![(1.4.1.8)-生化實(shí)驗(yàn)十三 Km值測定_第1頁](http://file4.renrendoc.com/view4/M00/21/18/wKhkGGY-IOWAUz0-AAB0lD6_vVQ941.jpg)
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文檔簡介
實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目十三
Km值測定教學(xué)目的: 一、掌握Km值的定義和意義,掌握可調(diào)式移液器的使用方法。
二、熟悉林-貝氏雙倒數(shù)法測定Km及Vmax值的過程。
三、了解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的思路,優(yōu)缺點(diǎn)。
原理: 當(dāng)溫度、pH等條件恒定時(shí),酶促反應(yīng)速度V隨底物濃度[S]增大而增大,二者關(guān)系符合米氏方程。
V=
Vmax[S]
Km+[S]原理:
Km的值相當(dāng)于酶促反應(yīng)為最大速度一半時(shí)的底物濃度。是酶的特征性常數(shù)。用米氏方程作圖求Km不方便,將方程雙側(cè)取倒數(shù),即得到直線方程(林-貝氏作圖法)。
1Km11
VVmax[S]Vmax=.+原理:1V1S1Km1Vmax原理: 酵母蔗糖酶Km的測定:
蔗糖酶分解蔗糖為葡萄糖和果糖,分解產(chǎn)物與堿性銅鹽共熱,在堿性條件下,Cu2+被還原為Cu2O,Cu2O再還原砷鉬酸試劑生成鉬藍(lán),鉬藍(lán)顏色的深淺與生成還原性糖的量成正比,通過比色分析,可求得酶促反應(yīng)速度。原理:
Cu2+————Cu2O
Mo+6————
Mo+5----+2(藍(lán)色)葡萄糖和果糖還原操作步驟
取13支試管,編號:12345678910111213緩沖溶液0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2--蔗糖-0.10.20.30.40.50.10.20.30.40.5--水0.60.50.40.30.20.10.50.40.30.20.11.00.8堿性銅鹽1.01.01.01.01.01.01.0混勻各管,30度保溫5min后,1~6管間隔準(zhǔn)確1分鐘加保溫的酶液酶0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2--1號管30度保溫10分鐘后,加堿性銅鹽終止反應(yīng),間隔準(zhǔn)確1分鐘終止1~6管標(biāo)準(zhǔn)葡糖------------0.2操作步驟
將13支試管同置沸水浴中加熱20分鐘后,冷卻,每管加砷鉬酸試劑1mL,搖勻后,放置5分鐘,各加蒸餾水7mL,用塑料膜壓住管口,顛倒混勻,660nm比色分析:
以1號管為酶空白測定2-11號管吸光度
以12號管為水空白測定13號管吸光度計(jì)算一、計(jì)算各管反應(yīng)中所產(chǎn)生的還原糖的微量摩爾數(shù)。
二、按林-貝氏作圖法以各管的實(shí)際蔗糖濃度的倒數(shù)作橫坐標(biāo)即1/[S],以各管每分鐘產(chǎn)生的還原糖的微摩爾數(shù)的倒數(shù)為縱坐標(biāo)即1/V,繪制直線
三、求出Km及Vmax結(jié)果(供參考)
2:0.122
3:0.244
4:0.335
5:0.475
6:0.658
7:0.008
8:0.016
9:0.024
10:0.089
11:0.189
13:0.250
2-7:0.114
3-8:0.228
4-9:0.311
5-10:0.386
6-11:0.469
結(jié)果(供參考)
2-7:0.114
3-8:0.228
4-9:0.311
5-10:0.386
6-11:0.469
13:0.250
2號管:[S]=0.01M
3號管:[S]=0.02M
4號管:[S]=0.03M
5號管:[S]=0.04M
6號管:[S]=0.05M
結(jié)果(供參考)
2-7:0.114
3-8:0.228
4-9:0.311
5-10:0.386
6-11:0.469
13:0.250
2號管:1/[S]=100L/mol
3號管:1/[S]=50L/mol
4號管:1/[S]=33.3L/mol
5號管:1/[S]=25L/mol
6號管:1/[S]=20L/mol
以此值為橫坐標(biāo)結(jié)果(供參考)
2-7:0.114
3-8:0.228
4-9:0.311
5-10:0.386
6-11:0.469
13:0.250
2號管:V=0.114/0.250*1*400*0.1
=18.24μmol/min.mL
3號管:V=36.48μmol/min.mL
4號管:V=49.76μmol/min.mL
5號管:V=61.76μmol/min.mL
6號管:V=70.54μmol/min.mL
以此值倒數(shù)為縱坐標(biāo)結(jié)果(供參考)
2號管:1/V=0.054825
3號管:1/V=0.027412
4號管:1/V=0.020096
5號管:1/V=0.016192
6號管:1/V=0.013326
min.mL/μmol
以此值為縱坐標(biāo)2號管:1/[S]=100L/mol
3號管:
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