電鏡生物技術(shù)方法

電鏡生物技術(shù)方法與細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)E-mail：woodzs@163.com2011.9.23電鏡在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用電子顯微鏡和生物樣品制備技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，不僅揭示了生物細(xì)胞中各種細(xì)胞器的超微平面和立體結(jié)構(gòu)，而且做到了對生物大分子，特別是核酸、蛋白質(zhì)、酶、抗原和受體等在超微結(jié)構(gòu)中的準(zhǔn)確定位、定性和定量。目前，電鏡技術(shù)的應(yīng)用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和微生物學(xué)的范疇，向細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、生理和藥理等學(xué)科擴(kuò)展，成為生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的重要研究手段。

電鏡的缺點(diǎn)觀察范圍小，價(jià)格高；電子束輻射損傷；圖像分析困難；制樣技術(shù)限制；制樣技術(shù)決定了樣品的結(jié)構(gòu)和反差，目前已有的制樣技術(shù)中最佳分辨率也僅在2~3nm，還無法與電鏡的高分辨能力相匹配。樣品制備的目的1.獲得足夠薄的樣品，以利于電子束穿過；2.脫水，減少水分子對真空系統(tǒng)的破壞；3.固定，保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)電鏡生物樣品制備方法分類

TEM樣品制備法超薄切片負(fù)染電鏡細(xì)胞化學(xué)免疫電鏡冷凍技術(shù)X射線微區(qū)分析掃描電鏡制樣技術(shù)SEM樣品制備法一.超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù)(TheTechniquesofUhrathinSection)是透射電鏡生物樣品制備技術(shù)中最重要、最基本、最常用的技術(shù)。操作流程：取材→固定→脫水→浸透→包埋→聚合→修快→半薄切片→染色→定位→超薄切片→染色→觀察超薄切片制作流程1.取材取材是超薄切片制備的第一步，組織結(jié)構(gòu)是否保存完好直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，因此是非常關(guān)鍵的一步。首先將組織剪切成1mm3大小的組織塊，迅速投入3%戊二醛（4℃）中固定。取材過程中要求動作迅速準(zhǔn)確，組織塊不能過大，并盡量在低溫下操作。2.固定

目的:是防止細(xì)胞自溶，穩(wěn)定細(xì)胞成分，較好的保存組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)固定劑的作用:與某些蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子發(fā)生交聯(lián)，迄今尚未發(fā)現(xiàn)能夠?qū)?xì)胞內(nèi)所有活性物質(zhì)起固定作用的全能固定劑，因此目前常采用戊二醛-四氧化鋨雙固定的方法。戊二醛能夠較好的保存糖原、核糖體，對微管及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞膜系統(tǒng)和細(xì)胞基質(zhì)有良好的固定作用；四氧化鋨對蛋白質(zhì)、脂肪、脂蛋白和核蛋白固定效果較好，對樣品有較強(qiáng)的電子染色作用，能增強(qiáng)圖像反差。其他還包括甲醛、多聚甲醛、高錳酸鉀等。常用固定劑戊二醛：能與蛋白質(zhì)分子的氨基和肽鍵連接形成交聯(lián)，能夠較好的保存糖原、核糖體，對微管及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞膜系統(tǒng)和細(xì)胞基質(zhì)有良好的固定作用；特點(diǎn)是滲透快、能良好地保存結(jié)構(gòu)、使用條件較隨意，因而適用范圍廣。商品戊二醛呈淺黃色，pH4.5～5.0，最好在4℃條件下避光保存。當(dāng)戊二醛的顏色變至深黃，pH降至3.5以下時(shí)，說明已失效，不宜再用。為了維持樣品的生理滲透壓，使用戊二醛時(shí)常用緩沖液配制成2％～3％，但對于有特殊要求的樣品，可以在1%～5%之間選擇。建議最好在臨用之前配制新鮮的固定液，以提高效力。戊二醛用戊二醛固定時(shí)，一般以4℃為宜，固定的時(shí)間短可幾分鐘至幾十分鐘，長可達(dá)幾日，甚至數(shù)周，所以常用于樣品的前固定、臨床病理速檢固定和野外作業(yè)固定等。戊二醛除了對保持細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)良好之外，還能保存某些酶的活性。因此經(jīng)戊二醛固定的材料(但固定劑的濃度要低)，也可以用來做組織化學(xué)方面的測定。但如果做形態(tài)組織結(jié)構(gòu)方面的電鏡觀察，那么通常在用戊二醛固定之后，接著再用1—2％的鋨酸重復(fù)固定0.5一2小時(shí)。但在固定之前，一定要把殘留在細(xì)胞內(nèi)的微量戊二醛洗干凈，因?yàn)槲於┖弯~酸會起反應(yīng)，形成黑色沉淀，毀壞樣品的影象。常用固定劑四氧化鋨：又稱鋨酸，對蛋白質(zhì)、脂肪、脂蛋白和核蛋白固定效果較好，對樣品有較強(qiáng)的電子染色作用，能增強(qiáng)圖像反差。滲透速率較醛類要慢得多，所以常用于后固定，并且在固定之前必須把樣品切成小于lmm3的塊狀。四氧化鋨對皮膚和粘膜有刺激作用，操作時(shí)要格外小心，最好使用通風(fēng)櫥，并戴防護(hù)手套。一般配制1％的四氧化鋨固定液1.組織：切成1mm3大小，3%戊二醛4℃固定2小時(shí)；2.細(xì)胞：106以上的細(xì)胞，尖底離心管，1000轉(zhuǎn)/min離心10min，將3%戊二醛沿管壁緩緩加入，防止沖散細(xì)胞團(tuán)，4℃固定2小時(shí)固定良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征

細(xì)胞器

形態(tài)特征細(xì)胞質(zhì)膜三層結(jié)構(gòu)清晰，沒有斷裂，層間隙基本均勻細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)微粒均勻密布，沒有空白區(qū)域粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔呈扁平狀，上面附著核糖核蛋白體顆粒線粒體外周雙層膜和內(nèi)嵴完整，無膨脹和收縮，基質(zhì)致密，無空白區(qū)域細(xì)胞核雙層膜完整，顯示核膜孔，膜間隙均勻，核染色質(zhì)濃密，3.脫水

目的：含水的生物樣品放入電鏡高真空時(shí)，樣品會急驟收縮并產(chǎn)生水蒸氣，嚴(yán)重破壞鏡筒高真空環(huán)境，造成鏡筒污染；電鏡常用的包埋介質(zhì)絕大多數(shù)不溶于水。具體的脫水程序?yàn)椋?/p>

50％乙醇5～10分鐘；

70％乙醇5～10分鐘；

90％乙醇5～10分鐘；

90％乙醇＋90％丙酮（1：1）5～10分鐘；

90％丙酮5～10分鐘；

100％丙酮10～15分鐘；以上步驟均在4℃進(jìn)行100％丙酮10～15分鐘（在室溫進(jìn)行）；4.包埋與聚合

目的：利用包埋劑逐步取代組織細(xì)胞中的脫水劑，并在高溫下聚合成適宜機(jī)械切割的包埋塊。包埋劑能對樣品內(nèi)各種結(jié)構(gòu)進(jìn)行堅(jiān)固的支持，使其能承受切割和耐受電子束的轟擊。常用包埋劑包括樹脂618、Epon812和Spurr，其中Epon812由于滲入組織較快，折光性較好，聚合塊硬度適中等特點(diǎn)應(yīng)用較廣。高溫聚合時(shí)一般采用溫度梯度聚合，35℃，12小時(shí)；45℃，12小時(shí)；60℃，24小時(shí)。包埋板包埋塊5.超薄切片

超薄切片是為電鏡觀察提供極薄的切片樣品的專門技術(shù)，利用超薄切片機(jī)可以將包埋好的樣品切制成70nm厚度的切片，放置于附著薄膜的銅網(wǎng)上。超薄切片刀包括鉆石刀和玻璃刀兩種，前者硬度大耐用但價(jià)格昂貴，后者刀刃較脆不耐用，但價(jià)格低廉。超薄切片機(jī)鉆石刀載網(wǎng)載網(wǎng)是用來支持切片的金屬網(wǎng)，包括銅網(wǎng)、鎳網(wǎng)、銀網(wǎng)及不銹鋼網(wǎng)等，常用規(guī)格為230目的銅網(wǎng)。支持膜支持膜是一種能支持觀察樣品的薄膜，厚度約20nm。性能良好的應(yīng)具備高透明度，在電鏡下無可見結(jié)構(gòu)，與所支持的各種樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)常用支持膜：formar、碳膜、火棉膠基底碳膜、微篩膜和單孔及大孔銅網(wǎng)制模等銅網(wǎng)6.電子染色

由于透射電鏡是根據(jù)電子束照射到樣品后，樣品各部分散射電子的多少來成象的，而生物組織是由碳、氫、氧、氮等輕元素所組成，散射電子能力較弱，未經(jīng)染色的片子電鏡下反差很弱，難以看清微細(xì)結(jié)構(gòu)。目前常采用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染法。染色的目的讓被分析樣品結(jié)合上一些重金屬，以增加其反射電子的能力，使樣品成像的襯度變大，最終獲得高質(zhì)量的電鏡照片。目前常采用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染法。常規(guī)超薄切片技術(shù)流程取材：組織1mm×1mm×1mm前固定：3%戊二醛固定液（1/15MPBSpH7.2-7.4）2小時(shí)4℃清洗：1/15MPBS+0.19M蔗糖緩沖液pH7.2-7.42小時(shí)或過夜4℃后固定：1%OsO4固定液（0.24MPBSpH7.2-7.4）2小時(shí)4℃系列乙醇、丙酮脫水：50、70、90、100%10—15分鐘/次4℃浸透、包埋：Epon812/環(huán)氧樹脂618/水溶性樹脂聚合：35℃、45℃各12小時(shí)；60℃24小時(shí)超薄切片：切片厚度60—70nm重金屬染色：醋酸雙氧鈾5-10分鐘；檸檬酸鉛5分鐘二．負(fù)染技術(shù)負(fù)染又稱陰性反差染色，它是利用高密度的重金屬鹽（如磷鎢酸）包圍生物細(xì)胞，在暗背景中顯示出細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。負(fù)染圖像正好與超薄切片正染色相反，細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈透明淺色，而背底為黑色或灰色。該法操作簡單、快速、省時(shí)、分辨力較高，廣泛應(yīng)用于生物大分子觀察，病毒、細(xì)菌等快速診斷工作中。染色原理制備方法1.制備懸浮液；2.將懸液滴加到帶有支持膜的銅網(wǎng)上；3.染色：0.5-3%磷鎢酸（PTA）（水溶液或磷酸緩沖液）pH6.4—7.0染色1-2分鐘。注意事項(xiàng)1.pH值：略偏酸對病毒負(fù)染的效果較好。2.樣品的純度和濃度：雜質(zhì)多對染色產(chǎn)生干擾；濃度高樣品成堆影響觀察；濃度低尋找樣品困難。3.樣品的均勻性：由于火棉膠膜是疏水膜，樣品在膜上易凝聚成團(tuán)塊，無法觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)。用0.01%BSA稀釋可以加強(qiáng)擴(kuò)散作用。三、冷凍技術(shù)電鏡生物樣品常規(guī)制樣中，各種化學(xué)固定劑對細(xì)胞成分的固定是有選擇性的，易造成某些可溶性成分和部分生物大分子的丟失和重新分布，在很大程度上限制了它在細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)及X射線微區(qū)分析等研究中的應(yīng)用。脫水對樣品的影響常規(guī)制樣與冷凍制樣對比采用低溫固定法使樣品中的水以固態(tài)形式存在或去除。優(yōu)點(diǎn)：快速冷凍固定速度比化學(xué)固定快約1000倍，可以在極短時(shí)間內(nèi)固定組織，將自溶減少到最低；冷凍固定可以較好地保存組織細(xì)胞內(nèi)的抗原和酶的活性，是免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)最佳方法；冷凍固定不會引起細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的改變，使可溶性及游離性元素不發(fā)生丟失和移位，是進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)X-射線微區(qū)分析的最佳方法；常規(guī)制樣方法經(jīng)固定劑和脫水劑處理后樣品收縮，而冷凍技術(shù)能避免細(xì)胞變形滿足形態(tài)學(xué)完美的要求。冷凍技術(shù)主要包括冷凍超薄切片、冷凍蝕刻和冷凍置換技術(shù)。1.冷凍超薄切片技術(shù)1952年Fernandez和Moran首先采用該技術(shù)方法。經(jīng)不斷改進(jìn)和完善，特別是80年代以后國內(nèi)引進(jìn)了該技術(shù)，從而推動了我國的電鏡細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)、X-射線微區(qū)分析等研究工作的進(jìn)展。冷凍超薄切片技術(shù)是用快速冷凍固定取代或減少化學(xué)固定，取消了有機(jī)溶劑脫水、樹脂浸透、包埋等步驟分類1.樣品不經(jīng)過任何處理直接冷凍固定，然后進(jìn)行超薄切片，適用于橡膠、塑料等彈性材料和高分子材料，以及生物材料中進(jìn)行放射自顯影和X射線微區(qū)分析的樣品；2.醛固定和冷凍保護(hù)劑處理，然后進(jìn)行冷凍固定和超薄切片，適用于進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究和細(xì)胞化學(xué)、免疫化學(xué)研究。組織：1×1×1mm3懸液滴固定：2.5%戊二醛固定液或戊二醛﹢多聚甲醛固定液清洗：相應(yīng)的緩沖液冷凍保護(hù)3%甘油、蔗糖、二甲基亞砜、5%PVP快速冷凍固定：KF80或MM80E冷凍超薄切片80～100nm樣品溫度-100～-110℃刀溫度-80～-90℃撈片：飽和蔗糖滴清洗：蒸餾水電鏡細(xì)胞化學(xué)染色電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)染色TEM觀察形態(tài)學(xué)電鏡細(xì)胞化學(xué)免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)重金屬染色冷凍干燥TEM觀察微量元素分析形態(tài)學(xué)冷凍超薄切片技術(shù)2.冷凍蝕刻技術(shù)利用在冷凍條件下樣品變得又脆又硬時(shí)，用刀劈裂樣品，斷裂常發(fā)生在細(xì)胞冷凍后較脆弱的部位，多數(shù)情況下沿細(xì)胞及細(xì)胞器的膜裂開；它既可以在掃描電鏡下觀察三維立體結(jié)構(gòu)，又可以在斷裂后做超薄切片在透射電鏡下觀察二維平面結(jié)構(gòu)，還可以做冷凍斷裂免疫電鏡技術(shù)。操作程序：冷凍斷裂→蝕刻→復(fù)型特點(diǎn)該技術(shù)能得到膜內(nèi)部和細(xì)胞內(nèi)部的三維結(jié)構(gòu)像，是研究生物膜大分子結(jié)構(gòu)、細(xì)胞連接裝置和細(xì)胞骨架等結(jié)構(gòu)的有力工具和手段。它還可以與免疫金標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生冷凍斷裂標(biāo)記技術(shù)，從而能夠顯示細(xì)胞膜表面大分子物質(zhì)，如受體、抗體以及其它化學(xué)基團(tuán)的分布情況。該技術(shù)樣品制備周期短，還具有分辨力高、斷裂面凹凸不平，立體感強(qiáng)、圖象清晰、復(fù)型膜能耐受電子束轟擊和便于長期保存的優(yōu)點(diǎn)。冷凍斷裂冷凍蝕刻在真空中使樣品表面的冰升華，暴露出斷裂面上細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。最佳蝕刻深度30nm，深度不夠，超微結(jié)構(gòu)沒有充分暴露，觀察時(shí)圖像模糊；深度過大，超微結(jié)構(gòu)與基礎(chǔ)高低相差懸殊，因支持力不足容易倒塌。真空，-100℃冷凍復(fù)型采用電子透明的薄膜將樣品表面結(jié)構(gòu)“鑄印”下來，復(fù)制的這層薄膜就相當(dāng)于表面結(jié)構(gòu)的一個“模子”，稱為復(fù)型。特點(diǎn)：制樣簡便，不損傷樣品，圖像立體感強(qiáng)。常采用45°角噴鉑，90°角噴碳制備方法取材：1mm×1mm×3mm固定：1-3%戊二醛固定液2小時(shí)4℃清洗：1/15MPBS(pH7.2-7.4)冷凍保護(hù)：30%甘油-生理鹽水12小時(shí)4℃冷凍固定：樣品放入LN2中冷凍斷裂：高真空1×10–5Torr，樣品升溫到-100—-110℃蝕刻：繼續(xù)升溫到–90—-100℃，樣品表面冰升華碳-鉑復(fù)型膜：噴鉑45°角1次噴碳90°角3-5次腐蝕：次氯酸鈉溶液腐蝕樣品清洗和撈膜：蒸餾水清洗兩次復(fù)型膜并撈膜到400目銅網(wǎng)上心肌細(xì)胞膜上的鈣離子通道脂滴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)3.冷凍置換技術(shù)在低溫條件下，使生物樣品中結(jié)成冰的水分逐步被有機(jī)溶劑取代以達(dá)到脫水的目的。它既可以保存細(xì)胞生活狀態(tài)時(shí)的良好超微結(jié)構(gòu)，又可以滿足免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞X-射線微區(qū)分析的要求。冷凍置換后的樣品可以常規(guī)包埋，也可經(jīng)臨界點(diǎn)干燥處理，噴鍍后作掃描電鏡觀察。置換液：丙酮、OSO4

、戊二醛、甲醇等有機(jī)溶劑置換溫度和時(shí)間：-90℃48小時(shí)-30℃3小時(shí)0℃升溫速率：5℃/小時(shí)四.電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)通過酶的特異細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)顯示酶在細(xì)胞內(nèi)的定位的電鏡細(xì)胞化學(xué)稱電鏡酶細(xì)胞化學(xué)。利用各種化學(xué)和物理方法，使細(xì)胞內(nèi)各種成分在原位形成電子密度大的、可見的最終產(chǎn)物，即金屬沉淀物，然后借助電子顯微鏡進(jìn)行觀察分析。電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可以顯示的酶多屬水解酶、氧化還原酶和轉(zhuǎn)移酶。目前，在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上能夠定位的酶約有80多種?；痉椒ㄈ〔摹M織切成1mm×1mm×2mm固定——2%戊二醛（二甲砷酸鈉緩沖液）pH7.2-7.4/戊二醛+多聚甲醛漂洗組織——0.01M二甲砷酸鈉緩沖液pH7.44℃2小時(shí)或過夜預(yù)切片——振動切片、冷凍切片、恒溫切片切片厚度20—40um預(yù)孵——切片浸入無底物的孵育液中20℃18-24小時(shí)孵育——切片放入孵育液中，在恒溫水浴箱中孵育。孵育時(shí)間和溫度，根據(jù)不同反應(yīng)來確定。漂洗——孵育液的緩沖液洗2—3次，每次5分鐘，再用0.01M二甲砷酸鈉緩沖液洗2—3次，4℃。后固定——1%OsO44℃1小時(shí)脫水、包埋、切片和染色——均按常規(guī)超薄切片法制備樣品。冷凍超薄切片和冷凍置換法也可以進(jìn)行電鏡細(xì)胞化學(xué)。五.免疫電鏡技術(shù)

Singer在1959年首先建立鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)，開創(chuàng)了免疫電鏡技術(shù)。1968年Nakane首先將免疫酶標(biāo)記抗體技術(shù)應(yīng)用于電子顯微鏡。該技術(shù)利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，在超微水平精確定位、定性和半定量。1971年Faulk等將膠體金標(biāo)記抗體技術(shù)應(yīng)用到電鏡中，開始了膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：膠體金顆粒致密，易于辨認(rèn)，定位比酶記標(biāo)反應(yīng)物更精確，同時(shí)還可以做定量分析；根據(jù)金顆粒各種大小不同直徑（3-150nm），可以在同一切片上分別標(biāo)記不同的抗體做雙標(biāo)記或多標(biāo)記。Antigen1stantibody2ndantibodylabel2ndantibodylabel

免疫電鏡膠體金標(biāo)記法可以分為包埋前法和包埋后法。包埋前法是標(biāo)記細(xì)胞表面抗原，樣品先與一抗、二抗結(jié)合，然后再按常規(guī)超薄切片術(shù)進(jìn)行生物樣品的脫水、包埋和切片；包埋后法的操作程序與其正相反，主要標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器上的抗原。膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)還可以用到冷凍超薄切片、冷凍置換、冷凍蝕刻和掃描電鏡樣品制備中。六.X射線微區(qū)分析該技術(shù)屬于分析電鏡技術(shù)。它的特點(diǎn)是在電鏡觀察樣品超微結(jié)構(gòu)的同時(shí)，還可以分析微小區(qū)域內(nèi)的化學(xué)元素。它的原理是電鏡內(nèi)高速細(xì)電子束轟擊樣品表面的微小區(qū)域，使該區(qū)域所含元素發(fā)射一定波長的X射線，通過檢測發(fā)射的X射線波長和強(qiáng)度，便可了解該微小區(qū)域內(nèi)所含元素的種類及含量。樣品制備方法有常規(guī)透射、掃描電鏡樣品制備法；冷凍制樣法包括冷凍超薄切片、冷凍置換及冷凍干燥法。優(yōu)點(diǎn)在電鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察的同時(shí)，能對一定結(jié)構(gòu)內(nèi)的元素進(jìn)行測定，從而獲知超微結(jié)構(gòu)變化與其組成元素變化的關(guān)系?？稍诓黄茐臉悠返慕Y(jié)構(gòu)和保持各種元素原有分布的情況下進(jìn)行分析。分析技術(shù)較為靈敏，可分辨小于1μm區(qū)域內(nèi)質(zhì)量約10克元素，分析面積可小至100-200nm。七.掃描電鏡生物樣品制備

1935年第一臺掃描電子顯微鏡誕生。掃描電鏡的原理是：在真空下電子經(jīng)電子光學(xué)系統(tǒng)形成極細(xì)的電子束,照射并聚焦于樣品表面上產(chǎn)生二次電子信號，二次電子的多少，隨入射樣品表面的凹凸?fàn)顟B(tài)而變化，經(jīng)二次電子檢測器收集二次電子信號，變成顯像管的圖象信號。由于SEM景深長，其圖像層次豐富，立體感強(qiáng)，可觀察生物樣品表面及其斷面的三維立體結(jié)構(gòu)。

冷凍→割斷↑↓取材→清洗→固定→脫水→干燥→粘膠→鍍膜→SEM觀察↓組織導(dǎo)電脫水管道鑄型鍍膜SEM生物樣品制備基本方法組織懸液