棉花品種真實(shí)性鑒定 SSR 分子標(biāo)記法

附件3：

ICS:

ICS

B21

NY

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

NY/T

棉花品種真實(shí)性鑒定SSR分子標(biāo)記法

SSR-basedmethodsforvarietygenuinenesstestingof

Gossypiumspp

（征求意見(jiàn)稿）

××××-××-××發(fā)布××××-××-××實(shí)施

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布

[鍵入文字]

目次

1范圍1

2規(guī)范性引用文件1

3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)1

4總則錯(cuò)誤！未定義書(shū)簽。

5檢測(cè)方案2

6儀器設(shè)備、試劑和溶液配制5

7真實(shí)性檢測(cè)程序6

8結(jié)果計(jì)算與表示9

9結(jié)果報(bào)告10

附錄A（規(guī)范性附錄）溶液配制11

附錄B（規(guī)范性附錄）等位變異擴(kuò)增片段信息13

附錄C（資料性附錄）引物分組信息19

附錄D（資料性附錄）參照樣品名單20

I

[鍵入文字]

前言

本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

請(qǐng)注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容有可能涉及專(zhuān)利。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不應(yīng)承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種業(yè)管理司提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)農(nóng)作物種子標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC37)歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：

II

棉花品種真實(shí)性鑒定SSR分子標(biāo)記法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用SSR分子標(biāo)記法進(jìn)行棉花(Gossypiumspp)品種真實(shí)性檢測(cè)的原則、檢測(cè)方案、檢

測(cè)程序和結(jié)果報(bào)告。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于陸地棉（G.hirsutum）和海島棉（G.barbadense）品種真實(shí)性驗(yàn)證和品種真實(shí)性身份

鑒定，不適用于實(shí)質(zhì)性派生品種（EDV）的鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本

文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T3543.1農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程總則

GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)

3.1術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1.1品種真實(shí)性驗(yàn)證varietyverification

與其對(duì)應(yīng)品種名稱(chēng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，檢測(cè)證實(shí)供檢樣品品種名稱(chēng)與標(biāo)注是否相符。

3.1.2品種真實(shí)性身份鑒定varietyidentification

經(jīng)分子技術(shù)檢測(cè)并通過(guò)相應(yīng)品種指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)篩查比較，確定供檢樣品的真實(shí)品種名稱(chēng)。

3.1.3標(biāo)準(zhǔn)樣品standardsample

國(guó)家指定機(jī)構(gòu)保存的代表品種特征特性的實(shí)物樣品或DNA樣品。

3.1.4SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)SSRfingerprintblastplatform

采用SSR標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化方法對(duì)品種標(biāo)準(zhǔn)樣品的等位變異進(jìn)行檢測(cè)，并運(yùn)用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)技術(shù)和網(wǎng)

絡(luò)信息技術(shù)所構(gòu)建的審定品種分子數(shù)據(jù)信息的檢索比對(duì)載體。

3.1.5參照樣品referencecontrolsample

具有SSR位點(diǎn)上主要等位變異的品種，用于輔助確定試驗(yàn)樣品的等位變異，校正儀器設(shè)備的系統(tǒng)

誤差。

3.1.6引物primer

一條互補(bǔ)結(jié)合在模板DNA鏈上的短單鏈，能提供3’-OH末端作為DNA合成的起始點(diǎn)，延伸合成模

板DNA的互補(bǔ)鏈。

3.1.7組合引物panel

具有不同熒光顏色或相同熒光顏色而擴(kuò)增片段大小不同、能夠組合在一起進(jìn)行電泳的一組熒光標(biāo)

記引物。

3.2縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

bp:堿基對(duì)（basepair）

CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammoniumbromide）

DNA:脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

dNTPs:脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

PAGE:聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis）

PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）

SSR:簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simplesequencerepeat）

Taq酶:耐熱DNA聚合酶（Taq-DNApolymerase）

4原理

棉花不同品種的基因組存在著能夠世代穩(wěn)定遺傳的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)的重復(fù)次數(shù)差異。這種差

異可以通過(guò)從有代表性的供檢樣品中提取DNA，用SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增和電泳檢測(cè)出來(lái)，因此可以利

用擴(kuò)增片段大小不同區(qū)分品種。

依據(jù)SSR標(biāo)記檢測(cè)原理，采用SSR引物，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較或與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比對(duì)的

方式，對(duì)品種真實(shí)性進(jìn)行驗(yàn)證或身份鑒定。真實(shí)性驗(yàn)證依據(jù)SSR位點(diǎn)差異數(shù)目而判定，品種真實(shí)性

身份鑒定依據(jù)被檢SSR位點(diǎn)無(wú)差異原則進(jìn)行篩查和鑒定。

5檢測(cè)方案

5.1總則

對(duì)于真實(shí)性鑒定，引物、檢測(cè)平臺(tái)、樣品狀況不同，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度、精確度可能有所不同。

應(yīng)依據(jù)“適于檢測(cè)目的”的原則，統(tǒng)籌考慮檢測(cè)規(guī)模和檢測(cè)能力，擇定適宜的檢測(cè)平臺(tái)、樣品狀況，制

定相應(yīng)的檢測(cè)方案。

在嚴(yán)格控制條件下，合成選擇的引物，按照確定的檢測(cè)平臺(tái)對(duì)供檢樣品按DNA提取、PCR擴(kuò)增、

電泳、數(shù)據(jù)分析的程序進(jìn)行檢測(cè)。

按規(guī)定要求填報(bào)檢測(cè)結(jié)果，檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)注明檢測(cè)方案所選擇的影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵信息。

DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳的技術(shù)條件要求，在適于檢測(cè)目的和不影響檢測(cè)質(zhì)量的前提下，按照

檢測(cè)平臺(tái)的要求，允許對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定做適當(dāng)調(diào)整。

5.2檢測(cè)平臺(tái)

5.2.1品種真實(shí)性驗(yàn)證可采用變性PAGE垂直板電泳或者毛細(xì)管電泳，宜在同一電泳板上比較試驗(yàn)樣品

和標(biāo)準(zhǔn)樣品，亦可與標(biāo)準(zhǔn)樣品指紋比對(duì)；真實(shí)性身份鑒定，宜采用毛細(xì)管電泳。利用SSR指紋數(shù)據(jù)比

對(duì)平臺(tái)進(jìn)行鑒定。

5.2.2對(duì)于試驗(yàn)樣品數(shù)量較多的，可將組織研磨儀、DNA自動(dòng)提取、自動(dòng)移液工作站、高通量PCR擴(kuò)增

儀、DNA分析儀進(jìn)行組合，以提高檢測(cè)的綜合效率。

5.3引物

5.3.1本標(biāo)準(zhǔn)遴選了60對(duì)SSR引物作為品種真實(shí)性驗(yàn)證和身份鑒定的檢測(cè)引物，具體見(jiàn)表1。

表1引物信息

引物染色體退火溫度

編號(hào)引物序列（5’—3’）

名稱(chēng)（編號(hào)）（℃）

正向：CCACCAGCCTTACCTTATACGC

PC01CCRI0011A60反向：GTGCTTGGCCTCGCTAAGTG

正向：AGTCCTCCCACTATTCGAAGCT

PC02CCRI0022A60反向：ATGCCTCGTACCCTGTTCCG

正向：CACGACGACTCTTCCTCATCAC

PC03CCRI0033A60反向：ATTGCAGCCACGAAATTGTCAC

正向：AGGCTCGCATTGTTGACACTAGG

PC04CCRI0044A60反向：CGAGCTTGAACGAACGAACCTCT

正向：TCGATTCACCGATCTGACAAGC

PC05CCRI0055A60反向：TGACCCAGACCGACCGTTG

正向：ACCAGGTCGGTAACGATAGGC

PC06CCRI0066A60反向：GCCCAAAGTTGAAGCGGAAAAC

正向：GTATGTCCAATCGCCACCCTAG

PC07CCRI0076A60反向：GATGACGGTGTTAGGCGGTTC

正向：GGCCTCCCATCTTTATCCAATGT

PC08CCRI0087A60反向：AGCAAAGCAAACTCGACAATGCT

正向：TTGGGCGGTTTGGGTCAAGG

PC09CCRI0098A60反向：GGGATTCGGTCGGACACTCAAG

正向：GCCGGTAAGTCCAACATAAGGG

PC10CCRI0109A60反向：CGGGGTAGTCCACCTCCTATTG

正向：ACTACGCAACTGAAGGGTTTCG

PC11CCRI01110A60反向：GCTGCAAGGTTCGATGGAAGTG

正向：CTGCCTCGACCTACAGTTTGAC

PC12CCRI01211A60反向：AGTTTTAGGCGGTTTGGGTTTG

正向：ACCATCCTTGCCGAGTAACCTG

PC13CCRI01312A60反向：GTTGATGCCTGGGTCTCAATGC

正向：AGACGTGAGTTCGAGGACTTTG

PC14CCRI01412A60反向：GCCTACCCTCTCAACAGTTTGG

正向：TTTCACTTGTCCGACCTTACCC

PC15CCRI01513A60反向：GGATATGTGTTTGAGCGTGCTG

正向：CGAAAGAGTGTCGAGCAATCCG

PC16CCRI0161D60反向：TCCTGTCAACTTGGAGGCTGAG

正向：CGCCACATGACCCCACCATC

PC17CCRI0172D60反向：CCCACCGAGTATACAGGACACG

正向：CCGCTCGGTTCAACAGGTTT

PC18CCRI0183D60反向：AGAGTTTGCGGTTTTGGTGCC

正向：CCAGCCACTCGGAGATCCTTG

PC19CCRI0193D60反向：GCGTGGAGAAACCAGAGGGTAG

正向：ACCACTTTGTCCACCTGTCCAC

PC20CCRI0204D60反向：ATCATCGCCATCTGCCTGGAAG

正向：AATTGAACCAAGGGCATCATGC

PC21CCRI0215D60反向：GAACCTGATTGACGGGTAGCAC

正向：TGATGTTGGCGGGACTATGTAG

PC22CCRI0226D60反向：CGACTTCACCCTCGTGGTAATC

正向：CTTCCCCACGCCACTACTATCG

PC23CCRI0237D60反向：CTCAGCTTTCCTCCTCATTGGC

正向：ACGAGGGAACATGTGATCTCCT

PC24CCRI0247D60反向：TCACTCCAAATCACACGTGCCA

正向：ACCAGCATCCTTTGTGTTAGGC

PC25CCRI0258D60反向：GGATCGATTTTGGAACCGTGTG

正向：TTCCATGAGGCTATCCACAAGC

PC26CCRI02610D60反向：AATGCACCGCACCCCATCAC

正向：GCGGGCCACCTAATGATGATTG

PC27CCRI02711D60反向：TTGTTTGACGAGGGAGACGATC

正向：ACAAGCGCGTCTGCCATATCC

PC28CCRI02811D60反向：CGTGGTGGGTAGTCACAGTCAG

正向：ACACTGATGTGGCATCGACTAG

PC29CCRI02912D60反向：GAATCTGGGCAAACTGTTGTCC

正向：GCCGAGGCCCCTATAACCC

PC30CCRI03013D60反向：CTCATATCACGCACCACACCAC

正向：CCGGTTCAAGCCGACTATTCG

PC31CCRI0311A60反向：ACTCGTAACACCGTGCTGATTG

正向：CTGAGGAGAAAGACAGGACGAC

PC32CCRI0321A60反向：TGGCGGGGTAAATGTGAATGC

正向：TGGGTGAGTGTGAGGACTGAAG

PC33CCRI0333A60反向：TGGGTGTTGCACAAAGTTTCTG

正向：GTGGGCAGCGATGAATATGATG

PC34CCRI0343A60反向：ATGAGGGTCATTGCTTGGGTTG

正向：GCCGTTTCTGCCAACCCCTT

PC35CCRI0354A60反向：CGGGATTCCACGTGCCCAAA

正向：CGTCTCGTCCCACCTGTAATGC

PC36CCRI0365A60反向：GGACTTCGGCAAGGCGGTTC

正向：TTCCTGCAAAATTGCCTTCACC

PC37CCRI0377A60反向：TGCTTTGATATCCCCGTGATGG

正向：AGGGACAAGAATGGACCGACAG

PC38CCRI0387A60反向：TTAACCGTCGCAGCCTCCTAAC

正向：TGCCCTTCTTGCCCCTGTG

PC39CCRI0398A60反向：GCTTGCCTAATTTGGTGGGAAG

正向：TTACTCTGGGCGTGTGGCATAG

PC40CCRI0409A60反向：ATGGAAGGAACAGCAGCAAACG

正向：TGTGGCTCCATGGCACAATATG

PC41CCRI04110A60反向：AGGCTCTGTTGCACCAATTCAC

正向：GTTGGAGGCTGCTTTTGATGGG

PC42CCRI04211A60反向：TGCCATTGCCATGTTGGTCAAG

正向：GGACAAACATGGCCCCAACT

PC43CCRI04311A60反向：TGTCCAAACTCTTGCCAACTTGT

正向：TCTTAGGGCACAATGAGGCAAGA

PC44CCRI04412A60反向：CTAAGCAGCACCTCATCCAGAAA

正向：AACTCAATGGGTGTCGGTTACG

PC45CCRI04513A60反向：GGAGGTGAGCTATCTTCGCAAC

正向：AGCACGGAAGAACATGATGAGG

PC46CCRI04613A60反向：CGTCTTCGGCTCAAATGTGTGC

正向：TGCCCAACCTACATGTGACACA

PC47CCRI0471D60反向：TCAAATTTGGTTGTCACACCCCA

正向：CCACATGCCACGCCGTATTATG

PC48CCRI0481D60反向：ATGATGGGGTGGGCTGTAAAGG

正向：TTGGGCCGAAAAGGGTTGAAAC

PC49CCRI0492D60反向：GGTCGGATTCTGGGCACTTTTC

正向：AGTTCGGTGGACATCAATAGGC

PC50CCRI0502D60反向：TCCCCAGGGCTTTGAGAATACC

正向：CGCCACATCCAAGGGTGAATG

PC51CCRI0514D60反向：GGAATTGCGGTCCCAATACCAC

正向：ATTCATGGTCAAGTCGGGTCAC

PC52CCRI0525D60反向：GCTTGCTTTGGGTGGAGTAGAC

正向：GTTGCTGTGGAGTGGAGTGGAG

PC53CCRI0535D60反向：TTCGAGGGAGGTTGGTATTGGC

正向：TGGCTTTGCTTTGCTTATGGTGA

PC54CCRI0546D60反向：TGCACTCAACTGGACACACTTT

正向：AATTGTGGAGGGGCACTGTCAG

PC55CCRI0557D60反向：GTCCCCGCCATCCAAGCAC

正向：GACTCATGGCGACAGCGATTAG

PC56CCRI0568D60反向：TGATCACTCAAACGGTGTCACG

正向：GTTTCCACCGTCGAACCACTG

PC57CCRI05710D60反向：GGCAGGATTAGGAGATCGAAGC

正向：TCAGGGGCTCCGTCGTTCTC

PC58CCRI05810D60反向：CTCGGCTCTTTCTCCGGTTGC

正向：AGTACCCCTATTTTCCCGTGAGA

PC59CCRI05912D60反向：TGGGTCTCACATGTGGATTGTTG

正向：GGAAATGGCCCATCTGAGAGTC

PC60CCRI06013D60反向：GCCAGGAGATCGGAGCGTTTG

注：本表中60對(duì)引物均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所通過(guò)基因組重測(cè)序自主開(kāi)發(fā)遴選。

5.3.2品種真實(shí)性身份鑒定可采用序貫方式，也可直接采用表1的60對(duì)SSR引物進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)比較后仍

與已知品種沒(méi)有位點(diǎn)差異而無(wú)法得出結(jié)論的，允許采用其它能夠區(qū)分的分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。

5.3.2品種真實(shí)性鑒定采用表160對(duì)SSR引物構(gòu)建試驗(yàn)樣品指紋，與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比較篩查與試

驗(yàn)樣品指紋一致的品種。

5.4樣品

5.4.1送驗(yàn)樣品種子重量應(yīng)不低于50g或不少于500粒；送驗(yàn)樣品為棉鈴、幼苗、葉片等組織或器官，

數(shù)量應(yīng)不低于70個(gè)（分別來(lái)自不同個(gè)體）。

6.4.2從送驗(yàn)樣品中分取有代表性的試樣，采用混合樣或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)。混合樣試來(lái)源應(yīng)至少含有

70個(gè)個(gè)體，單個(gè)個(gè)體試樣應(yīng)至少含有30個(gè)個(gè)體。

5.5檢測(cè)條件

真實(shí)性鑒定應(yīng)在有利于檢測(cè)正確實(shí)施的控制條件下進(jìn)行，包括但不限于下列條件：

——種子檢驗(yàn)員熟悉所使用檢測(cè)技術(shù)的知識(shí)和技能；

——所有儀器與使用的技術(shù)相匹配，并已經(jīng)過(guò)定期維護(hù)、驗(yàn)證和校準(zhǔn)；

——使用適當(dāng)?shù)燃?jí)的試劑和滅菌處理的耗材；

——使用校準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果評(píng)定的適宜參照品種。

6儀器設(shè)備、試劑和溶液配制

6.1儀器設(shè)備

6.1.1DNA提取

高速冷凍離心機(jī)、水浴鍋或干式恒溫金屬浴、紫外分光光度計(jì)或核酸濃度測(cè)定儀、組織研磨儀。

6.1.2PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增儀或水浴PCR擴(kuò)增裝置。

6.1.3電泳

6.1.3.1毛細(xì)管電泳

基因測(cè)序儀。

6.1.3.2變性PAGE垂直板電泳

高壓電泳儀、垂直板電泳槽及制膠附件、膠片觀察燈、凝膠成像系統(tǒng)或數(shù)碼相機(jī)。

6.1.3.3其它器具

微量移液器、電子天平、高壓滅菌鍋、加熱磁力攪拌器、冰箱、染色盒。

6.2試劑

6.2.1DNA提取

CTAB、SDS、苯酚、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2?2H2O）、三羥

甲基氨基甲烷（Tris-base）、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉，β-巰基乙醇（β-Mercaptoethanol）、乙醇(70%)。

6.2.2引物合成

根據(jù)真實(shí)性驗(yàn)證或身份鑒定的要求，采用序貫式方法，選定表1的引物。選用變性PAGE垂直板電

泳，只需合成普通引物。選用熒光毛細(xì)管電泳，需要在上游或下游引物的5’端標(biāo)記與毛細(xì)管電泳儀發(fā)

射和吸收波長(zhǎng)相匹配的熒光染料。具體引物分組信息可參考附錄C。

6.2.3PCR擴(kuò)增

2+

dNTPs、Taq酶、10×緩沖液、礦物油、ddH2O、引物和Mg。

6.2.4電泳

6.2.4.1毛細(xì)管電泳

與使用的基因測(cè)序儀型號(hào)相匹配的分離膠、分子量?jī)?nèi)標(biāo)、去離子甲酰胺、電泳緩沖液。

6.2.4.2變性PAGE垂直板電泳

去離子甲酰胺（Formamide）、溴酚藍(lán)（BrphBlue）、二甲苯青（FF）、甲叉雙丙烯酰胺（Bisacrylamide）、

丙烯酰胺（Acrylamide）、硼酸（BoricAcid）、尿素、親和硅烷（BindingSilane）、疏水硅烷（Repel

Silane）、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、無(wú)水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、過(guò)硫酸銨（APS）、冰醋酸、乙

酸銨、硝酸銀、甲醛、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2?2H2O）.

6.3溶液配制

DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳、銀染的溶液按照附錄A（規(guī)范性附錄）規(guī)定的要求進(jìn)行配制，所用

試劑均為分析純。

試劑配制所用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水的要求，其中銀染溶液的配制可以使用符合三級(jí)

要求的水。

7檢測(cè)程序

7.1DNA提取

7.1.1SDS法

試樣種子充分研磨后，取100～200mg種子粉末置于2.0mL離心管，每管加入700μL的SDS提取液，

混勻。65℃水浴30min，期間多次輕緩顛倒混勻。每管加入等體積的苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）混合

液，上下顛倒混勻至不分層，12,000rpm離心10min。吸取上清液，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛

倒混勻至絮狀DNA成團(tuán)析出。用剪口槍頭吸取DNA，轉(zhuǎn)移至盛有70%乙醇的離心管中洗滌一次，無(wú)水

乙醇再洗滌一次，自然條件下干燥，加入200μL超純水或TE緩沖液，充分溶解后4℃?zhèn)溆谩?/p>

7.1.2CTAB法

取試樣的幼苗或葉片約100～200mg置于2.0mL離心管，液氮冷卻后充分研磨，每管加入700μL經(jīng)

65℃預(yù)熱的CTAB提取液，充分混勻，65℃水浴30min。期間多次輕緩顛倒混勻。每管加入等體積的三

氯甲烷/異戊醇（24:1）混合液，充分混合后12,000rpm離心10min。吸取上清液，加入等體積預(yù)冷的異

丙醇，輕輕顛倒混勻至絮狀DNA成團(tuán)析出。用剪口槍頭吸取DNA，轉(zhuǎn)移至盛有70%乙醇的離心管中洗

滌一次，無(wú)水乙醇再洗滌一次，自然條件下干燥，加入200μL超純水或TE緩沖液，充分溶解后備用。

7.1.3試劑盒法

選用適宜SSR標(biāo)記法的商業(yè)試劑盒，并經(jīng)驗(yàn)證合格后使用。DNA提取方法，按照試劑盒提供的使

用說(shuō)明進(jìn)行操作。

注:DNA提取可選8.1.1、8.1.2、8.1.3或其它達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的方法。

7.2PCR擴(kuò)增

7.2.1反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積和組分的終濃度參照表2進(jìn)行配制，可以依據(jù)試驗(yàn)條件不同作相應(yīng)調(diào)

整。

表2PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

反應(yīng)組分原濃度終濃度推薦反應(yīng)體積（20L）

ddH2O－－13.0

10×緩沖液

(含25mmol/L10×1×2.0

MgCl2)

dNTPs2.5mmol/Leach0.2mmol/Leach1.6

Taq酶5U/L1U/μL0.2

正向引物20mol/L0.1mol/L0.1

反向引物20mol/L0.1mol/L0.1

DNA40ng/L6.0ng/L3.0

7.2.2反應(yīng)程序

反應(yīng)程序中各反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)PCR擴(kuò)增儀型號(hào)、酶等不同而作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。通常采用下列反應(yīng)程

序：

a)預(yù)變性：94℃5min；

b)擴(kuò)增：94℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共32次循環(huán)；

c)終延伸：72℃10min。

擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃保存。

7.3擴(kuò)增產(chǎn)物分離

7.3.1毛細(xì)管電泳

7.3.1.1按照預(yù)先確定的組合引物，等體積取同一組合引物的不同熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，充分混勻。從

混合液中吸取1L，加入到基因測(cè)序儀專(zhuān)用96孔上樣板上。每孔再分別加入0.15L分子量?jī)?nèi)標(biāo)和8.85

L去離子甲酰胺，95℃變性5min，冷卻10min以上，瞬時(shí)離心10s后備用。

7.3.1.2打開(kāi)基因測(cè)序儀，檢查儀器工作狀態(tài)和試劑狀態(tài)。

7.3.1.3將裝有樣品的96孔上樣板放置于樣品架基座上，將裝有電極緩沖液的buffer板放置于buffer板

架基座上，打開(kāi)數(shù)據(jù)收集軟件，按照基因測(cè)序儀的使用手冊(cè)進(jìn)行操作?；驕y(cè)序儀將自動(dòng)運(yùn)行參數(shù)，

并保存電泳原始數(shù)據(jù)。

7.3.2變性PAGE垂直板電泳

7.3.2.1制膠

沾洗滌靈用清水將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，再用去離子水、無(wú)水乙醇分別擦洗兩遍。玻璃板干燥后，

將1mL親和硅烷工作液，均勻涂在無(wú)凹槽的玻璃板上；將1mL疏水硅烷工作液，均勻涂在帶凹槽的玻

璃板上。操作過(guò)程中兩塊玻璃板分別處理，防止相互污染；玻璃板徹底干燥后，將塑料隔條整齊放在

無(wú)凹槽玻璃板兩側(cè)，蓋上凹槽玻璃板，夾子固定后，用水平儀檢測(cè)玻璃膠室是否水平；取60mL6%PAGE

膠，加入100L的TEMED和200L10%過(guò)硫酸銨（過(guò)硫酸銨的用量與溫度成反比，需根據(jù)溫度調(diào)整用

量），迅速混勻，將膠灌入玻璃膠室，灌膠過(guò)程應(yīng)防止氣泡的出現(xiàn)。待膠室灌滿后，在凹槽處將鯊魚(yú)

齒朝外輕輕插入樣品梳，在室溫下聚合1h以上，輕輕拔出梳子，用清水洗干凈備用。

7.3.2.2變性

取20l擴(kuò)增產(chǎn)物，加入5L的6×加樣緩沖液，混勻。95℃變性5min，4℃冷卻10min后備用。

7.3.2.3電泳

7.3.2.3.1將清洗后的膠板安裝于電泳槽上，在電泳正極槽（下槽）與負(fù)極槽（上槽）各加入800mL的

1×TBE緩沖液，拔出樣品梳，90W恒功率預(yù)電泳10~20min。用移液器吹吸加樣槽，清除氣泡與雜質(zhì)，

插入樣品梳。每一個(gè)加樣孔加入5L變性樣品（見(jiàn)7.4.2.2）,90W恒功率電泳。

7.3.2.3.2電泳的適宜時(shí)間參考二甲苯青指示帶移動(dòng)的位置和擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期片段大小范圍（參見(jiàn)表B.1）

加以確定。二甲苯青指示帶在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中移動(dòng)的位置與230bp擴(kuò)增產(chǎn)物泳動(dòng)的

位置大致相當(dāng)。100~200bp擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳時(shí)間約為35min；200~300bp擴(kuò)增產(chǎn)物電泳時(shí)間約為40min，

300~450bp擴(kuò)增產(chǎn)物電泳時(shí)間約為50min。電泳結(jié)束后關(guān)閉電源，取下玻璃板并輕輕撬開(kāi)，凝膠附著在

無(wú)凹槽的玻璃板上。

7.3.2.4染色

將粘有凝膠的長(zhǎng)玻璃板浸入“固定液”中輕輕晃動(dòng)5min；去離子水快速漂洗1次；“染色液”中染色5

min～10min；去離子水快速漂洗1次；“顯影液”中輕輕晃動(dòng)至帶紋出現(xiàn)；“固定液”中定影5min；去離

子水漂洗后晾干膠板，放在膠片觀察燈上觀察記錄結(jié)果，用數(shù)碼相機(jī)或凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

注：固定液、染色液、去離子水和顯影液的用量，可依據(jù)膠板數(shù)量和大小調(diào)整，以沒(méi)過(guò)膠面為準(zhǔn)。

7.4數(shù)據(jù)分析

7.4.1總則

電泳結(jié)果需要通過(guò)規(guī)定程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析降低誤讀率。在引物等位變異片段大小范圍內(nèi)（參見(jiàn)表

B.1），對(duì)于毛細(xì)管電泳，特異峰呈現(xiàn)為穩(wěn)定的單峰或連續(xù)峰型；對(duì)于變性PAGE垂直板電泳，特異譜

帶呈現(xiàn)穩(wěn)定的單譜帶或連續(xù)譜帶。

注：當(dāng)出現(xiàn)非純合SSR位點(diǎn)時(shí)，毛細(xì)管電泳中會(huì)呈現(xiàn)兩個(gè)單峰或兩個(gè)連續(xù)峰，在變性PAGE垂直板電泳中會(huì)顯示為

穩(wěn)定的兩種單譜帶或兩種連續(xù)譜帶。

7.4.1.1對(duì)于毛細(xì)管電泳，由于不同引物擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)不同、引物不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增、試驗(yàn)條件干擾等因素，

可能出現(xiàn)不同狀況的峰型，按照以峰高為主、兼顧峰型的原則依據(jù)下列規(guī)則進(jìn)行甄別、過(guò)濾處置：

1)對(duì)于連帶（pull-up）峰，即因某一位置某一顏色熒光的峰值較高而引起同一位置其它顏色熒

光峰值升高的，應(yīng)預(yù)先將其干擾消除后再進(jìn)行分析；

2)對(duì)于（n+1）峰，即同一位置出現(xiàn)兩個(gè)相距1bp左右的峰，應(yīng)視為單峰；

3)對(duì)于連續(xù)多峰，即峰高遞增或峰高接近的相差一個(gè)重復(fù)序列的連續(xù)多個(gè)峰，應(yīng)視為單峰，取

其最右邊的峰，峰高值為連續(xù)多個(gè)峰的疊加值；

4)對(duì)于高低峰，應(yīng)通過(guò)設(shè)定一定閾值不予采集低于閾值的峰；

5)對(duì)于有2個(gè)及以上特異峰，應(yīng)考慮是由非純合SSR位點(diǎn)或混入雜株所致。

注：當(dāng)存在非純合SSR位點(diǎn)時(shí)，將會(huì)有兩個(gè)特異峰，此時(shí)需要采集兩個(gè)峰值。

7.4.1.2對(duì)于變性PAGE垂直板電泳，位于相應(yīng)等位變異擴(kuò)增片段大小范圍之外的譜帶需要甄別是非特

異性擴(kuò)增還是新增的稀有等位變異。采用單個(gè)個(gè)體擴(kuò)增的產(chǎn)物，出現(xiàn)3種及3種以上的多帶則為非特

異性擴(kuò)增；采用混合樣提取的，某些位點(diǎn)出現(xiàn)3種及3種以上的譜帶或上下有弱帶等情況出現(xiàn)時(shí)，則

需要通過(guò)單個(gè)個(gè)體進(jìn)行甄別。

7.4.1.3采取混合樣檢測(cè)時(shí)，無(wú)論是毛細(xì)管電泳還是變性PAGE垂直板電泳，結(jié)果表明在引物位點(diǎn)出現(xiàn)

異質(zhì)性而影響差異位點(diǎn)判定時(shí)，應(yīng)采用單個(gè)個(gè)體獨(dú)立檢測(cè)，試樣至少含有30個(gè)個(gè)體。

7.4.2數(shù)據(jù)分析和讀取

7.4.2.1毛細(xì)管電泳

導(dǎo)出電泳原始數(shù)據(jù)文件，采用數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行甄別。

a)設(shè)置參數(shù)：在數(shù)據(jù)分析軟件中預(yù)先設(shè)置好panel、分子量?jī)?nèi)標(biāo)、panel的相應(yīng)引物的Bin（等位

變異片段大小范圍區(qū)間）；

b)導(dǎo)入原始數(shù)據(jù)文件：將電泳原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入分析軟件，選擇panel、分子量?jī)?nèi)標(biāo)、Bin、質(zhì)

量控制參數(shù)等進(jìn)行分析；

c)甄別過(guò)濾處置數(shù)據(jù)：執(zhí)行7.5.1的規(guī)定。

數(shù)據(jù)比對(duì)采用7.5.3.1、7.5.3.2方式的，應(yīng)分別通過(guò)同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)樣品、參照樣品（依據(jù)引物

選擇少量的對(duì)照），校準(zhǔn)不同電泳板間的數(shù)據(jù)偏差后再讀取擴(kuò)增片段大小。甄別后的特異峰落入Bin范

圍內(nèi)，直接讀取擴(kuò)增片段大小；若其峰大多不在Bin范圍內(nèi)，可將其整體平移盡量使峰落入Bin設(shè)置范

圍內(nèi)后讀取數(shù)據(jù)。

7.4.2.2變性PAGE垂直板電泳

對(duì)甄別后的特異譜帶（見(jiàn)7.5.1）進(jìn)行讀取。擴(kuò)增片段大小的讀取，統(tǒng)一采用兩段式數(shù)據(jù)記錄方式。

純合位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為X/X，非純合位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為X/Y（其中X、Y分別為該位點(diǎn)兩個(gè)等位基因擴(kuò)增片

段），小片段數(shù)據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后，缺失位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為0/0。

7.4.3數(shù)據(jù)比對(duì)

7.4.3.1采用與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較的，對(duì)甄別后的特異峰，按照在同一電泳板上的供檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品逐個(gè)

位點(diǎn)進(jìn)行兩兩比較，確定其位點(diǎn)差異。

7.4.3.2采用毛細(xì)管電泳與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比對(duì)的，按照數(shù)據(jù)導(dǎo)入模板的要求，將數(shù)據(jù)及其指紋

截圖上傳到SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)，進(jìn)行逐個(gè)位點(diǎn)在線比對(duì)，核實(shí)確定相互間的指紋數(shù)據(jù)的異同。

7.4.3.3采用PAGE垂直板電泳與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比對(duì)的，按照數(shù)據(jù)導(dǎo)入模板的要求，將數(shù)據(jù)上

傳到SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)，進(jìn)行逐個(gè)位點(diǎn)的兩兩比對(duì)，核實(shí)確定相互間的指紋數(shù)據(jù)的異同。

注：采用PAGE垂直板電泳與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)比對(duì)較為困難，建議作為參考使用，比對(duì)前采取以下措施：

a）讀取擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小數(shù)據(jù)的，供檢樣品與參照樣品（附錄B）同時(shí)在同一電泳板上電泳；

b）電泳時(shí)間足夠，符合7.4.2.3.2的要求；

c）供檢樣品存在擴(kuò)增片段為一個(gè)基序差異的，按片段大小順序重新電泳進(jìn)行復(fù)核確定后讀取。

7.4.4數(shù)據(jù)記錄

數(shù)據(jù)比對(duì)后，按照位點(diǎn)存在差異或相同、數(shù)據(jù)缺失、無(wú)法判定等情形，記錄每個(gè)引物的位點(diǎn)狀況。

8結(jié)果計(jì)算與表示

統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)差異記錄的結(jié)果，計(jì)算差異位點(diǎn)數(shù)，核實(shí)差異位點(diǎn)的引物編號(hào)。

檢測(cè)結(jié)果用供檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品比較的位點(diǎn)差異數(shù)表示，檢測(cè)結(jié)果的容許差距不能大于2個(gè)位點(diǎn)。

對(duì)于在容許差距范圍內(nèi)且提出有異議的樣品，可以參照GB/T3543.5的規(guī)定進(jìn)行田間小區(qū)種植鑒定。

9結(jié)果報(bào)告

9.1按照GB/T3543.1的檢驗(yàn)報(bào)告要求，對(duì)品種真實(shí)性驗(yàn)證或身份鑒定的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行填報(bào)。

9.2對(duì)于真實(shí)性驗(yàn)證，選擇下列方式之一進(jìn)行填報(bào)：

a)通過(guò)對(duì)引物，采用電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較未能檢測(cè)出位點(diǎn)差異。

b)通過(guò)對(duì)引物，采用電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較檢測(cè)出差異位點(diǎn)數(shù)個(gè)，

差異位點(diǎn)的引物編號(hào)為。

9.3對(duì)于品種身份鑒定，采用下列方式進(jìn)行填報(bào)：

通過(guò)對(duì)引物，采用電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)篩查，供檢樣品

與品種未能檢測(cè)出位點(diǎn)差異。

9.4屬于下列情形之一的，需在檢驗(yàn)報(bào)告中注明：

——供檢樣品低于5.4.1規(guī)定數(shù)量的；

——與SSR指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)的；

——供檢樣品遺傳不穩(wěn)定嚴(yán)重的位點(diǎn)（引物編號(hào)）清單；

——檢測(cè)采用了其他SSR引物的名稱(chēng)及序列。

AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

溶液配制

A.1DNA提取

A.1.10.5mol/LEDTA溶液

稱(chēng)取186.1gNa2EDTA.2H2O溶于800mL水中，加固體NaOH調(diào)pH至8.0，加水定容至1000mL，121℃

高壓滅菌20min。

A.1.21mol/LTris-HCl溶液

稱(chēng)取60.55gTris堿溶于適量水中，加HCl調(diào)pH至8.0，加水定容至500mL，121℃高壓滅菌20min。

A.1.30.5mol/LHCl溶液

濃鹽酸(36%～38%)25mL，加水定容至500mL。

A.1.4CTAB提取液

5mol/LNaCl280mL、CTAB20g、1mol/LTris-HCl100mL、0.5mol/LEDTA40mL，山梨醇5g、PVP

10g加水定容至1000mL，4℃貯存。使用前加入10mlβ-巰基乙醇。

A.1.5SDS提取液

1mol/LTris-HCl50mL、0.5mol/LEDTA20mL、5mol/LNaCl140mL和SDS10g混合、山梨醇5g和

PVP10g，加水定容至1000mL。使用前加入10mlβ-巰基乙醇。

A.1.61×TE緩沖液

1mol/LTris-HCl5mL和0.5mol/LEDTA1mL，加HCl調(diào)pH至8.0，加水定容至500mL，121℃高壓

滅菌20min。

A.1.75mol/LNaCl溶液

固體NaCl146g，加水定容至500mL。

A.1.8苯酚:氯仿:異戊醇混合液

體積比為25:24:1。

A.2PCR擴(kuò)增

A.2.1SSR引物

用TE緩沖液或超純水分別配制正向引物、反向引物終濃度均為40mol/L的儲(chǔ)存液。

A.3電泳

A.3.140％PAGE膠

丙烯酰胺190g和甲叉雙丙烯酰胺10g，加水定容至500mL。

A.3.26×加樣緩沖液

去離子甲酰胺49mL、0.5mol/LEDTA1mL、溴酚蘭0.125g和二甲苯青0.125g混合。

A.3.36%PAGE膠

尿素450g、10×TBE緩沖液100mL和40%PAGE膠150mL，加水定容至1000mL。

A.3.4親和硅烷緩沖液

無(wú)水乙醇49.75mL和冰醋酸250L。

A.3.5親和硅烷工作液

親和硅烷緩沖液1mL和Bind原液10L混合。

A.3.6疏水硅烷工作液

95ml三氯甲烷中加入5ml疏水硅烷原液。

A.3.710%過(guò)硫酸銨溶液

0.1g過(guò)硫酸銨溶于1mL超純水中。

A.3.810×TBE緩沖液

Tris堿108g、硼酸55g和0.5mol/LEDTA37mL，加水定容至1000mL。

A.3.91×TBE緩沖液

10×TBE緩沖液100mL，加水定容至1000mL。

A.4銀染

A.4.1固定液

100mL的無(wú)水乙醇和5mL的乙酸，加水定溶至1000mL。

A.4.2染色液

2g的硝酸銀（AgNO3），加水定溶至1000mL。

A.4.3顯影液

30g的固