生物技術藥物的制造進程課件

第三章生物技術藥物的制造進程1生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024

第一節(jié)生物技術藥物生產簡介

一、一般生產過程

生物技術藥物的生產可分為上游和下游兩個階段。上游階段是指構建穩(wěn)定高效表達的工程細胞(或工程菌)，主要包括目的基因的分離，工程菌的構建與篩選；下游階段是指工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)，一直到產品的分離純化、制劑、質量控制等一系列工藝過程。2生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024獲得目的的基因↓構建重組體↓構建基因工程菌(或工程細胞)↓大規(guī)模培養(yǎng)工程菌↓產物分離純化↓除菌過濾↓半成品檢定↓制劑↓成品檢定↓包裝生物技術藥物生產一般過程

生物技術藥物制造過程的主要程序是：獲得目的基因→構建DNA重組體→將重組體導入宿主細胞→鑒定篩選陽性克隆→構建基因工程菌（或工程細胞）→培養(yǎng)工程菌→分離純化表達產物→除菌過濾→半成品檢定→制劑→成品檢定→包裝．3生物技術藥物的制造進程課件5/9/20241、獲得具有遺傳信息的目的基因從復雜的生物體基因組中采用不同方法分離并獲得帶有目的基因的DNA片段。獲得目的基因主要通過下述方法。(1)用限制性內切酶法直接分離目的基因質粒和病毒等DNA分子小的幾kb,大的幾百kb,編碼的基因較少,直接用限制性內切酶法獲得目的基因（2）人工合成目的基因人工合成目的基因主要采用下列3種途徑。①酶促方法經(jīng)提取獲得編碼基因的信息RNA（mRNA），在逆轉錄酶的作用下，合成互補DNA（cDNA）鏈，在DNA聚合酶I的作用下，加工成為雙鏈DNA分子。②化學合成法前提是必須已知基因的核苷酸序列，化學合成的DNA片段一般較短，需要用DNA連接酶進行連接，從而獲得較長的DNA片段。③聚合酶鏈反應（PCR）先決條件是必須已知基因的核苷酸序列，根據(jù)序列設計引物，進行PCR擴增獲得的目的基因。也可以采用反轉錄PCR（RT-PCR）等方法，直接從富含目的基因的實驗材料提取RNA，在逆轉錄酶的作用下獲得cDNA，以此為模板進行PCR擴增獲得目的基因。(3)構建基因組文庫從cDNA文庫分離目的基因4生物技術藥物的制造進程課件5/9/20242、選擇基因載體構建重組NDA在體外將含目的基因的DNA片段和具有自我復制功能、并帶有選擇標記的載體分子進行酶切連接，獲得重組DNA分子。常見基因載體有質粒、噬菌體（phage）、黏粒（cosmid）、病毒載體等。3、將重組DNA分子導入宿主細胞采用特定的方法將重組DNA分子轉移至適當受體細胞（也稱寄主細胞），并與之同步增殖。被導入的受體細胞分為兩大類：第一類為原核細胞，目前常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等。第二類為真核細胞，其中真核微生物主要有酵母、絲狀真菌等，此外為動物細胞、植物細胞。另外也可以導入動物和植物體。導入的方法主要有轉化、轉染等方法，此外也可采用電融合、顯微注射和基因槍等技術。5生物技術藥物的制造進程課件5/9/20244、鑒定帶有目的基因的克隆從大量的細胞繁殖群體中，篩選出克隆有重組DNA分子的寄主細胞。為了挑選出重組子，針對不同基因的表達產物，采用各自特有的測活方法確定其生物活性；也可以采用酶聯(lián)免疫方法確定其抗原性；以目的基因為探針，通過DNA雜交方法可以直接確定重組子。5、目的基因的擴增及獲得目的產物培養(yǎng)克隆有目的基因的重組子，提取獲得擴增的目的基因以進行深入的研究。將目的基因克隆至適當?shù)谋磉_載體，采用特定的方法將基因導入受體細胞，使其在新的遺傳背景下獲得活性表達，從而得到人類需要的特定目的物質6生物技術藥物的制造進程課件5/9/20247生物技術藥物的制造進程課件5/9/20246、大規(guī)模培養(yǎng)工程菌基因工程菌的培養(yǎng)過程主要包括：①通過搖瓶操作了解工程菌生長的基礎條件，如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分以及碳氮比，分析表達產物的合成、積累對受體菌的影響；②通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案及順序。由于工程菌生長和異源基因表達之間有著較大的差異，各培養(yǎng)參數(shù)在全過程中必須分段控制。在不同的發(fā)酵條件下，工程菌的代謝途徑也不一樣，因而對下游的純化工藝會造成不同的影響。因此在高表達高密度發(fā)酵的前提下，還要盡量建立有利于純化的發(fā)酵工藝，以提高產品的純度及改善其性質。8生物技術藥物的制造進程課件5/9/20247、根據(jù)研制產品的物理化學性質,選擇合理的分離純化方法基因工程產物分離純化的費用約占整個生產費用的80%～90%，因此，該工藝過程理所當然地應受到高度的重視。然而基因工程產物的分離純化過程與傳統(tǒng)發(fā)酵產物相比，具有下列特點：（1）產物大多處于細胞內，提取前需將細胞破碎，增加了很多困難；（2）產物濃度較低、雜質多、而最后成品要求達到的純度高，故提取較困難，且收率低，常需好幾步操作并需采用高分辨力的精制方法；（3）產物都是大分子蛋白質，通常不穩(wěn)定，遇熱、極端pH、有機溶劑和剪切力等易引起失活。各種產物表達形式所采用的分離純化方法不同。純化方法對重組蛋白的化學性質、構象等都有重要影響，合理的純化方法至少要包括以下幾方面:純化步驟少產物的純度、活性及其他檢測指標達到規(guī)定要求得率高在確定純化工藝時要多借鑒最新的分離純化技術并計算相關技術成本,要考慮到將來生產工藝放大以后的可行性，在研制階段所得出的實驗數(shù)據(jù),要為將來的生產放大提供充分的依據(jù)。在現(xiàn)實中,有許多廠家，企業(yè)拿到某種產品的新藥證書和生產批文,但市場上遲遲見不到該品種上市的現(xiàn)象比比皆是，除生產廠家有自己的產品上市銷售安排之外,生產工藝先天不足也是一個主要的原因。9生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024分離純化的一般流程10生物技術藥物的制造進程課件5/9/20248、劑型，配方，規(guī)格和穩(wěn)定性結合我國現(xiàn)階段物流運輸?shù)膶嶋H情況,最好選擇凍干劑型,凍干劑型易于運輸和保存,但在凍干過程中產品易發(fā)生聚集,生物活性可能會受到影響，而液體制劑在臨床使用上比較方便，合適的產品配方對產品的活性保持非常重要。根據(jù)劑型的特點和現(xiàn)有的同類產品的輔料,找出自己最合適的,并進行穩(wěn)定性考察。選擇合適的產品規(guī)格,對于產品的臨床使用和上市銷售非常重要，有些產品臨床使用劑量大,而小規(guī)格的產品造成終端用戶使用極不方便。根據(jù)藥效學研究的結果,參照將來臨床使用的劑量來確定合理的制劑規(guī)格，如果所開發(fā)的產品國外已經(jīng)上市,應盡可能參照已上市產品的規(guī)格和劑型。穩(wěn)定性考察是對產品的劑型、配方及儲存條件確定的綜合評價。特別是基因工程藥物,穩(wěn)定的生物活性是其安全有效的保證，應在充分研究同類或相近產品的穩(wěn)定性考察溫度和本品的生物化學性質的基礎上,制訂好考察周期,根據(jù)質檢規(guī)程的要求進行檢測為產品的有效期確定提供科學依據(jù)。11生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024NDV-F（新城疫弱毒株）誘生人臍血干細胞，提取mRNA，反轉錄成DNA，構建質粒，經(jīng)克隆篩選獲得有目的基因的質粒pBV867,轉化到大腸干菌中，干擾素基因在啟動子控制下轉錄。發(fā)酵，收集對數(shù)期生長的的pBV867工程菌，用溶菌酶或高壓勻漿破菌后，裂解液用85%硫酸胺鹽析，酸化使70%雜蛋白變性，然后過CM-22和DEAE-22離子交換層析，分段洗脫，超濾濃縮，再過干擾素單抗親和層析柱，可純化2500倍，純度達95%以下，經(jīng)分裝，凍干即成。12生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024二、生物技術藥品質量保證要素（一）藥典（pharmacopia）（二）質量保證體系藥品的質量保證起始于新藥的研究與開發(fā)，并貫穿于生產銷售和使用的各個環(huán)節(jié)。1.研究與開發(fā)者，臨床前研究，GLP(goodlaboratorypractice藥品非臨床研究質量規(guī)范)2.臨床研究單位，GCP(Goodclinicalpractice藥品臨床試驗管理規(guī)范)3.藥品生產企業(yè)，GMP(GoodManyfacturingpractice藥品生產質量管理規(guī)范)4.藥品經(jīng)銷商，GSP(Goodsupplyingpractice醫(yī)藥商品質量管理規(guī)范)5.醫(yī)院，消費者，GUP(Goodusepractice醫(yī)藥商品使用管理規(guī)范)6.中藥栽培企業(yè)，GAP（GoodAgriculrurePractice中草藥栽培規(guī)范）7.醫(yī)院藥房和藥劑科，GPP（GoodPharmacyPractice醫(yī)院藥房質量管理規(guī)范）QA（QualityAssurance

質量保證）——GMP——QC（QualityControl質量控制）

13生物技術藥物的制造進程課件5/9/202414生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024(三)生產車間與設備制藥車間設備包括生產專門設施區(qū)、質量控制區(qū)和貯存區(qū)。潔凈區(qū)是安裝有制藥設備并受嚴格環(huán)境潔凈控制的區(qū)域，注射劑或無菌生物藥物必須在潔凈區(qū)生產，潔凈區(qū)需特殊設計以防止產品受到污染，常見的污染物有微生物與顆粒物質。潔凈區(qū)的環(huán)境監(jiān)測：空氣懸浮粒子標準監(jiān)測微生物限度監(jiān)測人員監(jiān)測15生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024純化水和注射用水系統(tǒng)純化水：為原水經(jīng)離子交換法、反滲透法、蒸餾法或其他適宜方法制得的供藥用的水，不含任何附加劑，可作為配制普通藥物制劑用的溶劑或試驗用水，不能于注射劑的配制。注射用水：為純化水經(jīng)蒸餾所得的水，應符合細菌內毒素實驗要求，可作配制注射劑用的溶劑。(四)制藥用水系統(tǒng)

16生物技術藥物的制造進程課件5/9/202417生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024注射用水制造流程圖18生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024（五）生產許可1、工藝規(guī)程闡述生產一定量的某一藥品所需原料、輔料、包裝材料、半成品和成品的質量標準及批生產處方，生產規(guī)程，作業(yè)方法，中間控制方法和注意事項的一套文件。2藥品的批準文件新藥證書或藥品批準書藥品生產許可證GMP批準文號：藥品批準文號為：國藥準字＋1位字母＋8位數(shù)字；化學藥品使用字母“H”，中藥使用字母“Z”，生物制品使用字母“S”，進口分包裝藥品使用字母“J”等。數(shù)字第1、2位為原批準文號的來源代碼，。第3、4位為換發(fā)批準文號之年公元年號的后兩位數(shù)字。數(shù)字第5至8位為順序號。

3、生產方法(manufacturingmethod)生產某一藥品標準批量的基本方法、流程及原則要求。注意生產處方與終產品處方的區(qū)別。

19生物技術藥物的制造進程課件5/9/20244、生產過程控制方法及標準為保證藥品批間質量的均一性，進行生產過程控制或中間品的質量控制，目的是監(jiān)控生產全程，及時查明中間品和產品變異質量的偏差。5、原、輔料質量標準、如：糊精,乳糖,淀粉明膠,乙醇,甘油,殼聚糖,甲殼素,聚維酮,活性碳,凡士林,丙二醇,包衣粉,硬脂酸鎂,聚乙二醇,空心膠囊,微粉硅膠,纖維素系列等6、質量標準成品質量標準分為外控質量標準和內控質量標準。外控標準就是產品的注冊標準或法定標準(如藥典標準、部頒標準)、內控標準是企業(yè)控制標準，一般檢查項目多于外控標準或項目的限定指標嚴于外控標準或二者兼有。20生物技術藥物的制造進程課件5/9/20247、包裝材料質量標準8、穩(wěn)定性考察藥品穩(wěn)定性是指藥品保持其物理、化學、生物學穩(wěn)定性及其療效和安全性的能力，確保藥品在有效期內的安全性與有效性。包括三部分內容：影響因素試驗，加速試驗和長期留樣考察。9、變更控制和登記21生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024一、生物技術藥物表達系統(tǒng)（一）原核生物細胞1、大腸桿菌A.表達方式細胞內不溶性表達：包含體胞內可溶性表達：分離純化較困難細胞周質表達：用滲透振擾法分離產物,可避免細胞內蛋白酶的降解，或使表達的蛋白正確折疊，或去除N--末端的甲硫氨酸，胞外分泌型表達：通過信號肽攜帶等操作，是最優(yōu)選的方法。第二節(jié)生物技術藥物來源與質量控制22生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024

1）

細胞內不溶性表達產物

包涵體的分離純化包涵體是在大腸桿菌高表達系統(tǒng)中,某些目的蛋白質以不溶性形式產生并聚集形成蛋白質聚合物。包涵體可以較容易地與胞內可溶性蛋白雜質分離，但因包涵體中重組蛋白質產物經(jīng)過了一個變性復性過程，較易形成蛋白產物的錯誤折疊和聚合體包涵體的分離及其中重組蛋白質的純化通常包括以下步驟（1）.菌體細胞的收集與破碎；

（2）.包涵體的分離、洗滌與溶解；

（3）.變性蛋白質的純化；（4）.重組蛋白質的復性。2）

分泌型表達產物的分離純化分泌型的表達產物通常體積大、濃度低、必需在純化以前進行濃縮處理，盡快縮小溶液體積。超濾是目前最常用的蛋白質溶液濃縮方法。其優(yōu)點是不發(fā)生相變化，也不需要加入化學試劑，能耗低。

23生物技術藥物的制造進程課件5/9/20243）

大腸桿菌細胞內可溶性表達產物的分離純化某些細胞因子（如白細胞介素2、11）和硫氧還原蛋白的基因能在大腸桿菌胞內表達可溶性的融合蛋白。這種表達方式可避免無活性的不可溶包涵體的形成，使外源蛋白在細胞中能正確折疊,從而獲得特定空間結構和生物功能,并以可溶性形式表達。經(jīng)細胞破碎后的可溶性離心上清液，可選用親和層析法或離子交換法分離純化4）

大腸桿菌細胞周質表達蛋白的分離純化周質表達的蛋白可以避開細胞內可溶性蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類雜質，有利于蛋白產物的分離純化,通常能夠回收到高質量的蛋白產物。為了獲取周質蛋白，細胞經(jīng)低濃度溶菌酶處理后，一般用滲透壓休克（先用高滲蔗糖（20%）處理細胞，再用低滲溶液處理細胞使其脹破，此時便可對釋放出來的胞漿蛋白質進行分離）的方法獲取。24生物技術藥物的制造進程課件5/9/202425生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024B.不足分泌能力不足，真核蛋白在E.coli中常形成不溶性包含體，表達產物必須變性和復性處理才能使目的蛋白恢復生物活性。在E.coli表達體系中不存在翻譯后修飾作用，對蛋白質產物不能進行糖基化，因此只能用于表達不需糖基化作用的真核蛋白。由于翻譯常從起始密碼子AUG(甲硫氨酸)開始，因此目的蛋白的N末端常多了一個甲硫氨酸殘基，容易引起免疫反應。大腸桿菌還會產生內毒素，故目的產品應作內毒素檢測產生蛋白酶會破壞目的蛋白C解決方法：降低培養(yǎng)溫度(從37℃降到30℃)以硫氧還原蛋白為載體進行融合蛋白表達

26生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復合物,它的特殊性不是細菌或細菌的代謝產物,而是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有內毒素生物活性的物質。其化學成份主要是由O-特異性鏈、核心多糖、類脂A三部分組成。類脂A是內毒素多種生物活性或毒性反應的主要基團。該基團沒有種屬特異性,所以各屬細菌的類脂A結構相似,其毒性反應相似。如發(fā)熱、血液流動力學改變、彌漫性血管內凝血,并導致休克等。內毒素不是蛋白質,熱穩(wěn)定性強。在100℃的高溫下加熱1h也不會被破壞,115℃30min濕熱僅能破壞25%左右的熱原質。只有180℃3~4h或250℃1~2h干烤,或用強堿、強酸或強氧化劑加溫煮沸30min才能破壞它的生物活性。內毒素帶有負電荷,由于脂多糖結構中類脂A的疏水性,使得內毒素傾向于以高分子聚合物的狀態(tài)存在而難溶于水,并由于環(huán)境中Ca2+、Mg2+等被吸引到帶負電荷的脂多糖上而得以穩(wěn)定。通常其分子量幾十萬至上百萬道爾頓。27生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024內毒素的產生

基因工程蛋白通常采用細菌、酵母、哺乳動物細胞或昆蟲細胞作為宿主進行大規(guī)模發(fā)酵生產,但大多是以大腸桿菌作為表達系統(tǒng)。以大腸桿菌作為表達系統(tǒng)的蛋白通常都是在胞內表達,在純化蛋白之前必須通過高壓勻漿、超聲波破碎或低壓滲透等方法將菌種破壁,以釋放蛋白。同時細胞壁內的脂多糖也大量釋放到緩沖液中,通常10%的濕菌濃度可產生內毒素,這是內毒素的主要來源。生產中去除內毒素，主要是采用各種柱層析技術,如疏水層析、離子交換、親和層析、分子篩等,這些技術純化目標產品的同時也可以有效去除內毒素。28生物技術藥物的制造進程課件5/9/20242枯草芽孢桿菌

A、優(yōu)點：分泌能力強，表達產物可直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體。B缺點：不能使蛋白質產物糖基化，另外由于它有很強的胞外蛋白酶，會降解表達產物。3鏈霉菌A特點：不致疾、使用安全、分泌能力強，可將表達產物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力。B缺點：操作比大腸桿菌復雜，轉化或轉化頻率低用于基因表達的啟動子少。29生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024（二）真核生物細胞1、酵母A特點：酵母易繁殖，可以大規(guī)模廉價培養(yǎng)，而且沒有毒性，能將表達產物分泌到細胞外，表達產物能糖基化，在細菌中難于表達的真核基因在酵母中可獲得高效表達。它有以下特點：①是真核表達體系，對表達蛋白可進行折疊和翻譯后修飾與糖基化；②表達量高，如明膠表達量達14.8g/L;③培養(yǎng)基成本低；④適用高密度發(fā)酵；⑤雜蛋白少，產物易純化。B缺點色素難以除去啤酒酵母表達量偏低；大量表達時，常會有質粒丟失；重組蛋白發(fā)生超糖基化；分泌蛋白留在壁膜間隙，增加了純化難度。畢赤酵母表達系統(tǒng)優(yōu)于啤酒酵母。30生物技術藥物的制造進程課件5/9/20242、哺乳動物細胞A優(yōu)點：哺乳動物細胞可將表達產物由重組轉化細胞分泌到培養(yǎng)液中，使產物易于純化。哺乳動物細胞分泌的表達產物是糖基化的，接近或類似天然產物。可獲得結構與天然蛋白相一致的活性蛋白，對于制造結構復雜的生物藥物是其它系統(tǒng)所無法比擬的。B缺點：細胞生長緩慢、生產效率低、培養(yǎng)條件苛刻、費用高，培養(yǎng)液中產物濃度稀，因此生產成本高，擴大生產規(guī)模有較大困難。常用的哺乳動物細胞為中國倉鼠卵細胞(CHO細胞)和幼倉鼠腎細胞(BHK)31生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024表達體系產物產生部位培養(yǎng)方式提純產物活性潛在危險性大腸桿菌多肽、蛋白質或融合蛋白質菌體內容易部分可獲高產一般對原核者好真核者稍差不大酵母多肽、蛋白質或糖基化蛋白菌體內或分泌出細胞容易可高產菌體內稍復雜真核的接近天然不大哺乳動物細胞完整糖基化蛋白分泌出細胞較難、成本高可高產簡單幾乎可為天然產物需注意有致癌因素32生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024考慮事項大腸桿菌酵母哺乳細胞ＤＮＡ的大小和特點4.6Mb，環(huán)形ＤＮＡ12.1Mb，染色體ＤＮＡ2000-3000Mb，染色體ＤＮＡ翻譯后修飾沒有可能，但不同于人可能，類似或同人一樣生長率（每小時循環(huán)數(shù)）3.33/h0.25/h0.02/h培養(yǎng)方法發(fā)酵發(fā)酵發(fā)酵（懸浮細胞）轉瓶（粘附細胞）成本低中間>100萬美元／kg在制藥規(guī)模上選擇宿主細胞用于重組藥物的表達中一些關鍵事項的比較33生物技術藥物的制造進程課件5/9/20243昆蟲細胞表達系統(tǒng)昆蟲細胞可進行信號肽的切除，糖基化等蛋白質翻譯后加工，并能進行適當?shù)募毎謪^(qū)和胞外分泌表達。主要包括桿狀病毒表達系統(tǒng)、穩(wěn)定轉化系統(tǒng)（stabletransformationsystem）兩種。桿狀病毒表達系統(tǒng)將目的基因克隆至帶有編碼桿狀病毒多角體或P10啟動子的轉染載體上，獲得重組桿狀病毒，感染昆蟲細胞［sf-9，sf-2］，BTI-ΤΝ-5Β1-4（HighFiveTM）］進行表達。該系統(tǒng)表達的抗體盡管每個細胞的表達水平是原核細胞的50～100倍，但仍為可溶性。另外，桿狀病毒有嚴格的宿主傳導性，增加了該系統(tǒng)的安全性。穩(wěn)定轉化系統(tǒng)克服了病毒感染引起細胞死亡的缺點，Mahiouz等將抗E-選擇素的單鏈抗體基因克隆于果蠅金屬硫蛋白啟動子下，轉染果蠅細胞，篩選穩(wěn)定轉化的細胞克隆，培養(yǎng)上清中抗體含量達到0.2～0.4mg/L。34生物技術藥物的制造進程課件5/9/20244、轉基因動物是指通過基因工程的手段對動物基因組的結構或組成進行人為的修飾，并通過相應的動物育種技術使這些經(jīng)修飾改造后的基因組在世代間得以穩(wěn)定的傳遞和表達。動物基因組中穩(wěn)定地整合含有外源性基因的動物?？梢源笕萘?、廉價地生產復雜蛋白建立轉基因動物的幾種途徑受精卵或卵細胞DNA直接顯微注射胚胎干細胞介導的基因轉移逆轉錄病毒介導的基因轉移精子介導的基因轉移和育種體細胞基因轉移和克隆35生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024

5轉基因植物通過把分離的基因與來自植物、病毒、細菌的啟動子相連接,然后再轉移到植物受體細胞內來表達，外源基因整合到植物受體細胞染色體組上并復制，從而使外源基因能在植物細胞內高效穩(wěn)定的表達。目前常用的啟動子主要是CaMV35sRNA啟動子,另外還有玉米泛素Ⅰ型啟動子和水稻肌動蛋白啟動子。內含子順序常用于外源基因在單子葉植物中的表達。在植物中表達基因產物具有誘人的前景，如表達基因工程抗體可達葉總蛋白的1.3％。可大規(guī)模生產治療和診斷用的醫(yī)用抗體。生產成本比其它任何來源抗體都要低。植物細胞的糖基化與哺乳細胞相似，但能產生一些不同哺乳細胞的糖類殘基（木糖殘基），而缺乏哺乳動物常見的末端殘基——唾液酸。

36生物技術藥物的制造進程課件5/9/202437生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024

由于轉基因植物中形成的重組蛋白質具有相對穩(wěn)定、表達量低、不易消毒、結構不易確定及翻譯修飾后造成活性差異和生物活性取決于正確結構,甚至折疊方式等特點，因此必須制定相應的安全管理條例以確保使用這些藥物和用做藥品的這些產物(藥物)的安全性和有效性。全面考慮轉基因植物的遺傳穩(wěn)定性、微生物污染、純度、產物的可比較性及環(huán)境影響和污染情況等眾多因素并且制定必要的規(guī)范化管理條例是必要的,而且這樣會積極推動本領域的研究工作。目前我國已有中國科學院、中國農業(yè)科學院基因工程安全管理辦公室等單位專門負責此方面內容的申報及安全管理工作。38生物技術藥物的制造進程課件5/9/202439生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024二、生物技術藥物制造過程的質量控制（一）原材料的質量控制原材料的質量控制主要是對目的基因、表達載體及宿主細胞的檢查1．表達載體應提供有關表達載體詳細資料，包括載體的生物學性質和來源、構建表達載體各組分的來源及性能，說明載體的結構、遺傳特性和抗生素抗性標志物等。40生物技術藥物的制造進程課件5/9/20242．目的基因

目的基因，應弄清其來源和克隆過程；加工過的基因應說明被修改過的密碼子、被切除的肽段及拼接的方法；使用PCR技術的，應說明擴增模板、引物及酶反應條件，并應證明基因結構正確無誤。

3.宿主細胞應提供宿主細胞的資料，包括細胞株（系）名稱、來源、傳代歷史、檢定結果及基本生物學特性等。

應詳細說明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞內的狀態(tài)應提供宿主和載體結合后的遺傳穩(wěn)定性資料。

41生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024該步最關健的質量控制在于保證基因的穩(wěn)定性、一致性和不被污染。1．主細胞庫（mastercellbank）

rDNA制品的生產應采用種子批（seedlot）系統(tǒng)。從已建立的主細胞庫（MasterCellBank，MCB）中，再進一步建立生產細胞庫（workingcellbank,WCB）。含表達載體的宿主細胞應經(jīng)過克隆而建立主細胞庫。應詳細記述種子材料的來源、方式、保存及預計使用壽命。應提供在保存和復蘇條件下宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性證據(jù)。采用新的種子批時，應重新作全面檢定。

（二）培養(yǎng)過程的質量控制42生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024對細胞庫進行全面的特性鑒定，包括細胞庫的來源、形式、貯藏、穩(wěn)定等。對細胞庫的質量控制往往采用細胞學方法、表型鑒定、抗生素抗性檢測、限制性內切酶圖譜測定、序列分析與穩(wěn)定性監(jiān)控等方法。

2.有限代次生產控制根據(jù)宿主細胞/載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性資料，確定在生產過程中允許的最高細胞倍增數(shù)或傳代代次，應確定廢棄批次培養(yǎng)物的指標，并應提供最適培養(yǎng)條件的詳細資料。在生產周期結束時，應監(jiān)測宿主細胞/載體系統(tǒng)的特性，例如質?？截悢?shù)、宿主細胞中表達載體存留程度、含插入基因的載體的酶切圖譜。43生物技術藥物的制造進程課件5/9/20243.連續(xù)培養(yǎng)生產控制

基本要求同有限代次生產，應提供經(jīng)長期培養(yǎng)后所表達基因的分子完整性資料，以及宿主細胞的表型和基因型特征。每批培養(yǎng)的產量變化應在規(guī)定范圍內。根據(jù)宿主/載體穩(wěn)定性及表達產物的恒定資料，應規(guī)定連續(xù)培養(yǎng)的時間。如屬長時間連續(xù)培養(yǎng)，應根據(jù)宿主/載體穩(wěn)定性及產物特性的資料，在不同培養(yǎng)間隔時間作全面檢定。44生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024（三）純化過程的質量控制常用分級沉淀、超濾、電泳、色譜等技術，以去除微量DNA、糖類、殘余宿主蛋白、純化過程帶入的有害化學物質、致熱原，或將其減少至允許量。親和層析技術應注意Ab(砹)從載體脫落而污染產物如真核細胞表達的制品反復多次使用，要求純度達98%以上；原核細胞表達的多次使用制品純度達95%以上即可；應考慮純度、純化倍數(shù)、收率，應盡量不加入對人體有害的物質，若不得不加入，應設法除凈，并在最終產物品中檢測殘留量，還要考慮到多次使用后的蓄積作用。45生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024(四)最終產品的質量控制(1)生物學效價測定：應盡量采用國際通用辦法，用國家標準品進行校正，以動物體內試驗或體外細胞培養(yǎng)法法測定制品的生物學活性，并標明其活性單位(如：1個酶活力單位是指在特定條件（25℃，其它為最適條件下，在1分鐘內能轉化1微摩爾底物的酶量，或是轉化底物中1微摩爾的有關基團的酶量)。變異性較大，必須采用標準品或對照品進行校正。（2）純度測定：世界衛(wèi)生組織規(guī)定用非還原SDS和HPLC兩種方法測定，都應達到95%以上，有些制品甚至要求達到99%。46生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024（3）藥物的比活性應測定蛋白質含量，計算出比活性，以活性單位/mg蛋白表示之，不僅是含量指標，也是純度指標。由于蛋白空間結構的改變，特別是二硫鍵的錯配，可能影響到蛋白質的生物學活性，而比活可以間接地反應這一情況。（4）理化性質鑒定A相對分子質量：分子篩層析法，還原型SDS（±10%），質譜B等電點測定：等電聚焦電泳法測定。重組藥物的等電點往往不均一，但是生產過程中批與批之間的電泳結果應一致，以此控制生產工藝。C氨基酸成份分析：采用微量氨基酸自動分析儀測定，包括甲硫氨酸，半胱氨酸及色氨酸的準確值。結果應為三次分別水解樣品測定后的平均值。在試生產的頭三批或改變工藝時必須檢測。

47生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024D部分氨基酸序列分析：中試前三批產品至少測N-端15個氨基酸；C-端1-3個AA序列

E肽譜分析：應用合適的酶或化學試劑使所選的產品片段產生不連續(xù)多肽，應用HPLC、SDS或其他適當?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠?。不同的批次肽譜應一致，是工藝穩(wěn)定性的重要驗證指標。

F吸收光譜：對同一蛋白來說，其最大吸收波長是固定的，在生產過程中每批的紫外吸收光譜應當是一致。

G免疫原性：低免疫原性是衡量生物技術藥物的質量高低的重要指標。因為由重組生成的藥物，即使其氨基酸序列與天然蛋白質一致，其免疫原性也可能由于空間結構不同而高于天然提取的多肽藥物

F鑒別試驗：將rDNA制品與天然產品通過生物學比較試驗，確定其與天然產品是一致的48生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024（5）雜質檢測A蛋白質雜質：視制造工藝而確定，可分為三大類，來源于細胞基質，來源于培養(yǎng)基，來源于下游生產工藝，如宿主蛋白，小牛血清，結構相似的雜蛋白，產物降解或冷凍等產生的變構體等。B非蛋白類雜質：主要有細菌、病毒、熱原質和DNA等病毒和細菌等微生物比蛋白質要大得多，可以采用各種過濾方法除去，終產品應遵照中國生物制品規(guī)程進行病毒污染檢查和無菌試驗。熱原質的檢查用注射家兔法或鱟（hou,甲殼類動物）試驗法殘留DNA測定：DNA含量<100pg/劑量，通常采用核酸雜交或利用高親和力的DNA蛋白進行測定，前者對針對有特異序列的DNA，而后者對所有序列的DNA都可以檢出。49生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024生物技術藥物的質量控制:參照現(xiàn)行國家藥典上同類或相近產品,制訂出產品質量檢定規(guī)程,并與國家食品藥品監(jiān)督管理局指定的藥品檢測機構保持密切合作。在現(xiàn)行國家藥品法規(guī)制度下,確保產品安全有效,并考慮到放大生產時可能出現(xiàn)的問題,導致產品檢測指標產生差異的可能性，根據(jù)產品特點和實驗情況制訂出合理的控制指標并確定好相應的檢測方法。在檢測項目中,如果現(xiàn)有藥典上的方法不能有效地進行檢測時,要與藥品檢測機構的專家進行有效的交流,提出合理的檢測方法或從國外相關藥典上選擇,并提供充分的試驗數(shù)據(jù),使產品質量檢定規(guī)程各項控制指標切實可行。若要確定蛋白質分子結構的均一性,還要對蛋白質分子進行紫外光譜，圓二色譜，核磁共振，及熒光光譜分析等50生物技術藥物的制造進程課件5/9/202451生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024第三節(jié)生物技術藥物的穩(wěn)定性蛋白質類藥物因其分子具有嚴格的三維結構，所以其生物活性不僅取決于其分子的一級結構，還與其空間結構的完整性密切相關。有兩個主要因素影響它們的穩(wěn)定性：①化學上的不穩(wěn)定性，由多種因素引起的對蛋白質分子的化學基團進行化學修飾，引起原有化學鍵的斷裂或形成新的價鍵形式。主要有：氧化作用，脫酰胺作用，水解作用，外消旋作用，β-消去反應等。②物理的不穩(wěn)定性。主要是涉及到更高級空間結構的改變，包括蛋白質分子二級或高級空間結構的改變，這些改變的引起因素如：溫度，pH等蛋白質類藥物的物理性或化學性的降解可能發(fā)生在多種不同環(huán)節(jié)，包括制造生產過程、純化操作過程、處方制劑及貯存流通使用過程。52生物技術藥物的制造進程課件5/9/202453生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024

不穩(wěn)定氨基酸殘基的化學降解途徑不穩(wěn)定氨基酸殘基基本化學反應Asn，Gln脫酰胺、外消旋作用、異構化Asp水解作用、外消旋作用、異構化Met，Cys氧化作用His，Trp，Tyrβ-消去反應Ser，Thr，Cys外消旋化Cys二硫鍵交換54生物技術藥物的制造進程課件5/9/2024一、生物技術藥物的化學穩(wěn)定性氨基酸的側鏈是不穩(wěn)定性：Asn賴氨酸，Asp天冬氨酸，Cys半胱氨酸，Gln谷氨酰胺，His組氨酸，Lys賴氨酸，Met甲硫氨酸，Phe亮氨酸，Ser絲氨酸，Thr蘇氨酸，Trp色氨酸和Tyr絡氨酸等殘基的側鏈常易發(fā)生各種化學反應，含不穩(wěn)定側鏈的氨基酸殘基常?？赏ㄟ^非酶促反應，使共價鍵斷裂或對分子進行共價修飾。55生物技術藥物的制造進程課件5/9/20241、水解作用（1）一般酸、堿、蛋白酶的水解（2）-X-Asp天冬氨酸-Y，含有Asp殘基，在稀酸中更易水解（3）水解作用也常發(fā)生在蛋白質的酰胺鍵，Asn賴氨酸,Gln谷氨酰胺。（4）N末端臨近Pro和Ser和Thr也易發(fā)生水解。蛋白質水解后發(fā)生的質量和大小變化可用HPLC，HPCE(高效毛細管電泳技術)，SEC（尺寸排阻層析）進行分析，用SDS及MS分析不同的水解片段。

56生物技術藥物的制造進程課件5/9/20242氧化作用主要原因有兩種：一是氧化劑的污染如在H2O2、多種過氧酸，N-氯代或溴代琥珀酰胺，過碘酸，碘等氧化劑的作用下；二是自身的自發(fā)氧化。Met、Cys、His、Trp、Tyr等最易氧化。含有Met和Cys殘基的側鏈極易發(fā)生氧化反應。含有芳香族側鏈的氨基酸殘基如His、Trp、Tyr殘基的蛋白質類藥物在純化與貯藏過程中也易發(fā)生氧化反應，導致芳香環(huán)的破裂。蛋白質的氧化作用還受到微量過渡金屬離子的催化，光照也可增加其氧化作用。氧分壓，溫度和緩沖液也對氧化作用有影響。發(fā)生氧化作用后的產品疏水性增加或極性增強，可用RP-HPLC分析，氧化產品比天然產品先洗脫下來。還可通HPCE，SEC（尺寸排阻層析），SDS分析。57生物技術藥物的制造進程課件5/9/20243脫酰胺作用只有兩種氨基酸Asn和Gln其側鏈含有酰胺鍵，因此只有含這兩種氨基酸殘基的蛋白質才會發(fā)生脫酰胺作用。Asn和Gln可以水解生成羧酸和氨，同時轉變?yōu)锳sp和Glu，此反應取決于環(huán)境的pH。提高pH、溫度和離子強度都可能增加脫酰胺作用。Asn-Gly具有最高脫酰胺速率，位于分子表面的酰胺基團也比分子內部的酰胺基團易水解。脫酰胺后蛋白質疏水性及極性發(fā)生變化，質量減少電荷增加，因此可分別用反相，質譜或NMR進行分析58生物技術藥物的制造進程課件5/9/20244消旋作用消旋作用是在一個以上的不對稱中心發(fā)生的構型改變。蛋白質的外消族作用是其L-氨基酸殘基轉化為D-氨基酸殘基，這種構型的改變，并不改變蛋白質的整體骨架結構，但其分子的局部構型已發(fā)生改變，整個分子的構象也已改變，使側鏈與側鏈的相互作用發(fā)生變化。消旋作用的發(fā)生取決于堿催化α-碳質子離子化成為負碳離子中間體，進而使氨基酸由L型轉為D型。除甘氨酸外，堿催化消旋反應對