【生物】重組DNA技術(shù)的基本工具課件-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章基因工程第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具1944年1953年1961年1970年1972年1973年基因工程的誕生和發(fā)展桑格等科學(xué)家發(fā)明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成儀的問世為體外合成DNA提供了方便。伯格成功構(gòu)建了第一個體外重組DNA分子。證明質(zhì)?？梢宰鳛榛蚬こ痰妮d體，使外源基因在原核細胞中成功表達，實現(xiàn)物種間基因交流，基因工程正式問世。艾弗里等人證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉(zhuǎn)移。1953年沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細菌細胞間轉(zhuǎn)移。尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。科學(xué)家在細菌中發(fā)現(xiàn)了第一個限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）。1967年1977年1982年，第一個基因工程藥物-重組人胰島素被批準上市。1983年，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。1984年，我國科學(xué)家朱作言領(lǐng)導(dǎo)的團隊培育出世界上第一條轉(zhuǎn)基因魚。1985年，穆里斯等人發(fā)明了PCR。1990年，人類基因組計劃啟動。2003年完成21世紀以來，科學(xué)家發(fā)明了多種高通量測序技術(shù)，加速了人們對基因組序列的了解。2013年，華人科學(xué)家張鋒及其團隊首次報道利用最新的基因組編輯技術(shù)編輯了哺乳動物基因組。該技術(shù)可以實現(xiàn)對特定基因的定點插入、敲除或替換。

分析：

人的胰島素基因能通過拼接并在受體細胞大腸桿菌中表達出相同蛋白質(zhì)（胰島素）的理論基礎(chǔ)：（1）大腸桿菌和人的遺傳物質(zhì)都是

。（2）不同生物的DNA分子能夠拼接在一起，原因是____________________________________________________________

（3）同一種基因在不同生物體內(nèi)表達出來的蛋白質(zhì)相同，因為：

_________________________________________________________（4）遺傳信息的傳遞都遵循

。(5)為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內(nèi)表達？

DNA中心法則基因的堿基種類、空間結(jié)構(gòu)和堿基互補配對方式相同所有生物共用一整套遺傳密碼科技探索之路①基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則

③生物界共同一套遺傳密碼基因工程：是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫

重組DNA技術(shù)1.操作環(huán)境：2.原理：3.操作對象：4.操作水平：5.結(jié)果：體外環(huán)境基因DNA分子水平基因重組賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品科技探索之路定向改造生物性狀；克服遠緣雜交不親和障礙6.意義：

番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會大大下降?？茖W(xué)家通過精心設(shè)計，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。

DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。

到社會中去科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？

這些“分子工具”各具有什么特征呢？轉(zhuǎn)基因番木瓜（左）與非轉(zhuǎn)基因番木瓜（右）

到社會中去實現(xiàn)這一精確的操作過程，至少需要三種“分子工具”

工具分子手術(shù)刀分子縫合針分子運輸車限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶：載體：準確切割DNA分子,得到所需的目的基因能將目的基因連接到載體上能將目的基因?qū)胧荏w細胞中培育轉(zhuǎn)基因番木瓜過程：

資料卡限制酶名字的由來（72頁）限制酶是如何命名的呢？一般是用生物屬名的頭一個字母與種名的頭兩個字母，組成了3個字母的略語；第四個字母表示菌株(品系）。以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌（Escherichiacoli）的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進一步表示成EcoRI例如：流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindIIIHindIHindIIATGC一.限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）（1）來源：主要是從原核生物體內(nèi)分離純化出來的（2）功能：能夠識別雙鏈DNA分子的特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵（脫氧核苷酸之間）斷開，因此具有專一性。磷酸二酯鍵斷開部位EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’大多數(shù)限制酶的識別序列由___個核苷酸組成，少數(shù)由___個、__個或_________的核苷酸組成。648其他數(shù)量注意：(1)從5’→3’讀(2)一般都是回文序列(3)可找到中心軸線EcoRI(在G與A之間切割)SmaI(在G與C之間切割)5'5'5'5'3'3'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'一.限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）黏性末端平末端A.形成的黏性末端（從5’往3’讀）為_________B.一個限制酶切割一次斷兩個磷酸二酯鍵形成___個黏性末端C.同一種限制酶切割形成的黏性末端_______（可旋轉(zhuǎn)180°比較）AATT兩相同DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，或者DNA分子被修飾（甲基化），使限制酶不能將其切開限制酶存在于原核生物中的作用是什么?限制酶為什么不會剪切原核生物本身的DNA?

原核生物容易受到外源DNA的入侵限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效

保證自身的安全兩DNA片段要具有互補的黏性末端才能拼起來將切下來的DNA片段拼接成新的DNA分子，靠DNA連接酶來完成。，注意:DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA；也不能連接RNA！二.DNA連接酶T4DNA連接酶還可以把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率相對較低。T4DNA連接酶的縫合作用二、重組DNA技術(shù)的基本工具--DNA連接酶將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，形成重組DNA分子。(1)作用:(2)分類種類E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能特性相同點大腸桿菌T4噬菌體只能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來，不能連接具有平末端的DNA片段既可以連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對較低）恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵二.DNA連接酶三、基因進入受體細胞的載體（1）來源：來源于

等生物，最常用的是大腸桿菌質(zhì)粒。1.最常用的載體——質(zhì)粒細菌和酵母菌（2）實質(zhì)：它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于細菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的

（化學(xué)本質(zhì)），故質(zhì)粒有

個游離的磷酸基團。雙鏈環(huán)狀DNA分子0

（3）作用:

①

．

②

．

將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細胞中去在受體細胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制（4）質(zhì)粒作為載體所具備的條件條件原因能自我復(fù)制（有復(fù)制原點）使DNA數(shù)量增多有一個至多個______________位點

供外源DNA片段(基因)插入其中能在細胞中進行到受體DNA上能使目的基因

且數(shù)量可擴增常有特殊的__________便于重組DNA分子的_______無毒害作用對受體細胞

作用，避免受體細胞受到損傷自我復(fù)制或整合限制酶切割標記基因篩選穩(wěn)定存在無毒害種類用途不同點質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等將外源基因?qū)胫参锛毎麑⑼庠椿驅(qū)雱游锛毎麃碓床煌?，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別（5）載體的種類①λ噬菌體的衍生物或某些動植物病毒作為運載體利用的原理是：____________________________________.病毒對宿主細胞的侵染具有一定的____________________性。利用病毒對宿主細胞的侵染性物種（組織）特異②若用家蠶作為某基因表達載體的受體細胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是_____________________。噬菌體噬菌體不能侵染家蠶③霍亂弧菌中含有質(zhì)粒，但

用來做載體（有害）不能(1)已知EcoRⅠ的識別序列和切點是—G↓AATTC—，BamHⅠ的識別序列和切點是—G↓GATCC—EcoRⅠBamHⅠ③同一個DNA分子用不同限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同；

【解析：酶具有專一性，識別的序列不同】四、拓展補充——1.限制酶(2)已知BamHⅠ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的識別序列和切點是—↓GATC—BamHⅠSau3AⅠ同一個DNA分子用不同限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同,(也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配對連接成鏈）GCGCCGCG總結(jié)：產(chǎn)生相同的黏性末端不一定都是用同一種限制酶切割四、拓展補充——1.限制酶(3)已知BamHⅠ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的識別序列和切點是—↓GATC—BamHⅠBamHⅠ可以斷開Sau3AⅠ的識別序列嗎?反之呢？Sau3AⅠ總結(jié)：不一定

可以

（酶的識別序列越短，斷開的幾率越大）四、拓展補充——1.限制酶

用這兩種酶和DNA連接酶對該DNA分子進行反復(fù)切割、連接操作，若干循環(huán)后，

序列會明顯

（增多、減少、不變）。－AGATCC－－TCTAGG－增多總結(jié)：兩種同尾酶切割的DNA片段連接后，原來的酶切位點將不存在，不能再被原來的限制酶識別四、拓展補充——1.限制酶（4）a酶和b酶是否可以識別此序列？不能DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？DNA聚合酶相同點：都是催化磷酸二酯鍵形成的酶。只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵，需要模板

旁欄思考（P72）：

四、拓展補充——2.DNA連接酶在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶名稱作用部位作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個片段，形成黏性末端或平末端DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端，形成新的DNA分子DNA(水解)酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈四、拓展補充——3.與DNA相關(guān)的五種酶1.標記基因通常有:①抗生素的抗性基因，如:抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基因(tetr)②熒光蛋白基因，如:綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)重組DNA導(dǎo)入受體細胞不是100%，而且導(dǎo)入率較低五、拓展補充——標記基因?qū)χ亟MDNA分子的篩選2、篩選含有目的基因的細菌（2種抗性基因）(2)從抗性上說：含有目的基因的細菌有什么特點？質(zhì)粒目的基因重組質(zhì)粒細菌篩選抗氨芐青霉素，不抗四環(huán)素氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因(1)“重組質(zhì)粒”導(dǎo)入細菌時有哪些情況？未導(dǎo)入、只導(dǎo)入質(zhì)粒、導(dǎo)入重組DNA（3）未導(dǎo)入、只導(dǎo)入質(zhì)粒的細菌有什么特點?二者均不抗既抗氨芐青霉素也抗四環(huán)素

如何利用標記基因（氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因）對受體細胞進行篩選？

3、影印法

特點：培養(yǎng)基上的菌落位置相同

做法：配制三種培養(yǎng)基，一種是普通培養(yǎng)基，第二種是加入氨芐青霉素的培養(yǎng)基，第三種是加入四環(huán)素的培養(yǎng)基。

要選擇能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，而不能在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上生存的菌落。如上圖中的

號菌落中的細菌是含有目的基因的細菌。普通培養(yǎng)基加四環(huán)素加氨芐青霉素4、6

從抗性的角度分析，菌落1抗性如何，原因？菌落2、3、5的抗性如何，原因？菌落2、3、5導(dǎo)入的質(zhì)粒不含有目的基因（即空質(zhì)粒）。尋根問底加四環(huán)素加氨芐青霉素普通培養(yǎng)基菌落1，未導(dǎo)入質(zhì)粒。請你根據(jù)圖3-3中的相關(guān)信息找到兩條片段上EcoRI的識別序列和切割位點。然后，用剪刀進行“切割”。待切割位點全部切開后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠條將切口粘連起來。六、重組DNA分子的模擬操作（73頁）AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGCCGTATG……

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…重組DNA分子的模擬操作GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGCCGTATG…用同種限制酶切割，容易出現(xiàn)質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化。使用一種限制酶進行切割，是否只會得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？問題探討載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’11.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對？如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上。討論：4.重組質(zhì)粒的形成中，用何種酶處理目的基因和載體（質(zhì)粒）？用相同的限制酶處理目的基因和運載體，獲得相同的末端，然后用DNA連接酶對其進行連接。5.得到的產(chǎn)物一定是目的基因和載體結(jié)合形成的重組DNA嗎？由于用同種限制酶切割，會產(chǎn)生相同黏性末端，則可能導(dǎo)致目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接。6.為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是什么？

進行雙酶切。即用兩種酶同時切割目的基因和載體。(目的基因和載體均得到末端1和末端2，其中1與1結(jié)合，2與2結(jié)合）

1.實驗思路：DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對它們進行提取。2.實驗原理：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精DNA能溶于物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液在一定溫度下，DNA被二苯胺試劑染成藍色初步分離DNA和蛋白質(zhì)溶解DNA鑒定DNA七、DNA的粗提取與鑒定（74頁）00.14NaCI濃度（mol/L）DNA溶解度

不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA（可以用雞血細胞）。3.選材：注意：4.試劑：①研磨液②體積分數(shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用DNA的粗提取與鑒定SDS使蛋白質(zhì)變性EDTA抑制DNA酶Tris-HCl緩沖液穩(wěn)定DNA117頁附錄2稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL

研磨液，充分研磨研磨的目的:破碎細胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中5.DNA的粗提取與鑒定步驟：2．去除濾液中的雜質(zhì)方案一方案二在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。低溫放置幾分鐘的作用？抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂；使DNA易形成沉淀析出。1.取材、研磨：3.DNA的析出方案一方案二在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液（體積分數(shù)為95%），靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分。攪拌時應(yīng)輕緩、并沿一個方向？減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子?；?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。4.DNA的鑒定實驗組對照組水浴加熱取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。藍色（5）方法步驟小結(jié)：稱取

，切碎，放入研缽，倒入

，充分研磨。在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取

；或?qū)⒀心ヒ旱谷胨芰想x心管中離心，取

。在上清液中加入體積相等的、____________溶液，靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的______________就是粗提取的DNA。將絲狀物或沉淀物溶于_________________溶液中，加入___________試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min2.去除雜質(zhì)3.DNA的析出4.DNA的鑒定1.破碎細胞上清液上清液預(yù)冷的酒精白色絲狀物二苯胺用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物；或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中離心，取沉淀物晾干。2mol/L的NaCl洋蔥研磨液DNA的粗提取與鑒定視頻

實驗結(jié)果不明顯的可能原因①材料中的核物質(zhì)沒有充分釋放出來，如研磨不充分或蒸餾水的量不夠。②加入酒精后搖動或攪拌時過猛，DNA被破壞。③二苯胺最好現(xiàn)用現(xiàn)配，否則二苯胺變成淺藍色，影響鑒定效果。

結(jié)果分析與評價1.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍色說明實驗基本成功；如果不呈現(xiàn)藍色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程中出現(xiàn)了失誤等。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？

本實驗粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。3.與其他同學(xué)提取的DNA進行比較，看看實驗結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。

進一步探究（75頁）

本實驗只是對DNA進行了粗提取，請在閱資料，了解實驗室提取純度較高的DNA的一種方法，并與本實驗中所使用的方法進行比較，總結(jié)兩種方法的異同。實驗室提取純度較高的DNA的方法有不少。

例如，可以先添加質(zhì)量分數(shù)為25%的SDS溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開；隨后，加入氯仿一異丙醇混合液(體積比為24:1)，通過離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除去，取上清液；可重復(fù)上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。