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食品檢驗(yàn)工培訓(xùn)課件蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定第2頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天1概述2凱氏定氮法3蛋白質(zhì)的快速測(cè)定法4氨基酸總量的測(cè)定5氨基酸的分離與測(cè)定主要內(nèi)容第3頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天1概述(1)蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用(2)食品中的蛋白質(zhì)含量(3)蛋白質(zhì)系數(shù)(4)蛋白質(zhì)水解(5)蛋白質(zhì)測(cè)定方法第4頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天①蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分,是生物體發(fā)育及修補(bǔ)組織的原料,一切有生命的活體都含有不同類型的蛋白質(zhì)。②人體的酸堿平衡、水平衡的維持;③遺傳信息的傳遞;④物質(zhì)的代謝及運(yùn)轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。⑤人及動(dòng)物只能從食品得到蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物,來(lái)構(gòu)成自身的蛋白質(zhì),是人體重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)⑥食品的重要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。(1)蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用第5頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(2)食品中的蛋白質(zhì)含量
在各種不同的食品中蛋白質(zhì)的含量各不相同,一般說(shuō)來(lái)動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品,例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右,豬肉中為9.5%,兔肉為21%,雞肉為20%,牛乳為3.5%黃魚為17.0%,帶魚為18.0%,大豆為40%,稻米為8.5%,面粉為9.9%,菠菜為2.4%,黃瓜為1.0%,桃為0.8%,柑橘為0.9%,蘋果為0.4%和油菜為1.5%左右。
測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的含量,對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過(guò)程控制均具有極重要的意義。第6頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(3)蛋白質(zhì)系數(shù)
蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物,分子量很大,大部分高達(dá)數(shù)萬(wàn)~數(shù)百萬(wàn),分子的長(zhǎng)軸則長(zhǎng)數(shù)nm~100nm,它們由20種氨基酸通過(guò)酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來(lái),并具有一定的空間結(jié)構(gòu),所含的主要化學(xué)元素為C、H、O、N,在某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等元素,但含氮?jiǎng)t是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。第7頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天
不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同,故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同,一般蛋白質(zhì)含氮量為16%,即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì),此數(shù)值(6.25)稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。
不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同,如玉米,蕎麥,青豆,雞蛋等為6.25,花生為5.46,大米為5.95,大豆及其制品為5.71,小麥粉為5.70,牛乳及其制品為6.38。
第8頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(4)蛋白質(zhì)水解在構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中,亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人體內(nèi)不能合成,必須依靠食品提供,故被稱為必需氨基酸,他們對(duì)人體有極其重要的生理作用。
蛋白質(zhì)胨肽氨基酸第9頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(5)蛋白質(zhì)測(cè)定方法
測(cè)定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類:一類是利用蛋白質(zhì)的共性,即含氮量、肽鍵和折射率測(cè)定蛋白質(zhì)含量;另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團(tuán)以及芳香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
第10頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天
蛋白質(zhì)的測(cè)定,目前多采用將蛋白質(zhì)消化,測(cè)定其含氮量,再換算為蛋白質(zhì)含量的凱氏定氮法。不同食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同。
凱氏定氮法是測(cè)定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡(jiǎn)單的方法之一,可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析,可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品,故國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍,是個(gè)經(jīng)典分析方法,至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。2凱氏定氮法第11頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天
凱氏定氮法:常量法、微量法及經(jīng)改進(jìn)后的改良凱氏定氮法。微量凱氏定氮法樣品質(zhì)量及試劑用量較少,且有一套微量凱氏定氮器。目前通用以硫酸銅作催化劑的常量、半微量、微量凱氏定氮法。在凱氏法改良中主要的問(wèn)題是,氮化合物中氮的完全氨化問(wèn)題及縮短時(shí)間、簡(jiǎn)化操作的問(wèn)題,即分解試樣所用的催化劑。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦。第12頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(1)
原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化,使蛋白質(zhì)分解,其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出,而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾,使氨蒸出,用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。2.1常量凱氏定氮法第13頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天①樣品消化2NH2(CH)2COOH+13H2SO4=(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
濃硫酸具有脫水性,有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又具有氧化性,將有機(jī)物炭化后的碳化為二氧化碳,硫酸則被還原成二氧化硫2H2SO4+C=2SO2+2H2O+CO2
二氧化硫使氮還原為氨,本身則被氧化為三氧化硫,氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。
H2SO4+2NH3=(NH4)2SO4第14頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天②蒸餾:在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性,加熱蒸餾,即可釋放出氨氣,反應(yīng)方程式如下:
③吸收與滴定:加熱蒸餾所放出的氨,可用硼酸溶液進(jìn)行吸收,待吸收完全后,再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,因硼酸呈微弱酸性(k=5.8×10-10),用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng),但它有吸收氨的作用,吸收及滴定的反應(yīng)方程式如下:2NaOH+(NH4)2SO4=
2NH3↓+Na2SO4+2H2O2NH3+
4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3第15頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(2)適用范圍
此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定(3)儀器①500ml凱氏燒瓶;②定氮蒸餾裝置(4)試劑①硫酸銅
;
②硫酸鉀;③
硫酸;④
40g∕L硼酸溶液;⑤混合指示劑;⑥400g∕L氫氧化鈉;⑦0.1mol∕L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液第16頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(5)操作步驟①
樣品消化:準(zhǔn)確稱取均勻的固體樣品0.5~3g,或半固體樣品2~5g,或吸取溶液樣品15~25ml。小心移入干燥的凱氏燒瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5~1g硫酸銅、10g硫酸鉀及25ml濃硫酸,小心搖勻后,于瓶口置一小漏斗,瓶頸45°角傾斜置電爐上,在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化(若無(wú)通風(fēng)櫥可于瓶口倒插入一口徑適宜的干燥管,用膠管與水力真空管相連接,利用水力抽除消化過(guò)程所產(chǎn)生的煙氣)。先以小火緩慢加熱,待內(nèi)容物完全炭化、泡沫消失后,加大火力消化至溶液呈藍(lán)綠色。取下漏斗,繼續(xù)加熱0.5h,冷卻至室溫。第17頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天第18頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天第19頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天②蒸餾、吸收第20頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天
按圖裝好蒸餾裝置,冷凝管下端浸入接受瓶液面之下(瓶?jī)?nèi)預(yù)先裝有50ml40g∕L硼酸溶液及混合指示劑5~6滴)。凱氏燒瓶?jī)?nèi),加入100ml蒸餾水、玻璃珠數(shù)粒,從安全漏斗中慢慢加入70ml400g/L氫氧化鈉,溶液應(yīng)呈藍(lán)褐色。不要搖動(dòng),將定氮球連接好。用直火加熱蒸餾30min,將蒸餾裝置出口離開液面繼續(xù)蒸餾1min,用蒸餾水淋洗尖端后停止蒸餾。第21頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天③滴定:將接受瓶?jī)?nèi)的硼酸液用0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。同時(shí)做一試劑空白(除不加樣品,從消化開始操作完全相同)。第22頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天式中W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%;
c—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度,mol/L;V1—空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量,mL;V2—試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量,mL;m—樣品質(zhì)量,g;0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量,g/mmol;F—蛋白質(zhì)系數(shù)。(6)結(jié)果計(jì)算第23頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天2.2微量凱氏定氮法(1)原理
微量凱氏定氮法的原理與操作方法,與常量法基本相同,所不同的是樣品質(zhì)量及試劑用量較少,且有一套適于微量測(cè)定的定型儀器——微量凱氏定氮器。第24頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天第25頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天①100ml凱氏燒瓶。②微量凱氏定氮器。
(2)儀器第26頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天①20g/L硼酸溶液。
②400g/L氫氧化鈉。③1g/L甲基紅乙醇溶液與1g/L溴甲酚綠乙醇溶液,臨用時(shí)按1:5混合。④0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液⑤其他試劑同常量法。(3)試劑第27頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天
①樣品消化:樣品消化步驟同常量法。將消化完全的消化液冷卻后,完全轉(zhuǎn)入100容量瓶中,加蒸餾水至刻度,搖勻。
(4)測(cè)定方法第28頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天②蒸餾
按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至2/3容積處,加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升,以保持水呈酸性,加入數(shù)粒玻璃珠,加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水。在接受瓶?jī)?nèi)加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示劑,將冷凝管下端插入液面以下。第29頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天
吸取10.00ml樣品消化稀釋液,由進(jìn)樣漏斗進(jìn)入反應(yīng)室,以少量水沖洗進(jìn)樣漏斗,并流入反應(yīng)室。再?gòu)倪M(jìn)樣口加入400g/L氫氧化鈉10ml使溶液呈強(qiáng)堿性,用少量蒸餾水洗漏斗數(shù)次,蓋塞,進(jìn)行水蒸氣蒸餾。冷凝管下端預(yù)先插入盛有10mL4%(或2%)硼酸吸收液,蒸餾至吸收液中所加的混合指示劑變?yōu)榫G色開始記時(shí),繼續(xù)蒸餾10min后,將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min,用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。
第30頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天③滴定
取下接受瓶,以0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。第31頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(5)結(jié)果計(jì)算
式中W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%;
V0—滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積,mL;V1—滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積,mL;V2—蒸餾時(shí)吸取樣品稀釋液體積,mL;C—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度,mol/L;0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量,g/mmol;F—蛋白質(zhì)系數(shù);
m—樣品質(zhì)量,g。第32頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天2.3樣品的分解條件(1)K2SO4或Na2SO4:提高溶液的沸點(diǎn)(2)催化劑CuSO4
氧化汞和汞良好的催化劑,但劇毒;硒粉(3)氧化劑過(guò)氧化氫第33頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天硫酸鉀
加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解,它與硫酸鉀作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度一般純硫酸的沸點(diǎn)在340攝氏度左右,而添加硫酸鉀后,可使溫度提高到4000C以上,原因主要在于隨著消化過(guò)程中硫酸不斷地被分解,水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大,故沸點(diǎn)升高,其反應(yīng)式如下:
K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3但硫酸鉀加入量不能太大,否則消化體系溫度過(guò)高,又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失:
(NH4)2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉,氯化鉀等鹽類來(lái)提高沸點(diǎn),但效果不如硫酸鉀。第34頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天硫酸銅
CuSO4
①催化劑2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑
此反應(yīng)不斷進(jìn)行,待有機(jī)物被消化完后,不再有硫酸亞銅(褐色)生成,溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。②可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)③下一步蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)的指示劑。
作用第35頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(1)所用試劑應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。(2)消化過(guò)程應(yīng)注意轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶,利用冷凝酸液將附在瓶壁上的炭粒沖下,以促進(jìn)消化完全。(3)若樣品含脂肪或糖較多時(shí),應(yīng)注意發(fā)生的大量泡沫少量辛醇或液體石蠟,或硅消泡劑,防止其溢出瓶外,并注意適當(dāng)控制熱源強(qiáng)度。(4)若樣品消化液不易澄清透明,可將凱氏燒瓶冷卻,加入300g/L2~3ml過(guò)氧化氫后再加熱。2.4注意事項(xiàng)第36頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(5)若取樣量較大,如干試樣超過(guò)5g,可按每克試樣5ml的比例增加硫酸用量。(6)消化時(shí)間一般約4小時(shí)左右即可,消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起氨的損失。一般消化至透明后,繼續(xù)消化30min即可,但當(dāng)含有特別難以氨化的氮化合物的樣品,如含賴氨酸或組氨酸時(shí),消化時(shí)間需適當(dāng)延長(zhǎng),因?yàn)檫@兩種氨基酸中的氮在短時(shí)間內(nèi)不易消化完全,往往導(dǎo)致總氮量偏低。有機(jī)物如分解完全,分解液呈藍(lán)色或淺綠色。但含鐵量多時(shí),呈較深綠色。第37頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(7)蒸餾過(guò)程應(yīng)注意接頭處無(wú)松漏現(xiàn)象,蒸餾完畢,先將蒸餾出口離開液面,繼續(xù)蒸餾1min,將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi),再將吸收瓶移開,最后關(guān)閉電源,絕不能先關(guān)閉電源,否則吸收液將發(fā)生倒吸。(8)硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過(guò)40°C,否則氨吸收減弱,造成損失,可置于冷水浴中。(9)混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。第38頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天
半微量凱氏定氮第39頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天4氨基酸態(tài)氮的測(cè)定第40頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天
蛋白質(zhì)可以被酶、酸或堿水解,其水解的最終產(chǎn)物為氨基酸。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì),雖然從各種天然源中分離得到的氨基酸已達(dá)175種以上,但是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中的20種,而在構(gòu)成的氨基酸中,亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨算、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人體中不能合成,必須依靠食品供給,故被稱為必需氨基酸,它們對(duì)人體有著極其重要的生理功能,常會(huì)因其在體內(nèi)缺乏而導(dǎo)致患病或通過(guò)補(bǔ)充而增強(qiáng)了新陳代謝作用。
第41頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天
隨著食品科學(xué)的發(fā)展和營(yíng)養(yǎng)知識(shí)的普及,食物蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的構(gòu)成,愈來(lái)愈得到人們的重視。為提高蛋白質(zhì)的生理效價(jià)而進(jìn)行食品氨基酸互補(bǔ)和強(qiáng)化的理論,對(duì)食品加工工藝的改革,對(duì)保健食品的開發(fā)及合理配膳等工作都具有積極的指導(dǎo)作用。因此,食品及其原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也就具有極其重要的意義。第42頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天氨基酸態(tài)氮的測(cè)定雙指示劑甲醛滴定法:原理、試劑、測(cè)定方法、結(jié)果計(jì)算、說(shuō)明電位滴定法:原理、試劑、儀器、測(cè)定方法、結(jié)果計(jì)算第43頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天4.1雙指示劑甲醛滴定法(1)原理氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互租用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí),-NH2基與甲醛結(jié)合,從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)滴定-COOH基,并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量。反應(yīng)式(有三種不同的推論)如下:RCHH3NCCORCCOHOHNH2+HCHORCCOOHHNCH2+NaOHRCHCOOHNHCH2OH或RCHCOOHN(CH2OH)2或RCHCOONaNCH2或RCHNHCOOHCHO第44頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(2)方法特點(diǎn)及應(yīng)用
此法簡(jiǎn)單易行、快速方便,與亞硝酸氮?dú)馊萘糠ǚ治鼋Y(jié)果相近。在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測(cè)定發(fā)酵液中氨基酸含量的變化,以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況,并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。普氨酸與甲作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物,使結(jié)果偏高;溶液中若有存在也可與甲醛反應(yīng),往往使結(jié)果高。第45頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(3)試劑①40%中性甲醛溶液:以百里酚酞作指示劑,用氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍(lán)色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液③0.1%中性紅50%乙醇溶液④0.1%mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液第46頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天(4)操作方法移取含氨基酸約20~30mg的樣品溶液2份,分別置于250ml錐形瓶中,各加50ml蒸餾水,其中1份加入3滴中性紅置試劑,用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn);另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20ml,搖勻,靜置1分鐘,用0.1ml/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)。分別紀(jì)錄兩次所消耗的堿液ml數(shù)。第47頁(yè),共53頁(yè),2024年2月25日,星期天式中c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L;V1——
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