第三章 應用微生物學技術課件

現(xiàn)代微生物學技術第三章應用微生物學技術

第三章應用微生物學技術本章內(nèi)容第一節(jié)微生物的接種與培養(yǎng)技術第二節(jié)微生物菌種的篩選與分離技術第三節(jié)微生物的菌種保藏技術第四節(jié)顯微鏡技術第五節(jié)免疫標記技術第三章應用微生物學技術3.1微生物的接種與培養(yǎng)技術一、微生物接種技術

微生物接種就是將一定量的純種微生物轉移到另一新鮮培養(yǎng)基中的過程。這是進行微生物實驗時最重要的基本操作之一，要求在嚴格的無菌條件下進行。接種工具：接種針、接種環(huán)、接種鏟、玻璃涂棒、滴管和移液管等接種方法：試管斜面接種、液體接種、穿刺接種和平板接種等第三章應用微生物學技術二、微生物的培養(yǎng)技術一）固體表面培養(yǎng)

固體表面培養(yǎng)是指微生物菌落生長在固體培養(yǎng)基的表面或里面的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法廣泛用于培養(yǎng)好氣性微生物的菌落形態(tài)觀察、保藏、分離和細胞計數(shù)等。表面培養(yǎng)法培養(yǎng)微生物有下列特點：1、細胞多半是重疊地生長繁殖，因此直接與培養(yǎng)基相接觸的細胞和在此細胞上再生長出的細胞會有所不同。2、從攝取營養(yǎng)的角度來看，上面的細胞就得通過下面的細胞或細胞間隙來獲得營養(yǎng)。3、從供氧方面來說，從上到下逐漸形成缺氧的環(huán)境。第三章應用微生物學技術第三章應用微生物學技術二）液體深層培養(yǎng)

液體深層培養(yǎng)是指用液體培養(yǎng)厭氧性微生物和好氣性微生物的方法，培養(yǎng)厭氧性微生物不需攪動培養(yǎng)基，而培養(yǎng)好氣性微生物則要攪動培養(yǎng)液，攪動方式有振蕩，機械攪拌或通氣攪拌。

第三章應用微生物學技術液體培養(yǎng)法有：1、振蕩培養(yǎng)用于培養(yǎng)細菌、酵母菌及藻類等單細胞微生物，得到均一的細胞懸濁液，培養(yǎng)真菌或放線菌一類菌絲狀細胞，則可得到糊狀的培養(yǎng)物，如果振蕩不充分，培養(yǎng)物的粘度又高，會形成許多小球狀的菌團培養(yǎng)物。設備：箱式恒溫振蕩器、往復式振蕩床（搖床）培養(yǎng)器：試管、三角燒瓶第三章應用微生物學技術HZQ-X100恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱DZ-360超大型振蕩器第三章應用微生物學技術2、通氣培養(yǎng)一般是用玻璃制成的圓筒狀的容器，主要部件有發(fā)酵罐主體、溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)、攪拌系統(tǒng)、空氣過濾系統(tǒng)、空氣流量計以及各種檢測儀表。通氣培養(yǎng)設備具有如下優(yōu)點：1）可以大量生產(chǎn)微生物細胞和代謝產(chǎn)物；2）根據(jù)需要可隨時調(diào)節(jié)氧的供給速率、營養(yǎng)物的流加量、溫度以及pH等；3）可直接觀察發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物以及培養(yǎng)液的變化情況，給研究工作帶來方便。第三章應用微生物學技術第三章應用微生物學技術三）厭氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)是指在無氧的條件下進行微生物的發(fā)酵培養(yǎng)，可采用的原理有兩個方面：一是除去培養(yǎng)容器中的氧氣；二是增強培養(yǎng)基的還原能力。厭氧培養(yǎng)的方法很多，較普遍的有：1、在培養(yǎng)基中加入可溶性的還原性化合物；如葡萄糖、半胱氮酸、甲酸鈉、硫代羥乙酸（HSCH2COOH）和它的鹽等，以增強培養(yǎng)基的還原能力。2、用惰性氣體或還原性氣體完全代替空氣；如以N2、H2、CO2取代空氣。3、利用焦性沒食子酸吸收容器中的氧氣；焦性沒食子酸在堿性條件下可與氧結合生成焦性沒食子素。第三章應用微生物學技術碳酸氫鈉氫硼化鈉第三章應用微生物學技術第三章應用微生物學技術四）同步培養(yǎng)

同步培養(yǎng)主要是為了使培養(yǎng)液中的全部細胞能處于同一生長階段（即同時進行分裂、生長、分裂）而設計的培養(yǎng)方法，即同步培養(yǎng)。獲得同步生長細胞的方法有二種：1、選擇法：選擇法是通過過濾、密度梯度離心、膜吸附和直接選擇等方法，從細胞群落中選擇僅處于某生長階段的細胞來進行培養(yǎng)的方法。第三章應用微生物學技術2、誘導法：誘導法是通過改變細胞群落的環(huán)境條件，如交替的溫度變化、營養(yǎng)變化、使用能夠影響細胞生長周期的主要代謝抑制劑，從而使同一培養(yǎng)容器中的全部細胞都處于同一個生長階段。1）溫度法：短時間低溫處理，特異性地阻止細胞分裂，再恢復最適分裂溫度獲得同步溫度培養(yǎng)物。2）饑餓法：通過除去培養(yǎng)基中的葡萄糖、氨基酸、胸腺嘧啶等營養(yǎng)源進行培養(yǎng)而獲得同步培養(yǎng)物。一般是在少量的營養(yǎng)中使微生物進行對數(shù)增殖，使營養(yǎng)耗盡，然后再轉入適宜的培養(yǎng)條件。第三章應用微生物學技術五）微生物的連續(xù)培養(yǎng)

當微生物以單批培養(yǎng)的方式培養(yǎng)到指數(shù)期的后期時，一方面以一定速度連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)基和通入無菌空氣，并立即攪拌均勻；另一方面，利用溢流的方式，以同樣的流速不斷流出培養(yǎng)物。于是容器內(nèi)的培養(yǎng)物就可達到動態(tài)平衡，其中的微生物可長期保持在指數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和衡定的生長速率上，于是形成了連續(xù)生長。微生物以連續(xù)生長方式進行的培養(yǎng)稱為連續(xù)培養(yǎng)第三章應用微生物學技術第三章應用微生物學技術六）透析培養(yǎng)

透析培養(yǎng)是用透析膜隔開的相鄰兩液相間，一面由透析膜調(diào)節(jié)物質(zhì)轉移，除去了有害物質(zhì)的積累；另一面進行微生物培養(yǎng)的方法，可提高細胞濃度。透析培養(yǎng)的特點：1、延長了發(fā)酵的對數(shù)增殖期，使菌體細胞的密度增加，為提高目的物產(chǎn)量創(chuàng)造了有利條件。2、消除終產(chǎn)物的反饋抑制，使酶活力增強，代謝功能旺盛。

第三章應用微生物學技術3.2微生物菌種的篩選與分離技術

選育菌種可以從以下方面著手：1、根據(jù)新的要求與微生物本身遺傳變化的關系，從原有菌株入手進行各種遺傳改造工作（誘變、基因改造）。2、根據(jù)文獻資料報導的微生物種屬，向國內(nèi)外菌種保藏機構索取同種或同屬的菌株，從中尋求符合要求者。3、根據(jù)所需菌種的特性，嗜好或工藝要求，從特定的生態(tài)環(huán)境中以特定方法重新分離自然菌株。第三章應用微生物學技術一、采樣

自然界中蘊藏著大量的微生物，微生物資源異常豐富。土壤是微生物的大本營，據(jù)報道，1g土壤中約棲息1億個細菌，1000萬個放線菌，100萬個真菌，55萬個藻類。樣品的初步分離：樣品稀釋接種第三章應用微生物學技術二、微生物的培養(yǎng)分離（選擇培養(yǎng)分離）沒有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿足自然界中所有微生物生長的要求，因為不同的微生物都自己特定的營養(yǎng)、生理、生長條件，這就為分離純化微生物的提供了條件。選擇培養(yǎng)分離的方法有：1、控制營養(yǎng)成分營養(yǎng)成主要指碳、氮、無機鹽類及維生素等，各種微生物對這些物質(zhì)的要求是有差異的。分離培養(yǎng)可根據(jù)要分離菌種的特性，改變上述培養(yǎng)基的碳、氮源和無機鹽，從而分離到所需的菌種。如，Ashby無氮培養(yǎng)基（富集固氮菌）甘露醇1%,磷酸二氫鉀0.02%,硫酸鎂0.02%,氯化鈉0.02%,硫酸鈣0.01%,碳酸鈣0.5%第三章應用微生物學技術2、控制培養(yǎng)基酸堿度

各種微生物生長繁殖的適宜酸堿度是不同的。細菌為pH7.0-8.0；放線菌為pH7.5-8.5；酵母菌為pH3.8-6.0；霉菌為pH4.0-5.8；3、控制培養(yǎng)溫度和熱處理

不同種類的微生物所適宜的生長溫度是不同的，利用不同培養(yǎng)溫度可使不同的嗜溫性微生物生長速度不同。

第三章應用微生物學技術4、添加抑制劑添加專一性抑制劑也可達到抑制不需增殖的微生物的目的。如：培養(yǎng)基中加入數(shù)滴10%酚可抑制霉菌和細菌的生長，放線菌仍生長；培養(yǎng)基中添加青霉素、鏈霉素之類抗生素能抑制細菌的生長；培養(yǎng)基中加入膽鹽抑制G+菌和非腸道G－菌的生長；培養(yǎng)基中加入10%乙醇可抑制細菌和霉菌的生長。

5、對供氧控制

通過提供好氧和厭氧條件來選擇目的微生物。第三章應用微生物學技術三、微生物的分離純化

由于微生物在自然界是混雜存在的，進行分離純化培養(yǎng)是微生物學研究的基礎

培養(yǎng)物(culture)在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的微生物群體稱培養(yǎng)物。（如：斜面培養(yǎng)物） 純培養(yǎng)物(pureculture)只有一種微生物的培養(yǎng)物稱為純培養(yǎng)物。由于微生物體體微小，在絕大多數(shù)情況下都是利用群體來研究其屬性，所以純培養(yǎng)是研究微生物的前提條件。第三章應用微生物學技術一）無菌技術

無菌技術在分離、轉接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時防止被其他微生物污染的技術被稱為無菌技術。無菌技術包括：1、微生生物培養(yǎng)器具的滅菌

可采用干熱和濕熱法對玻璃器皿滅菌。

2、接種操作將微生物從一個培養(yǎng)器皿中轉接到另一個培養(yǎng)器皿中，必須在無菌條件下進行，這是微生物學中最常用的基本操作。條件：在無菌室、超凈工作臺、火焰上進行操作3、培養(yǎng)①常用棉花塞塞口，或各種金屬、塑料及硅膠帽塞口；只讓空氣通過，而空氣中的微生物不能通過。②平皿培養(yǎng)；由正反兩平面板互扣而成。 第三章應用微生物學技術二）固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

為了取得所需微生物的純種，必須進行平板分離。平板純種分離的方法常用的有：1、稀釋倒平板法

該法特點：①菌落分布均勻；②獲得純種的機率很大，常用于菌落計數(shù)；③會使一些不耐熱的微生物死去；④位于培養(yǎng)基內(nèi)的好氧微生物生長受到影響。因此還可用下面的方法進行微生物菌種的分離。2、涂布平板法

該法特點：①適于不耐熱和好氧菌的分離；①菌落分布均勻差

第三章應用微生物學技術第三章應用微生物學技術第三章應用微生物學技術3、平板劃線分離

該法特點：

簡單，經(jīng)數(shù)次平板劃線可得純化菌。4、稀釋搖管法

該法特點：適于對氧敏感的厭氧菌的分離。

第三章應用微生物學技術第三章應用微生物學技術三）液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

有些微生物需要用液體培養(yǎng)基分離才能很地分離獲得純培養(yǎng)物，如原生動物、藻類等。液體培養(yǎng)基分離純化法是采用稀釋法。將待分離樣液經(jīng)一系列10倍稀釋取0.1ml各稀釋度液放入液體培養(yǎng)基試管內(nèi)370C培養(yǎng)，48小時觀察試管中菌的生長情況要想獲得純培養(yǎng)物，一稀釋度樣液需平行多個試管，經(jīng)培養(yǎng)后有絕大多數(shù)（95％）試管不生長方可將生長的試管做為純培養(yǎng)物。該法特點：適于不易在固體培養(yǎng)基上形成菌落的微生物分離。第三章應用微生物學技術四）單細胞（單孢子）分離

單細胞（單孢子）分離法是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。常用的儀器有：解剖顯微鏡（可對較大的細胞操作）、顯微操作儀（可對較小的細胞操作）五）組織分離法：

適于高等真菌或高等生物病原菌的分離六）菌絲尖端切割本法適用于長菌絲的霉菌，使用無菌解剖刀切割菌落邊緣的菌絲尖端，并移種到合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)了新菌落。

第三章應用微生物學技術四、微生物菌種的性能鑒定技術為了有效地進行篩選，必須一次或多次從現(xiàn)有菌群中，把多數(shù)無用的微生物淘汰掉，把少量的有用微生物篩選分離出來。菌種的性能鑒定方法的選擇應做到：①快速：要盡快預測或預見出所篩選的目的微生物；②敏捷：迅速處理好眾多的樣品；③經(jīng)濟：通過一次篩選要得到具有廣泛目標的有用微生物。為提高性能鑒定工作效率，常選用平皿特異反應檢出法。第三章應用微生物學技術1、透明圈法

透明圈法是利用能使混濁的底物被分解后形成透明圈的大小，檢出微生物利用或消耗此物質(zhì)的能力。碳酸鈣混在培養(yǎng)基中，可由透明圈的產(chǎn)生和大小確定微生物的產(chǎn)酸能力。含酪素的培養(yǎng)基可由透明圈法選取出蛋白酶產(chǎn)生菌等。第三章應用微生物學技術2、變色圈法

變色圈法是直接用顯色劑或指示劑摻入培養(yǎng)基中，或噴灑已生長菌落的培養(yǎng)基表面，使其形成顯色圈而被檢出。可溶性淀粉的培養(yǎng)基可加碘著色觀察透明圈分辨產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)生菌等。

pH指示劑檢測微生物產(chǎn)物中是否含有機酸或胺（酸或堿）。第三章應用微生物學技術3、生長圈法

生長圈法是利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物為工具菌，若分離的微生物能在一般的培養(yǎng)條件下（缺乏上述營養(yǎng)要求物質(zhì)）生長而合成該營養(yǎng)物，或生長后分泌某種酶能使該營養(yǎng)物的某種前體物質(zhì)轉化形成該物質(zhì)，則能使工具菌生長，形成環(huán)繞具有此性能的菌落的生長圈。這種方法常用于氨基酸、核苷酸、維生素等產(chǎn)生菌株的選取育，使用的工具菌是對應的營養(yǎng)缺陷型菌株。工具菌和[-]培養(yǎng)基點植待分離菌產(chǎn)生工具菌所需的生長因子工具菌在其周圍生長第三章應用微生物學技術4、抑制圈法

抑制圈法是由被分離菌分泌產(chǎn)生某些具有抑制工具菌生長的物質(zhì)，或能分泌某種酶水解無毒物質(zhì)成為對工具菌生長有毒性的物質(zhì)，從而在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑制圈。敏感工具菌涂布于平板將已生長待鑒定菌瓊脂塊貼于平板上（或用無菌濾紙片浸有待鑒定菌培養(yǎng)液貼于平板上）培養(yǎng)1-4天，觀察抑菌圈大小。經(jīng)過初篩的微生物，一旦找出具有發(fā)酵產(chǎn)物潛勢的菌群，應立即按常規(guī)方法進行菌種保藏以備進一步檢測。

第三章應用微生物學技術抑菌圈第三章應用微生物學技術敏感工具菌第三章應用微生物學技術抗生素產(chǎn)生菌的篩選法第三章應用微生物學技術五、微生物的復篩經(jīng)過性能鑒定已初步確定了具有某種能力的菌株，再通過復篩可從中進一步選出那些對工業(yè)化生產(chǎn)有真正價值的微生物。篩選出的微生物經(jīng)過初篩的性能鑒定、再經(jīng)生產(chǎn)菌株的性狀試驗、抗菌試驗以后，要用液體培養(yǎng)基做搖瓶培養(yǎng)、小型發(fā)酵罐培養(yǎng)、以及產(chǎn)物抽提試驗等的復篩。

第三章應用微生物學技術一）微生物的鑒定確定微生物種類至少要確定它們屬于哪個屬、哪個種，這是一個重要環(huán)節(jié)，可把新分離出來的微生物與文獻上的記載對照比較。分類可以讓人們知道該微生物菌株對植物、動物或人是否有致病性。第三章應用微生物學技術二）發(fā)酵培養(yǎng)基成分的選擇當一個新的菌株分離出來以后，還要經(jīng)過發(fā)酵和培養(yǎng)試驗對發(fā)酵條件進行一系列試驗以后，找出最適合的工藝條件，才能把所篩選出的新菌株用于工業(yè)生產(chǎn)。

培養(yǎng)基是微生物生長的基礎，也是目的產(chǎn)物的合成條件，因此培養(yǎng)基的組成對菌株的生產(chǎn)能力有非常重要的影響。通?？晒┻x擇的組分：碳源：葡萄糖、、蔗糖、淀粉、纖維素（特殊）等，加入量1%—5%氮源：黃豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨、酵母浸膏等，加入量0.1%—1%無機鹽：氯化物、硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸二氫鉀等，加入量0.01—0.05%

另外還需要進行最適pH值的的選擇第三章應用微生物學技術三）培養(yǎng)與發(fā)酵

一個新的菌株被分離出來后，經(jīng)過分離純化，然后進行試驗室規(guī)模的培養(yǎng)與發(fā)酵，經(jīng)逐步放大最后進入工業(yè)化生產(chǎn)。其程序是：1、搖瓶培養(yǎng)

常以250或多或500ml錐形瓶在200r.p.m旋轉搖床上培養(yǎng)，主要用于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的篩選。2、玻璃自控發(fā)酵罐

玻璃發(fā)酵罐是從搖床向發(fā)酵罐的過渡階段，一般容量在5—50L，主要用于工藝條件，工藝參數(shù)的選擇和考察，。3、試驗罐培養(yǎng)

是中間工業(yè)試驗階段，一般容量為1—5T。主要目的是放大和驗證搖床試驗結果，積累發(fā)酵工藝規(guī)律和發(fā)酵參數(shù)，工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)打下堅實基礎，第三章應用微生物學技術六、發(fā)酵產(chǎn)物的提取試驗先把菌絲體和發(fā)酵液分離開來，再分別進行提取試驗，菌絲體用水或溶媒抽提。發(fā)酵液可經(jīng)過溶媒抽提、活性碳吸附、樹脂吸附等途徑進行抽提試驗。然后根據(jù)代謝產(chǎn)物的生物活性，抗菌活性等檢定結果，確定提取的途徑和工藝。第三章應用微生物學技術七、發(fā)酵產(chǎn)物的檢測和鑒別1、紫外線吸收光譜的測定2、抗菌譜的測定3、層析分離檢測鑒定4、電泳分離檢測鑒定第三章應用微生物學技術3.3微生物的菌種保藏技術經(jīng)分離純化得到的微生物純培養(yǎng)物是很珍貴的資源，所以要進行微生物菌種的保藏。保藏的目的：①使菌種在一定時間內(nèi)不死亡；②不會被其他微生物污染；③不會因發(fā)生變異而丟失重要的生物學性狀；保藏的條件：使菌株的代謝水平降低，及至完全停止，達到半休眠或完全休眠的狀態(tài)。因此常用干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)等。保藏機構：中國微生物菌種保藏委員會（CCCCM）、中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）、美國典型菌種保藏中心（ATCC）、美國北部地區(qū)研究實驗室（NRRL）、荷蘭霉菌中心保藏所（CBS）、英國國家典型菌種保藏中心（NCTC）、日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）、世界菌保藏聯(lián)合會（WFGC）。第三章應用微生物學技術一、傳代培養(yǎng)（定期移植）保藏法該法包括斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)等。具體方法是將菌種接種于所要求的培養(yǎng)基上，置最適溫度下培養(yǎng)，待得到健壯的菌體后，放在50C左右，濕度70%以下的條件下保藏。在保藏期間，要定期移植，每隔3－6個月移入新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后繼續(xù)保藏。優(yōu)點：1、是操作比較簡單，不需要特殊設備；2、使用方便；能夠隨時接種以便復試和觀察所保存的菌株是否死亡、變異、退化或污染等。缺點：1、保藏時間短；3—6個月。2、菌株經(jīng)過反復傳代，易發(fā)生變異；生理活性、形成子實體的能力等容易減退。適用于：各類微生物菌株的保藏。 第三章應用微生物學技術二、石蠟油封保藏法

此法是在長好菌苔的小斜面試管中，加入滅過菌的礦油（液體石蠟）。這種方法是從定期移植保藏法變通的方法，該法優(yōu)于優(yōu)越于傳代培養(yǎng)保藏。1、將化學純的液體石蠟分裝試管中，在1210C加壓滅菌1小時，再經(jīng)1100C干燥1小時，主要是為了除掉加壓滅菌后侵入的石蠟油中的水分。2、將滅菌的石蠟油注入長好菌苔的小斜面試管中，液面高出斜面1cm。3、封入石蠟油后，試管應直立保存在4—100C冰箱中或放于低溫干燥處。優(yōu)點：1、防止培養(yǎng)基中水分的蒸發(fā)和傳代培養(yǎng)菌種的干燥死亡；2、石蠟油層限制氧的供應而抑制或減弱菌的代謝，這樣便可推遲細胞老化；3、保藏方法簡便，不需特別裝置；4、保藏時間較長；1—5年；缺點：存活率不高，約30—70%適用于：酵母、某些好氣細菌和孢子形成能力特別弱的絲狀菌。第三章應用微生物學技術三、砂土管保藏法

1、無菌砂士的制備：取細砂過40-60目篩，放入玻璃容器中，用10%鹽酸處理2小時，水洗至中性，烘干或曬干。取肥沃園土過100目篩，將細土與砂按1：2混合，分裝入安瓿管內(nèi)約2cm高，加棉塞，1210C30分鐘，滅菌三次。2、菌懸液的制備：將菌苔已長好的斜面，注入無菌水3-5ml，用接種環(huán)輕輕將菌苔刮下，使成菌懸液。3、取1ml菌液加入已冷卻的砂土管內(nèi)混合，然后將砂土管放在裝有干燥劑的真空干燥器中，接通真空泵，抽干（一般4-6小時，砂土成粉散狀），熔封，置5-80C冰箱內(nèi)保藏。優(yōu)點：1、真空干燥，徹底隔絕了水分和空氣；2、簡單方便；3、保藏時間較長；為1-10年缺點：只限于產(chǎn)孢子微生物。適用于：產(chǎn)孢子的微生物，如產(chǎn)芽孢的細菌、放線菌和霉菌等。第三章應用微生物學技術四、冷凍真空干燥保藏法

冷凍真空干燥保藏法是目前比較好的一種菌種保藏方法，是在減壓條件下，將冷凍狀態(tài)的菌體或孢子懸殊液進行真空干燥。操作要點：1、準備安瓿管；1210C滅菌30min。2、準備保護劑；20%脫脂乳粉液，1160C滅菌15-20min。

3、制備菌懸液；在斜面試管加入保護劑2-5ml，制成菌懸液。4、分裝菌懸液：0.2ml/安瓿管。5、冷凍真空干燥；預凍到-450C左右，真空度達到0.01-0.001mmHg即可。

6、熔封；7、檢驗和保藏；高頻電火花槍檢驗真空度，4-100C冰箱內(nèi)保藏。優(yōu)點：1、可較長期保藏；5-15年，不易發(fā)生變異。2、適用于大多數(shù)微生物缺點：設備要求較復雜。適用于：對各類微生物如大多數(shù)細菌、放線菌、霉菌、酵母以及病毒都具有良好的保存效果。除了只產(chǎn)生菌絲體的擔子菌等外。第三章應用微生物學技術五、液態(tài)氮超低溫保藏法液氮保藏法是微生物在-1500C以的低溫下，所有的代謝活動暫時停止。操作要點：1、準備安瓿管；2、制備保護劑；10%二甲亞砜和10%甘油等。3、制備菌懸液；菌種接入到無菌保護劑中，使之形成菌體懸液。4、分裝：0.2ml/安瓿。5、熔封；6、凍結；降10C/min，待降至-400C立即放入液氮中快速成凍結保存。7、保藏；氣相溫度為-1500C，液相為-1960C，為避安瓿管炸裂，氣相保藏。8、恢復培養(yǎng)；置于38-400C水浴中，振蕩，直到全部融化為止

優(yōu)點：1、操作簡單；2、適用于所有微生物；3、菌種可長期保藏；缺點：設備要求復雜，成本高。適用于：

所有微生物，菌絲也可制成懸液，或直接用瓊脂塊保藏。第三章應用微生物學技術3.4顯微鏡技術

1590年荷蘭的Hans父子創(chuàng)造了放大10倍的原始顯微鏡，顯微鏡的發(fā)明距今已有四百余年?，F(xiàn)已成為細胞生物學研究的主要工具。隨著科學技術與光學理論的發(fā)展，具有其它功能的各種顯微鏡，如相差顯微、暗視野顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等也相繼問世。近代已制成顯微分光光度計。這是一種顯微鏡與分光裝置聯(lián)合的儀器，既能觀察細胞內(nèi)的微細結構做到定位，又能定性和定量地測細胞內(nèi)各種組成成分，因此能對細胞和組織內(nèi)的某些化學物質(zhì)進行定量分析。總之，由于顯微鏡技術的發(fā)展使我們對細胞的結構了解得更清楚，尤其是在超微結構（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體體）和分子結構方面，從而使人們對細胞的認識水平又進入了一個新的境界。第三章應用微生物學技術3．4．1光學顯微鏡技術

一、光學顯微鏡的結構原理1、結構光學系統(tǒng)：目鏡、物鏡、聚光鏡顯微鏡結構機械系統(tǒng)：載物臺、鏡筒、轉換器、調(diào)焦裝置、鏡座、鏡臂

光學系統(tǒng)決定了顯微鏡質(zhì)量的好壞。第三章應用微生物學技術二、顯微鏡的基本光學參數(shù)1、分辨力（ResolvingPower）

分辨力指能分辨清楚物點間最小距離的能力。兩物點間的最小距離稱為分辨距離，分辨距離越小，則分辨力越高，

分辨力（最大可分辨兩點間距離）R=0.61λ/N.A.

λ：所用光線的波長

N.A.：數(shù)值孔徑（亦稱鏡口率）

λ 可分辨兩點間距離；N.A.可分辨兩點間距離； 干燥系物鏡的N.A.：10×：為0.25；40×：為0.65。油浸系物鏡的N.A.：0.85-1.40。2、放大率(Magnification）

放大率是指眼睛看到像的大小與原物大小的比值。

M總=M目×M物

第三章應用微生物學技術3、焦點深度（DepthFocus）

焦點深度是指調(diào)焦看清楚標本的某一物點時，不僅這一點看清楚，此點的上下兩側也能看清楚的厚度。

d=kn/M總

N.A.(mm) k:為常數(shù)約0.24mmn:為介質(zhì)折射率若:M=40×N.A.=0.25d=24μmM=700×N.A.=1.25d=0.24μm

焦點深度深（大）可保證觀察到被檢物體的全層，焦點深度淺（小）必須運用調(diào)焦裝置從上到下觀察物體的全層來彌補焦點深度淺的缺點。4、工作距離（WorkingDistance）

工作距離是指從物鏡第一個鏡片表面到蓋玻片表面或標本表面之間的距離。

N.A. W.D. N.A.為0.40時W.D.為0.5mmN.A.為1.40時W.D.為0.1mm第三章應用微生物學技術第三章應用微生物學技術3.4.2光學顯微鏡的種類一、明視場顯微鏡明視場鏡檢技術是以標本的顏色及其透射率為基礎的顯微觀察，觀察的標本都需染色處理才能有好的效果，是最常見的普通光學顯微鏡。第三章應用微生物學技術二、暗視場顯微鏡1、成像原理

1）使光線不直接通過聚光鏡進入，而只能從聚光鏡的周緣斜射到標本上，標本經(jīng)斜射照明后，其反射光和衍射光進入物鏡形成圖像。結果顯微鏡視野黑暗，標本發(fā)亮，反差增大，可清楚看到樣品。

2）在暗處當光線斜射到標本上，由于光的反射和衍射，使標本似乎增大體積而可辨認。2、結構1）光源

要求強光源，為500W直射光或弧光，將顯微鏡放在暗室中進行觀察。

2）聚光鏡3）物鏡4）目鏡3、應用①觀察無色透明的活細胞，以及活細胞的運動狀態(tài)。

②暗視場顯微鏡最適于觀察微粒，可看到直徑為0.002-0.004μm（普通顯微鏡僅能分辨0.2μm)以上的微粒。

第三章應用微生物學技術第三章應用微生物學技術三、熒光顯微鏡1、原理物質(zhì)在吸收短波長光波后可轉換而發(fā)射出較長的光波，稱為熒光。

熒光顯微鏡是以紫外線為光源來照射被檢物體使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察其形狀及其所在位置。第三章應用微生物學技術產(chǎn)生熒光現(xiàn)象有兩種：自發(fā)熒光是細胞內(nèi)含有的某些天然物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后發(fā)出熒光。如，植物細胞內(nèi)葉綠體的葉綠素能發(fā)出血紅色的熒光，木質(zhì)部的木質(zhì)素激發(fā)后產(chǎn)生黃色熒光。誘發(fā)熒光是細胞經(jīng)熒光染色劑染色后，再經(jīng)紫外線照射產(chǎn)生的熒光。常用的熒光色素有：金胺、酸性品紅、甲基綠、中性紅、剛果紅、硫代黃色素、櫻草素、吖啶橙、吖啶黃等。如，標本經(jīng)固定后，用吖啶橙染色，可使細胞內(nèi)RNA發(fā)出紅色熒光，DNA發(fā)出綠色熒光。在DNA電泳中常用溴乙啶（EB）為染色劑，EB—DNA復合物在紫外檢測儀下發(fā)出橙紅色的熒光。第三章應用微生物學技術2、結構其結構與光學顯微鏡一樣，但其特殊的結構主要有：1）光源利用紫外線作為光源，必須使用高壓汞燈。2）激發(fā)熒光濾光片（藍色）只充許紫外光（275—400nm）或藍紫光（325—500nm）通過。3）物鏡與普通光學顯微鏡一樣。4）屏障濾光片（黃色）只充許激發(fā)產(chǎn)生的熒光（410—650nm）通過，而不讓紫外光和藍紫光通過，。5）目鏡與普通光學顯微鏡一樣。第三章應用微生物學技術第三章應用微生物學技術注意事項：①高壓汞燈打開后，需經(jīng)10—15min才達到最大亮度。②制片要薄，太厚不易觀察，深度的熒光物質(zhì)不能被激發(fā)。③油浸用的油必須使用無熒光的液體石蠟或檀香木油等，香柏油本身產(chǎn)熒光。④一標區(qū)不宜連續(xù)觀察3分鐘以上，以免熒光猝滅。⑤鏡檢時，使用暗視野顯微鏡，讓視野保持黑暗，可使熒光現(xiàn)象更加明顯。⑥標本染色后，應當天觀察，否則會褪色，或采用攝影記錄保存。3、應用用以觀察生物標本的固有熒光、染色劑熒光和免疫學熒光。第三章應用微生物學技術四、光學顯微鏡樣品標本的制作技術1、細胞染色技術簡單染色法革蘭氏染色法正染色抗酸性染色法鑒別染色法芽孢染色法鞭毛染色法熒光染色法負染色：莢膜染色法等2、活體觀察技術1）壓滴法2）懸滴法3）插片法第三章應用微生物學技術3.4.3電子顯微鏡技術自1932年德國發(fā)明電子顯微鏡以來，發(fā)現(xiàn)了許多光學顯微鏡下看不到的新現(xiàn)象、新事實，開拓了超微世界，使得醫(yī)學、生物學步入了分子生物學領域。目前電鏡不僅可以觀察一般細胞的超微結構，而且還可以探討其分子結構；從一般超大型微細結構的定性觀察，走向定量分析；從透射電鏡超薄切片的平面觀察，進入掃描電鏡三維空間的立體表面觀察、以及X線顯微分析儀對微區(qū)進行的元素分析，這一些都由不同功能電子顯微鏡來完成。第三章應用微生物學技術一、透射電子顯微鏡一）原理1、利用電子束代替光束作為照明源并穿透樣品。2、電子束的形成。電壓V；電子流υ；波長λ；兩點間距 ；當V為50-100kv時，λ為0.0054-0.0037nm可見范圍為2埃-2.5埃,是光學顯微的1000倍，肉眼的一百萬倍。3、電子圖像的形成當電子束照射到樣品上時，會出現(xiàn)一列四種情況①一部分電子從樣品原子與原子之間的空隙中穿透過去。②一部分電子穿透時，會與樣品原子核或原子的軌道電子發(fā)生碰撞，被散射開來。③一部分電子從樣品表面被反射出來。④一部分電子被樣品吸收后，樣品激化而又從樣品本身反射出來（二次電子）。第三章應用微生物學技術

透射電鏡收集的是透過樣品的電子，這些電子束轟擊熒光屏，在屏上現(xiàn)出光強差異的可見光圖像。由于物體不同部位的結構不同，它們散射電子的能力也各不相同。樣品質(zhì)量、厚度 ；散射電子能力 ；透過光欄孔的電子數(shù)目；打在熒光屏上像的亮度 ；反之亦然，因而出現(xiàn)了明暗反差。

4、電子圖象的放大電子顯微鏡的放大率是由透鏡決定的，而透鏡是由看不見的電磁場構成，稱為磁透鏡。

電磁場強度；放大倍數(shù)；

第三章應用微生物學技術二）結構透射電鏡由電子光學系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和供電系統(tǒng)三部分構成。1、電子光學系統(tǒng)

是電鏡的主體，包括有：1）照明系統(tǒng)

為成像提供一個高亮度、高穩(wěn)定、束斑直徑可調(diào)的照明電子束。電子槍

為電子的發(fā)射源，50-120kV的高壓電源，電子束徑<100μm。聚光鏡是將來自電子槍的電子束會聚于樣品上，用它控制電子束斑的大小、照明強度和照明孔徑角。控制電子斑束的直徑<2μm。電子斑束直徑；電流密度；像亮度；圖像模糊不清。

第三章應用微生物學技術2）成像系統(tǒng)樣品室位于聚光鏡的下方，室內(nèi)有樣品臺，樣品臺支承樣品，使之在同一平面上縱向或橫向移動。物鏡

是由非磁性材料間隙的帶鐵殼的線圈和高導磁率材料制成的極靴所組成，當電流通過時就會產(chǎn)生電磁場。

中間鏡

位于物鏡下方。結構與物鏡相似，將成像的圖像進行放大。投影鏡位于中間鏡下方。結構與物鏡相似，將物像再次放大，并將放大的圖像投射到熒光屏上。第三章應用微生物學技術3）觀察與記錄系統(tǒng)觀察室

位于投影鏡的下方。包括：①熒光屏因為肉眼不能直接看到電子射線，故電子射線必須通過電子轟擊涂有發(fā)光物質(zhì)的熒光屏才能看到電子圖像。熒光屏位于觀察室內(nèi)下方，觀察者可以直接通過正面和側面的鉛玻璃（防止射線對觀察者的危害）觀察窗，觀察熒光屏上的電子像。②雙目鏡在觀察窗外還裝有一架可放大5-10倍的雙目光學顯微鏡可用來仔細觀察熒光屏上的圖像。照相機

可記錄攝影電子圖像。

第三章應用微生物學技術2、真空系統(tǒng)由于電子必須在真空中才能無阻擋地高速飛行，因此電鏡成像系統(tǒng)必須保持一定的真空度。否則電鏡不能正常工作。原因：①氣體分子與高速電子碰撞產(chǎn)生隨機散射電子，降低圖像的反差。②氣體分子存在，電子槍的高壓會引起電離和放電，使電子束不穩(wěn)定。③氣體與熾熱的燈絲作用，會腐蝕燈絲，縮短燈絲壽命。④殘余氣體會污染樣品。在電子束的通道內(nèi)不能有任何游離氣體存在，真空度的好壞是影響電鏡能否正常使用的關鍵。現(xiàn)在高性能的透射電鏡，其照明和成像系統(tǒng)中，真空度可達8×10-6Pa

真空系統(tǒng)包括有：排氣管道、開關閥門、真空規(guī)、真空指示表、真空干燥器、空氣壓縮機等。第三章應用微生物學技術3、供電系統(tǒng)電鏡的供電系統(tǒng)比較復雜,它包括兩個方面的作用;1）提供合適的電功率。包括高壓、透鏡電流和真空電源等高度穩(wěn)定的工作電壓與電流。2）調(diào)節(jié)和控制電鏡的工作狀態(tài)。包括一系列的控制調(diào)整線路。供電系統(tǒng)包括：燈絲加熱電源、電子加速高壓電源、透鏡電源、真空電源、自動控制系統(tǒng)、束偏轉、消像散器等電源以及安全系統(tǒng)和輔助電源。第三章應用微生物學技術第三章應用微生物學技術二、掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡是上世紀60年代開始出現(xiàn)并迅速發(fā)展起來的一種大型精密光學儀器。在透射電鏡中，照明電子束是透過樣品后經(jīng)物鏡放大成像，而掃描電鏡則以完全不同的方式成像，其照明電子束并不透過樣品，而是在樣品表面作光柵掃描運動，主要是用來觀察物體的外表形貌。一）原理1、電子槍燈絲加熱，射出直徑約為20-35μm的電子束，。2、電子束受到1-40kV（透射電鏡為100kV）的電壓加速射向鏡筒。3、電子束受到聚光鏡和物鏡的會聚作用，縮小成直徑為幾納米的電子束照射到樣品上。第三章應用微生物學技術4、掃描線圈使電子束在樣品表面逐點逐行地掃描，當電子束打到樣品上，會樣品中激發(fā)多種電子信號，其中激發(fā)出樣品淺表的二次電子能夠產(chǎn)生樣品表面的形貌特征像。二次電子的發(fā)射，是由于入射電子碰撞樣品中原子的核外電子，核外電子獲得能量脫離原子成為二次電子。其信號的強弱依樣品表面的形狀而異。5、由樣品表面各點發(fā)出的二次電子，經(jīng)加速器加速至10千伏左右，并射到由閃爍塑料光導管、光電倍增管等組成的探測器上，再經(jīng)視頻放大后，在顯像管熒光屏上顯示出來，便形成了一幅反映樣品表面形貌的圖像——二次電子像。在樣品上任何一點上的二次電子的發(fā)射強度的變化，都將表現(xiàn)為在顯像管熒光屏上對應點的亮度變化，從而反映出樣品表面形貌特征的黑白電子像。第三章應用微生物學技術二）結構1、電子光學系統(tǒng)

電子槍

電子發(fā)生裝置，但加速電壓較低，在1-30kV。聚光鏡

會聚電子束。物鏡

會聚電子束。電子束經(jīng)聚光鏡和物鏡的會聚作用于，縮小成直徑為幾個納米的電子束照射到樣品上。消像散線圈物鏡中裝有 掃描線圈：使電子束作掃描運動。 可變孔徑光闌2、樣品室

位于鏡筒的底部，其空間很大，可以觀察100mm的大樣品，可移動范圍大，樣品臺可通過機械手作前后、左右、上下、傾斜（±

900）和旋轉（3600）

第三章應用微生物學技術3、信號檢測與顯示系統(tǒng)二次電子檢測器

收集二次電子，并送至后面的光電倍增管。視頻放大器

接收電信號，并放大。顯像管

顯示二次電子圖像。4、照相機5、真空系統(tǒng)

在掃描電鏡中也有一套真空排氣系統(tǒng)。 6、供電系統(tǒng)第三章應用微生物學技術三）掃描電鏡的特點 與透身鏡相比，掃描電鏡具有一些極有價值的特點1、能在很大的放大倍率范圍工作幾十倍幾十萬倍；樣品全貌微細結構2、具有極大的焦深對復雜而粗糙的樣品表面,仍可看到清晰聚焦的圖像。3、樣品的適應性大

無論金屬、生物、化工、半導體或礦物材料，不認固體、粉末或液體，小至微生物、寄生蟲卵；大者如昆蟲，半導體芯片，甚至10cm3的樣品皆可放到掃描電鏡樣品室中觀察。4、操作方便樣品與終像之間無透鏡。5、樣品制備較簡單有些樣品甚至可不經(jīng)任何處理可直接放入樣品室用掃描電鏡觀察。第三章應用微生物學技術三、透射電鏡樣品超薄切片技術由于電子穿透力很弱，即使觀察細菌也無法見其內(nèi)部結構，也只能觀察到細菌的外貌及鞭毛，如要觀察其內(nèi)部結構則必需將細菌進行超薄切片，因此電鏡標本的制作必須注意：1）標本必須十分干燥；常用脫水劑有乙醇、丙酮等。2）標本必須出現(xiàn)適合的密度差別，以便得到最高的形像對比；3）由于電子不能穿透玻璃，因此標本的支持物不能用載玻片和蓋玻片；而是用火棉膠膜、聚乙烯甲醛（透明塑膠膜），銅網(wǎng)和鎳網(wǎng)。 膜厚度<100-150埃金屬網(wǎng)有孔，電子易透過4）標本厚度為10-100nm的薄片；除病毒外，微弱的電子束無法透過其它生物細胞的整體標本，需要制作成1000埃以下厚度的超薄切片，方能看清其內(nèi)部的微細結構。第三章應用微生物學技術超薄切片的制作步驟：1、取材

從動植物機體上、細胞及微生物培養(yǎng)物中取行所需材料的過程叫取材。2、固定

用化學法或物理法迅速殺死細胞的過程叫固定。固定目的：是使細胞中各種細胞器及大分子盡可能真實地保持在生活狀態(tài)，并牢固地固定在它原來的位置上，而且不會因一系列后繼的處理使其移位或丟失。固定方法：①物理法：采用冰凍、微波照射、臨界點干燥等手段來保存細胞結構。②化學法：有一定的化學試劑來固定細胞的結構，這些化學劑稱固定劑。3、漂洗經(jīng)固定后，樣品必須用相應的緩沖液充分漂洗，洗去殘留的固定劑。 第三章應用微生物學技術4、脫水脫水目的：將組織細胞內(nèi)的游離水除去，以利于包埋劑均勻地滲透到組織與細胞內(nèi)。由于常用的包埋劑是非水溶性的，只有將組織中游離水分徹底清除之后，非水溶性的包埋劑才能滲入。5、滲透與包埋滲透與包埋目的：是用包埋劑逐步滲入組織細胞內(nèi)取代脫水劑，使細胞內(nèi)外所有的空隙都被包埋劑填充，再將滲透好的組織塊放入適當?shù)哪＞咧校酀M包埋劑包埋。6、聚合聚合目的：經(jīng)加溫使模具中的組織塊被包埋劑聚合，使組織塊成為硬度適當?shù)陌駢K，以便切出理想的超薄切片。第三章應用微生物學技術7、超薄切片 超薄切片是為電鏡觀察提供極薄的切片樣品，需要有專用的超薄切片機、切片刀和切片技術。8、電子染色

為了加大反差，要對生物樣品進行染色，以增加電子散射能力，稱為電子染色。染料為重金屬鹽類，如醋酸鈾，檸檬酸鉛等。

第三章應用微生物學技術電子染色原理電子染色是利用重金屬鹽能與細胞的某些結構成分相結合的原理進行的，經(jīng)這些重金屬化合物染色后，細胞的不同結構成分上吸附重金屬原子的數(shù)量不同，因此出現(xiàn)三種不同的現(xiàn)象：結合重金屬較多的區(qū)域（即結構致密的部位）具有較強的電子散射能力，在電鏡下呈現(xiàn)為電子致密的黑色；結合重金屬較少的區(qū)域，電子散射能力較弱，呈現(xiàn)淺黑色；沒有結合重金屬的區(qū)域是電子透明的區(qū)域。這樣經(jīng)過電子染色可提高樣品的反差，增加圖象的清晰度。常用的染色液：醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛第三章應用微生物學技術四、掃描電鏡樣品制備技術掃描電鏡主要是觀察標本的表面結構或者組織細胞經(jīng)過冷凍斷裂的方法觀察細胞內(nèi)表面結構，不需要制作超薄切片，因此制備方法比較簡單。制備用于掃描電鏡觀察的生物標本，主要有三個基本標準：

干燥的生物標本；具有良好的導電性能；標本的微細結構維持原形；為此，目前應用的標本制備過程如下：標本→洗凈→脫水→干燥→表面導電處理→觀察固定：戊二醛、鋨酸等脫水：丙酮、乙醇等干燥：冷凍干燥法、臨界點干燥法等表面導電處理：金、鉑噴鍍、碘化鉀-醋酸鉛等導電染色第三章應用微生物學技術3.5免疫標記技術3.5.1免疫酶標記技術一、原理

免疫酶技術就是將抗原和抗體的免疫反應和酶的催化反應相結合而建立的一種新技術。酶與抗體或抗原結合，既不改變抗體或抗原的免疫學反應的特異性，也不影響酶本身的酶學活性，即在相應而合適的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型變?yōu)橛猩难趸?。這種有色產(chǎn)物可用肉眼，光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計加以測定。第三章應用微生物學技術免疫酶技術是一項先進的免疫化學測定技術，由于具有：①靈敏度高，特異性強；②可定性、定量檢測可溶性抗原和抗體，適用于診斷；③儀器和試劑來源廣，價格低廉；④操作簡單，重復性好；⑤可用于定位成分分析；第三章應用微生物學技術二、免疫酶技術基本條件免疫酶技術的應用成功與否取決于：1、抗原和高特異性、高效價的抗體2、用于免疫酶技術的酶應具備：1）高純度，高催化性，高專一性；2）酶蛋白分子具有足夠的偶用標記基團，與抗原、抗體蛋白分子偶聯(lián)處理后，仍保持較高的催化活力。3）使用穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性好。4）測定酶活力的方法要求簡便、靈敏、快速。5）酶的來源、純化和供應方便，價格低廉。第三章應用微生物學技術3、酶與抗體的偶聯(lián)4、酶底物必須具備的條件：1）易于獲得，價格低廉。2）配備方便，貯存穩(wěn)定。3）顯色鮮明。與相應酶的反應，能生成肉眼可明顯觀察到的顏色改變。4