到受體轉(zhuǎn)基因育種與方法(2)轉(zhuǎn)錄水平的鑒定常用的方法Northern雜交（標記的RNA為探針對總RNA雜交）RT-PCR檢測mRNAcDNAPCR轉(zhuǎn)基因育種與方法（3）翻譯水平的鑒定為檢測外源基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA能否翻譯，還必須進行翻譯或者蛋白質(zhì)水平檢測。主要方法：Western雜交免疫檢測轉(zhuǎn)基因育種與方法（六）轉(zhuǎn)化體的安全性評價和育種利用根據(jù)有關轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理規(guī)定、在可控制的條件下進行安全性評價和大田育種利用研究。通過轉(zhuǎn)基因方法往往難以直接獲得理想的品種（系）原因：外源基因失活、純合致死、花粉致死、其它性狀變化等。因此獲得轉(zhuǎn)化體后，應結(jié)合雜交、回交、自交等常規(guī)轉(zhuǎn)育手段，最終選育綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因品種。轉(zhuǎn)基因育種與方法第三節(jié)轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性轉(zhuǎn)基因育種與方法

直至今天，轉(zhuǎn)基因作物的安全性在全球范圍內(nèi)引起了激烈的爭論。反對者認為轉(zhuǎn)基因作物具有極大的潛在危險，可能會對人類健康和人類生存環(huán)境造成威脅。在歐洲，轉(zhuǎn)基因作物被一些媒體稱之為“惡魔食品”（frankensteinfood）。Frankenstein是英國科幻小說中由一個科學家創(chuàng)造、最終又毀滅了這個科學家的怪物。那么，人類研制與種植轉(zhuǎn)基因作物到底是毀滅自己，還是拯救自己呢？

轉(zhuǎn)基因育種與方法對轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭論，國際上有幾個典型的事件。

Pusztai事件：英國Rowett研究所有位Pusztai博士，他用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英國電視臺發(fā)表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到了破壞。后果：綠色和平組織、地球之友等反生物技術組織把這種土豆說成“殺手”，并策劃了破壞轉(zhuǎn)基因作物試驗地等行動，焚燒了印度的兩塊試驗田，甚至美國加州大學戴維斯分校的非轉(zhuǎn)基因試驗材料也遭破壞，以致研究生畢業(yè)論文都無法如期完成。英國皇家學會組織了同行評審，并于1999年５月發(fā)表評論，指出Pusztai的試驗有六方面的錯誤：不能確定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的化學成分有差異；對食用轉(zhuǎn)基因土豆的大鼠，未補充蛋白質(zhì)以防止饑餓；供試動物數(shù)量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標準食物，缺少統(tǒng)計學意義；試驗設計差；統(tǒng)計方法不當；試驗結(jié)果無一致性等。轉(zhuǎn)基因育種與方法

斑蝶事件：

1999年5月，康奈爾大學的一個研究組在《Nature》雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國大斑蝶，導致44％的幼蟲死亡。這一實驗結(jié)果在科學上沒有說服力：玉米的花粉非常重，擴散不遠，在玉米地以外５米，馬利