布魯氏菌病檢測(cè)

布魯氏菌病檢測(cè)一、概念：布魯氏菌?。ㄒ韵潞?jiǎn)稱布?。┦怯刹剪斒暇鸬娜?、畜共患的傳染病。在家畜中，牛、羊、豬最常發(fā)生，且可由牛、羊、豬傳染給人和其他家畜。其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起流產(chǎn)、不育和各種組織的局部病灶。二、檢測(cè)技術(shù)血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)（一）血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)1、凝集反應(yīng)

抗原與抗體之間具有特異性的化學(xué)親和力，當(dāng)它們比例合適時(shí)，則構(gòu)成一個(gè)大復(fù)合物，在電解質(zhì)(一般用生理鹽水)的作用下,形成肉眼看可見(jiàn)凝集現(xiàn)象，因此稱為凝集反應(yīng)。2、虎紅平板凝集試驗(yàn)2.1材料準(zhǔn)備2.1.1抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清由制標(biāo)單位提供，按說(shuō)明書(shū)使用。2.1.2受檢血清應(yīng)新鮮，無(wú)明顯蛋白凝塊，無(wú)溶血和腐敗氣味。2.1.3潔凈的玻璃板，其上劃分成4cm的方格。2.1.4吸管或分裝器，適用于滴加0.03ml。2.1.5牙簽或火柴桿，供攪拌用。2.2操作方法2.2.1將玻璃板上各格標(biāo)記受檢血清號(hào)，然后加相應(yīng)血清0.03ml。2.2.2在受檢血清旁滴加抗原0.03ml。2.2.3用牙簽類(lèi)小棒攪動(dòng)血清和抗原使之混合。2.2.4每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照。2.3判定2.3.1在陰、陽(yáng)性血清對(duì)照成立的條件下，方可對(duì)被檢血清進(jìn)行判定。2.3.2受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象者判為陽(yáng)性（+），無(wú)凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為（-）?；⒓t平板凝集試驗(yàn)照片虎紅平板凝集試驗(yàn)照片虎紅平板凝集試驗(yàn)照片虎紅平板凝集試驗(yàn)照片虎紅平板凝集試驗(yàn)照片3布病試管凝集試驗(yàn)3.1材料準(zhǔn)備3.1.1稀釋液

0.5%石炭酸生理鹽水，檢驗(yàn)羊血清時(shí)用含有0.5%

石炭酸的10%鹽溶液，如果稀釋用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液，抗原的稀釋亦用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液。

3.1.3凝集試驗(yàn)管（三分管）、試管架、吸管及溫箱。3.1.2抗原、陽(yáng)性血清和陰性血清由制標(biāo)單位提供，按說(shuō)明書(shū)使用。3.2操作方法3.2.1按常規(guī)方法采血分離血清。3.2.2運(yùn)送和保存血清樣品時(shí)防止凍結(jié)和受熱，以免影響凝集價(jià)。若3d內(nèi)不能送到實(shí)驗(yàn)室，按每9ml血清加1ml0.5%石炭酸生理鹽水（徐徐加入）防腐，也可用冷藏方法運(yùn)送血清。3.2.3受檢血清的稀釋3.2.3.1第1管標(biāo)記檢驗(yàn)編碼后加1.15ml稀釋液。3.2.3.2第2~4管各加入0.5ml稀釋液。3.2.3.3然后用1ml吸管取被檢血清0.1ml；加入第1管內(nèi)，并混合均勻?；旌戏椒ㄊ菍⒃撛嚬苤械幕旌弦何胛軆?nèi)，再沿試管壁吹入試管中，如此吸入、吹出3~4，充分混合后以該吸管吸混合液0.25ml棄去。3.2.3.4取0.5ml混合液加入第2管，用該吸管如前述方法混合。3.2.3.5再吸第2管混合液0.5ml至第3管，如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去混勻液0.5ml。3.2.3.6稀釋完畢，從第1至第4管的血清稀釋度分別為1:12.5;1:25;1:50和1:100。3.2.3.7牛、馬、鹿、駱駝血清稀釋法與上述基本一致，差異是第1管加1.2ml稀釋液和0.05ml被檢血清。3.2.3.8將0.5ml20倍稀釋的抗原加入已稀釋好的各血清管中，并振搖均勻，羊和豬的血清稀釋則依次變?yōu)?:25;1:50;1:100和1:200，牛、馬和駱駝的血清稀釋度則依次變?yōu)?:50;1:100；1:200和1:400。大規(guī)模檢疫時(shí)也可只用2個(gè)稀釋度，即牛、馬、駱駝?dòng)?:50和1:100，豬、山羊、綿羊和狗用1:25和1:50。

12

3

4

5

-

n血清稀釋度1:501:1001:2001:4001:8000.5%石炭酸生理鹽水1.20.50.50.50.50.5棄去0.5被檢血清或陽(yáng)陰性血清對(duì)照0.050.75棄去0.25

0.50.50.50.5

總量0.50.50.50.50.50.5加抗原（1：20）

0.50.50.50.50.50.5充分混勻37℃18-24小時(shí)溫育

結(jié)果判定

++++++++++--布魯氏菌病試管凝集反應(yīng)試驗(yàn)（牛）

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3

4

5

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n血清稀釋度1:251:501:1001:2001:4000.5%石炭酸10%鹽水1.150.50.50.50.50.5棄去0.5

被檢血清或陽(yáng)陰性血清對(duì)照0.10.75棄去0.25

0.50.50.50.5

總量0.50.50.50.50.50.5加抗原（1：20）

0.50.50.50.50.50.5充分混勻37℃18-24小時(shí)溫育

結(jié)果判定

++++++++++--布魯氏菌病試管凝集反應(yīng)試驗(yàn)（羊）

3.2.3.10每次檢驗(yàn)均應(yīng)設(shè)陽(yáng)性血清、陰性血清和抗原對(duì)照，即

a)陰性血清對(duì)照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與受檢血清同。

b)陽(yáng)性血清對(duì)照：陽(yáng)性血清須稀釋到原有滴度，加抗原的方法與受檢血清同。

c)抗原對(duì)照：1:20稀釋抗原液0.5ml，再加0.5ml稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。

注：試管凝集試驗(yàn)簡(jiǎn)便方法試管凝集試驗(yàn)也可用較簡(jiǎn)便方式進(jìn)行，即將血清以0.08毫升、0.04毫升、0.02毫升及0.01毫升分別加入四支小試管內(nèi)，然后每管加入1：40稀釋的抗原1毫升，充分搖勻，這樣4管血清的最后稀釋度分別為1：25、1：50、1：100和1：2003.3判定3.3.1供判定參照比濁管制備方法管號(hào)1：40稀釋抗原液mL稀釋液mL清亮度記錄標(biāo)記123450.000.250.500.751.001.000.750.500.250.001007550250++++++++++-3.3.2置37℃~40℃溫箱24h，取出檢查并記錄結(jié)果。3.3.3結(jié)果判定3.3.3.1凝集反應(yīng)程度分為：參照比濁管，按各試管上層液清亮度判讀

a)++++菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮；

b)+++菌體幾乎完全凝集，上層液體75%清亮；

c)++菌體凝集顯著，液體50%清亮；

d)+凝集物有沉淀，液體25%清亮；

e)–凝集物無(wú)沉淀，液體均勻渾濁。3.3.3.2牛、馬、鹿和駱駝1:100血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗用1:50血清稀釋，出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，受檢血清判定為陽(yáng)性。3.3.2.3牛、馬、鹿和駱駝1:50血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗用1:25血清稀釋，出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，受檢血清判定為可疑反應(yīng)。布病試管凝集試驗(yàn)照片布病試管凝集試驗(yàn)照片布病試管凝集試驗(yàn)照片布病試管凝集試驗(yàn)照片布病試管凝集試驗(yàn)照片可疑反應(yīng)家畜經(jīng)3周~4周后重檢，如果仍為可疑，該牛、羊判為陽(yáng)性。豬和馬經(jīng)重檢仍保持可疑水平，而農(nóng)場(chǎng)的牲畜沒(méi)有臨床癥狀和大批陽(yáng)性患畜出現(xiàn)，該畜被判為陰性。

豬血清偶有非特異性反應(yīng)，須結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查判定，必須要時(shí)應(yīng)配合補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和鑒別診斷，排除耶森氏菌交叉凝集反應(yīng)。布魯氏菌病檢測(cè)結(jié)果記錄表檢品編號(hào)：

**號(hào)

樣品名稱：檢測(cè)方法：虎紅平板凝集、試管凝集檢測(cè)時(shí)間：

備注:GB/T18646-2002

共

頁(yè)第

頁(yè)檢測(cè)編號(hào)原始編號(hào)

檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)編號(hào)原始編號(hào)

檢測(cè)結(jié)果11722833944105陽(yáng)性對(duì)照+116陰性對(duì)照-12結(jié)果分析：共檢樣品多少,其中陽(yáng)性多少,可疑多少,陰性多少備

注（使用方法）:使用方法,使用試劑廠家及批號(hào)檢驗(yàn)人員：

復(fù)核人：

年

月

日試管凝集反應(yīng)試驗(yàn)原始結(jié)果記錄表編號(hào)稀釋度1:501:1001:2001:4001122334陽(yáng)性對(duì)照####5陰性對(duì)照----檢驗(yàn)人員：

復(fù)核人：

年

月

日病原學(xué)技術(shù)一、分離培養(yǎng)和培養(yǎng)基1分離培養(yǎng)凡從可疑病畜、野生動(dòng)物或者可疑物中分離到布魯氏菌，即可診斷為布魯氏菌病或帶菌。目前已清楚了解，除了外界環(huán)境中有布魯氏菌存在外，還在60多種家畜和野生動(dòng)物中分離到了布魯氏菌。分離到布魯氏菌是了解疫情、分析疫情、判斷疫情的最可靠資料。1.1牲畜材料中的布魯氏菌分離培養(yǎng)方法1.1.1流產(chǎn)胎兒培養(yǎng)方法:

流產(chǎn)胎兒取來(lái)后，先用清水把泥土等污物洗凈，然后在3%的來(lái)蘇兒中浸泡半小時(shí)以上，取出在無(wú)菌條件下進(jìn)行解剖。分別取出淋巴結(jié)、肝、脾、胃內(nèi)容物、肺和骨髓等接種在普通培養(yǎng)基或者選擇性培養(yǎng)基上，置37℃溫箱培養(yǎng)。一般情況下3~5天即可獲得陽(yáng)性結(jié)果。2周內(nèi)無(wú)陽(yáng)性結(jié)果可停止培養(yǎng)。牲畜流產(chǎn)胎兒或者死羔犢是布魯氏菌分離培養(yǎng)最可靠、最有價(jià)值的細(xì)菌學(xué)材料。在流產(chǎn)胎兒的細(xì)菌分離中各種器官均有較高的分離率，尤其肺、脾和胃內(nèi)容物。1.1.2胎衣的檢查：取流產(chǎn)和正產(chǎn)的胎衣用清水洗去糞便等污物，再剪下數(shù)個(gè)子葉，用滅菌生理鹽水沖凈，然后用滅菌研磨器研碎或剪碎，接種在選擇培養(yǎng)基上或做生物學(xué)檢查。2布魯氏菌的培養(yǎng)基及其制備方法2.1土豆瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10克瓊脂15克氯化鈉5克牛肉浸膏5克葡萄糖10克甘油8~12克

1:2土豆浸液500毫升蒸餾水500毫升除葡萄糖外，將上述各成分混合熔化，用多層紗布過(guò)濾，用20%的氫氧化鈉調(diào)pH7.2,加入葡萄糖，分裝，15磅高壓20分鐘備用。

1:2土豆浸液的制備：新鮮土豆去外皮，切成塊，稱取500克，放1000毫升蒸餾水中加熱煮沸，熟了為止（約10分鐘），用紗布過(guò)濾，其液體置15磅高壓20分鐘備用。2.2肝浸液瓊培養(yǎng)基：蛋白胨10克氯化鈉5克瓊脂15克1:4肝浸液1000毫升將上述各成分混合熔化，用多層紗布過(guò)濾，用20%的氫氧化鈉調(diào)pH7.2,分裝，15磅高壓20分鐘備用。

1:4肝浸液的制備：取新鮮牛肝（羊和豬肝也可以）去其脂肪和結(jié)締組織后用清水輕輕洗，用絞肉機(jī)絞碎稱取250克，加入蒸餾水1000毫升，在冰箱中浸泡24小時(shí)，取出加熱煮沸到熟為止，用帆布或紗布脫脂棉過(guò)濾，15磅高壓20分鐘備用。2.3胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨20克葡萄糖10克氯化鈉5克瓊脂20克蒸餾水1000毫升先把瓊脂放在蒸餾水中加熱熔化，然后將上述其余各成分加入熔化，用紗布脫脂棉過(guò)濾，調(diào)pH6.8~7.0，分裝，13磅高壓30分鐘備用。二、防止與個(gè)人防護(hù)1防止經(jīng)皮膚感染、粘膜感染和呼吸道感染1.1防止家畜流產(chǎn)物引起感染：接羔助產(chǎn)人員，在接種羔助產(chǎn)和處理胎兒，死羔時(shí)，應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)，除備有工作服，橡皮圍裙、帽子、口罩和膠鞋外，還應(yīng)該戴乳膠手套和線手套，備有接羔袋和消毒液，嚴(yán)禁赤手抓拿流產(chǎn)物。家畜的流產(chǎn)胎兒、胎盤(pán)、胎衣或死胎等，不要隨意丟棄，以防污染環(huán)境或被狗吃掉引起布病傳播。1.2防止經(jīng)粘膜感染:這里所指的粘膜感染主要是指性器官粘膜。實(shí)踐證明，布氏菌很容易經(jīng)性器官粘膜感染發(fā)病。1.3防止經(jīng)呼吸道感