HJ 775-2015 水質(zhì) 蛔蟲卵的測定 沉淀集卵法（正式版）

中華人民共和國國家環(huán)境保護標準水質(zhì)蛔蟲卵的測定沉淀集卵法 2015-12-04發(fā)布 1 3方法原理 14試劑和材料 5儀器和設(shè)備 6樣品 27分析步驟 2 39精密度 310質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 4 4 4附錄A(資料性附錄)硝酸鈉水中溶解度、離心機離心力及轉(zhuǎn)速計算公式 5附錄B(資料性附錄)蛔蟲卵的鑒定 6附錄C(資料性附錄)蛔蟲卵配制樣品的制備 8為貫徹《中華人民共和國環(huán)境保護法》和《中華人民共和國水污染防治法》,保護環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范水中蛔蟲卵的測定方法，制定本標準。本標準規(guī)定了地表水和廢水中蛔蟲卵測定的沉淀集卵法。本標準為首次發(fā)布。本標準的附錄A～附錄C為資料性附錄。本標準由環(huán)境保護部科技標準司組織制訂。本標準主要起草單位：常州市環(huán)境監(jiān)測中心。本標準驗證單位：上海市環(huán)境監(jiān)測中心、江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心、浙江省環(huán)境監(jiān)測中心、蘇州市環(huán)境監(jiān)測中心、徐州市環(huán)境監(jiān)測中心站和泰州市環(huán)境監(jiān)測中心站。本標準環(huán)境保護部2015年12月4日批準。本標準自2016年1月1日起實施。本標準由環(huán)境保護部解釋。1水質(zhì)蛔蟲卵的測定沉淀集卵法1適用范圍本標準規(guī)定了測定水中蛔蟲卵的沉淀集卵法。本標準適用于地表水和廢水中蛔蟲卵的測定。當取樣體積為10L時，本方法的檢出限為5個/10L。2規(guī)范性引用文件本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范3方法原理沉淀集卵法主要通過樣品濃縮、雜質(zhì)分離、鏡檢計數(shù)等環(huán)節(jié)對水中蛔蟲卵進行測定。用60目篩網(wǎng)過濾去除樣品中較大的雜質(zhì)，利用蛔蟲卵比重大于水和易于沉淀的特性過夜沉淀濃縮水樣，用虹吸的方法棄去上清液，用表面活性劑吐溫80作為殘液及沉淀轉(zhuǎn)移時的清洗劑，進一步離心濃縮轉(zhuǎn)移的剩余物，收集到的濃縮物用乙酸-乙酸鈉緩沖液混勻，控制溶液pH值，獲得最佳親水-親脂平衡，加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪類雜質(zhì)，使蛔蟲卵更易下沉。再次離心濃縮樣品并棄去上部脂肪雜質(zhì)層及緩沖液層，獲得的含卵沉淀層用飽和硝酸鈉溶液混勻，于計數(shù)框中靜置漂浮后鏡檢，即可測得水樣中蛔蟲卵的數(shù)量。4試劑和材料除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純化學試劑，實驗用水為新制備的蒸餾水或去離4.1乙酸乙酯(C?H?O?)。4.2乙酸-乙酸鈉緩沖液：pH=4.5。稱取15.0g三水合乙酸鈉(CH?COONa-3H?O),溶于約800ml實驗用水中，加入3.6ml乙酸(CH?COOH)調(diào)節(jié)pH值至4.5,用實驗用水定容至1000ml。此溶液保質(zhì)期為30d。4.3吐溫80溶液：φ(C??H?O?)=1%。移取1ml吐溫80(Tween80),用實驗用水稀釋定容至1000ml,臨用現(xiàn)配。4.4飽和硝酸鈉(NaNO?)溶液。稱取略多于實驗環(huán)境溫度對應(yīng)溶解度的硝酸鈉(NaNO?),充分溶解于100g實驗用水中，用濾紙濾去殘渣，臨用現(xiàn)配。硝酸鈉在不同溫度下的溶解度見附錄A。5儀器和設(shè)備除非另有說明，分析時均使用符合國家標準A級玻璃量器。25.1顯微鏡：物鏡4x、10×倍，目鏡10×倍。5.2冰箱：0～4℃。5.3水平轉(zhuǎn)子離心機：帶50ml螺口尖底離心管，離心力1000g以上。5.4漩渦混勻器。5.5篩網(wǎng)：60目，φ250μm。5.6不銹鋼開口直壁容器：10L。5.7開口直壁量筒：1000ml。5.9洗瓶。5.10螺口尖底離心管：50ml。5.11一次性巴氏滴管：3ml、10ml。5.12微量移液器：1000μl。5.13定量計數(shù)框：1ml(網(wǎng)格)、5ml(S型)定量計數(shù)框。6樣品按HJ/T91中對一般污染物采樣的要求，用10L以上容積的塑料桶采樣。采樣前需用樣品蕩洗塑料桶，采集樣品量應(yīng)≥10L,常溫下運回實驗室，立即進行過濾(7.1)和沉淀(7.2)。7分析步驟充分搖勻樣品，轉(zhuǎn)入不銹鋼開口直壁容器(5.6)至10L刻度。如樣品中含有草梗、紙渣等較大雜質(zhì)，需將樣品用篩網(wǎng)(5.5)過濾，并用吐溫80溶液(4.3)清洗篩網(wǎng)(5.5)及雜質(zhì)，洗液并入過濾后的10L樣品中。上述樣品(7.1)在15～25℃室溫下靜置過夜沉淀12～24h,用虹吸管(5.8)小心吸取并棄去上清液，避免擾動，保留1L含沉淀物的樣品，轉(zhuǎn)入1000ml開口直壁量筒(5.7),分別用50ml吐溫80溶液(4.3)徹底清洗不銹鋼開口直壁容器3次，洗液并入開口直壁量筒(5.7)。在15～25℃室溫下再次靜置過夜沉淀12～24h,用虹吸管(5.8)吸取并棄去上清液，避免擾動，保留90～100ml含沉淀物7.3離心沉淀濃縮后的樣品(7.2)小心轉(zhuǎn)移至3個螺口尖底離心管(5.10),分別用15ml吐溫80溶液(4.3)徹底清洗開口直壁量筒3次，洗液均勻并入3個螺口尖底離心管。以1000g的離心力(離心機轉(zhuǎn)速計算見附錄A)離心15min,用巴氏滴管(5.11)小心吸取并棄去上清液，少量留之，避免帶出沉淀。用少量吐溫80溶液(4.3)將3個離心管中的沉淀進行懸浮，將沉淀量少的2個離心管中的懸浮液并入沉淀量最多的一個離心管中；分別用3～5ml吐溫80溶液徹底清洗被轉(zhuǎn)移懸浮液的2個離心管，3每支清洗3次，確保沒有沉淀被丟棄，洗液并入沉淀量最多的離心管。以1000g的離心力離心15min,用巴氏滴管(5.11)小心吸取并棄去上清液，少量留之，避免帶出沉淀。用與離心后沉淀(7.3)等體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液(4.2)對沉淀進行懸浮(即：離心后沉淀體積為2ml,加入2ml緩沖液)。如果離心后沉淀體積不足2ml,加入緩沖液至4ml。以確保用乙酸乙酯(4.1)加入2倍離心后沉淀(7.3)體積的乙酸乙酯(4.1),用渦旋混勻器(5.4)完全混合。以1000g的離心力離心15min,樣品被分為清晰的三層。所有的非脂肪物質(zhì)、重碎片，包括蛔蟲卵、幼蟲和原生加入5倍底層沉淀(7.4)體積的飽和硝酸鈉溶液(4.4),對分離去除脂類雜質(zhì)后的含卵底層沉淀進行懸浮。該懸浮液可置于0～4℃冰箱(5.2)冷藏保存，備檢，于1周內(nèi)檢測完畢，檢測時需將其靜置至室溫。充分搖勻懸浮液，將其轉(zhuǎn)入定量計數(shù)框(5.13),靜置5min,在顯微鏡下計數(shù)，直至全部懸浮液鏡檢完成。分別用1ml飽和硝酸鈉溶液(4.4)充分洗滌鏡檢完的離心管3次，將洗液轉(zhuǎn)入定量計數(shù)框(5.13),按以上步驟鏡檢。所有檢測到的蛔蟲卵全部計數(shù)。鏡檢時，需保持環(huán)境條件的穩(wěn)定，無震動和風擾，緩移計數(shù)框，自上而下“U”型逐列計數(shù)。卵鑒定方法見附錄B。取10L同批次實驗用水，按以上采樣及分析步驟進行全程序空白樣品的測定。統(tǒng)計全部計數(shù)的蛔蟲卵數(shù)，按式(1)計算并報告10L水樣中蛔蟲卵數(shù)：8.2結(jié)果表示6家實驗室分別對實際樣品和低濃度(20個/10L)、中濃度(40個/10L)、高濃度(80個/10L)自4配樣品的蛔蟲卵進行測定，實驗室內(nèi)相對標準偏差范圍分別為6.5%～18.9%,10.1%～22.0%,12.8%~23.8%,8.9%～17.4%;實驗室間相對標準偏差分別為5.8%、5.5%、4.9%、4.8%;重復(fù)性限(個/10L)為244、3、7、11;再現(xiàn)性限(個/10L)為260、3、7、11。10質(zhì)量保證和質(zhì)量控制每批次樣品至少做1個全程序空白試驗，并取10%的樣品進行平行樣測定。全程序空白試驗不得檢出蛔蟲卵，平行樣間的相對偏差不得超過30%。11廢物處理實驗中虹吸液煮沸10min后可按普通廢棄物處理，含乙酸乙酯的廢棄液應(yīng)集中保管，委托有資質(zhì)的單位進行處理。12注意事項實驗用過的器具均需進行高溫滅活，置于水中煮沸10min后方可再次使用。實驗操作人員要注意自身防護，試驗時要穿戴工作服、乳膠手套及口罩等，同時還要避免含蛔蟲卵的樣品污染實驗室環(huán)境。5(資料性附錄)硝酸鈉水中溶解度、離心機離心力及轉(zhuǎn)速計算公式A.1硝酸鈉在水中的溶解度表A.1硝酸鈉水中溶解度溫度/℃0A.2離心力計算公式離心力按式(A.1)進行計算。r——離心機半徑(離心管中心至離心機軸的距離),cm;A.3離心力轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)速公式離心機轉(zhuǎn)速按式(A.2)進行換算。6(資料性附錄)蛔蟲卵的鑒定B.1蛔蟲卵的形態(tài)特征B.1.1受精蛔蟲卵蟲卵呈短橢圓形，大小為(45～75μm)x(35～50μm)。卵殼很厚，自外向內(nèi)分為三層：受精膜、殼質(zhì)層和蛔甙層，殼質(zhì)層較厚，另兩層極薄，在普通顯微鏡下難以分清。卵殼內(nèi)有一個大而圓未分裂的受精卵細胞，與卵殼間常見有新月形空隙。卵殼外有一層由蟲體子宮分泌形成的蛋白質(zhì)膜，其表面凹凸不平呈波浪狀。隨糞便排出的蟲卵常被膽汁染成黃色或棕褐色。B.1.2未受精蛔蟲卵蟲卵呈長橢圓形或不規(guī)則形，大小為(88～94μm)×(39～44μm),卵殼與蛋白質(zhì)膜均較受精蛔蟲卵薄，淡黃色，無蛔甙層，卵殼內(nèi)含有許多大小不一的屈光顆粒。B.1.3感染期蛔蟲卵卵內(nèi)含有一條卷曲的幼蟲。B.1.4蛋白質(zhì)膜脫落的蛔蟲卵若蛔蟲卵的蛋白質(zhì)膜脫落，卵殼則呈無色透明，應(yīng)注意與其他線蟲卵的鑒別。B.2蛔蟲卵參考圖片圖B.1蛔蟲卵模式圖7B.2.2發(fā)育各階段的蛔蟲卵發(fā)育各階段的蛔蟲卵8(資料性附錄)蛔蟲卵配制樣品的制備豬蛔蟲(Ascarissuum)活成蟲采集自屠宰場，用蒸餾水洗滌干凈后，放置于含4%甲醛溶液內(nèi)，0~4℃保存?zhèn)溆?，可長期保存。制備蛔蟲卵備用液時，選取2～3條雌性蛔蟲，用75%乙醇消毒過的解剖刀，劃開蟲體，每條蛔蟲一對子宮選取靠近陰門的一段(2～3mm),解剖后，將含蛔蟲卵的內(nèi)容物及組織碎片放入50ml離心管中，加入數(shù)顆直徑1mm玻璃珠及10ml生理鹽水，混勻后于渦旋混勻器振蕩3～5min,用260目網(wǎng)過