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高三生物血紅蛋白的提取與分離課件用雞的紅細(xì)胞提取DNA,用哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么?雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核,含有DNA,便于進(jìn)行DNA的提?。蝗说募t細(xì)胞無細(xì)胞核,結(jié)構(gòu)簡單,血紅蛋白含量豐富,便于提取血紅蛋白。二實(shí)驗(yàn)操作第2頁,共64頁,2024年2月25日,星期天蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步:1.樣品處理樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定二實(shí)驗(yàn)操作第3頁,共64頁,2024年2月25日,星期天血液有哪些成分?第4頁,共64頁,2024年2月25日,星期天第5頁,共64頁,2024年2月25日,星期天血液血
漿水分其他
物質(zhì)血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血
細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞(最多)血紅蛋白(90%)兩個(gè)α-肽鏈兩個(gè)β一肽鏈四個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)血液有哪些成分?血紅蛋白第6頁,共64頁,2024年2月25日,星期天第7頁,共64頁,2024年2月25日,星期天①目的:去除()②方法:
()離心(速度越高和時(shí)間越長會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果),然后用膠頭吸管吸出上層透明的(),將下層()的紅細(xì)胞液體倒入燒杯,再加入用()的()洗滌。(1)紅細(xì)胞的洗滌第8頁,共64頁,2024年2月25日,星期天①目的:去除()②方法:
()離心(速度越高和時(shí)間越長會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果),然后用膠頭吸管吸出上層透明的(),將下層()的紅細(xì)胞液體倒入燒杯,再加入用()的()洗滌。(1)紅細(xì)胞的洗滌雜質(zhì)蛋白第9頁,共64頁,2024年2月25日,星期天①目的:去除()②方法:
()離心(速度越高和時(shí)間越長會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果),然后用膠頭吸管吸出上層透明的(),將下層()的紅細(xì)胞液體倒入燒杯,再加入用()的()洗滌。(1)紅細(xì)胞的洗滌雜質(zhì)蛋白低速短時(shí)間第10頁,共64頁,2024年2月25日,星期天①目的:去除()②方法:
()離心(速度越高和時(shí)間越長會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果),然后用膠頭吸管吸出上層透明的(),將下層()的紅細(xì)胞液體倒入燒杯,再加入用()的()洗滌。(1)紅細(xì)胞的洗滌雜質(zhì)蛋白低速短時(shí)間黃色血漿第11頁,共64頁,2024年2月25日,星期天①目的:去除()②方法:
()離心(速度越高和時(shí)間越長會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果),然后用膠頭吸管吸出上層透明的(),將下層()的紅細(xì)胞液體倒入燒杯,再加入用()的()洗滌。(1)紅細(xì)胞的洗滌雜質(zhì)蛋白低速短時(shí)間黃色血漿暗紅色第12頁,共64頁,2024年2月25日,星期天①目的:去除()②方法:
()離心(速度越高和時(shí)間越長會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果),然后用膠頭吸管吸出上層透明的(),將下層()的紅細(xì)胞液體倒入燒杯,再加入用()的()洗滌。(1)紅細(xì)胞的洗滌雜質(zhì)蛋白低速短時(shí)間黃色血漿暗紅色五倍體積第13頁,共64頁,2024年2月25日,星期天①目的:去除()②方法:
()離心(速度越高和時(shí)間越長會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果),然后用膠頭吸管吸出上層透明的(),將下層()的紅細(xì)胞液體倒入燒杯,再加入用()的()洗滌。(1)紅細(xì)胞的洗滌雜質(zhì)蛋白低速短時(shí)間黃色血漿暗紅色五倍體積生理鹽水第14頁,共64頁,2024年2月25日,星期天初次離心后的結(jié)果第15頁,共64頁,2024年2月25日,星期天3次洗滌后的結(jié)果第16頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
加()到()體積,再加40%體積的()(溶解細(xì)胞膜),置于()上充分?jǐn)嚢?0分鐘(加速細(xì)胞破裂),細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白的釋放第17頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
加()到()體積,再加40%體積的()(溶解細(xì)胞膜),置于()上充分?jǐn)嚢?0分鐘(加速細(xì)胞破裂),細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白的釋放原血液甲苯磁力攪拌器蒸餾水第18頁,共64頁,2024年2月25日,星期天將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),以2000r/min的速度離心10min,試管中的溶液分為4層:(3)分離血紅蛋白溶液第19頁,共64頁,2024年2月25日,星期天有機(jī)溶劑無色透明的甲苯層脂類物質(zhì)白色脂溶性物質(zhì)沉淀層血紅蛋白溶液紅色透明液體紅細(xì)胞破碎物沉淀暗紅色沉淀物分離血紅蛋白溶液第20頁,共64頁,2024年2月25日,星期天(4)透析第21頁,共64頁,2024年2月25日,星期天取()ml的血紅蛋白溶液裝入()中,將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的()中,pH為(),透析12小時(shí),目的是()或用于更換樣品中的()。透析袋一般用硝酸纖維素制成,又稱玻璃紙。除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)透析袋磷酸緩沖液7.0緩沖液(4)透析1第22頁,共64頁,2024年2月25日,星期天第23頁,共64頁,2024年2月25日,星期天利用透析袋透析第24頁,共64頁,2024年2月25日,星期天2.凝膠色譜制作1)凝膠色譜柱的制作①取長40厘米,內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管,兩端需用砂紙磨平。第25頁,共64頁,2024年2月25日,星期天②底塞的制作:
第26頁,共64頁,2024年2月25日,星期天②底塞的制作:打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng),再用100目尼龍紗包好。
③頂塞的制作:④組裝:⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。第27頁,共64頁,2024年2月25日,星期天底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面,否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng),還會(huì)導(dǎo)致液體殘留,蛋白質(zhì)分離不徹底。注意第28頁,共64頁,2024年2月25日,星期天第29頁,共64頁,2024年2月25日,星期天2)凝膠色譜柱填料的處理第30頁,共64頁,2024年2月25日,星期天2)凝膠色譜柱填料的處理計(jì)算凝膠量配置凝膠懸浮液裝填洗滌平衡第31頁,共64頁,2024年2月25日,星期天凝膠裝填時(shí)盡量緊密,以降低凝膠顆粒之間的空隙。裝填凝膠柱時(shí)不能有氣泡存在:因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序,降低分離效果。注意第32頁,共64頁,2024年2月25日,星期天緩沖液液面不要低于凝膠表面,否則可能有氣泡混入,影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。不能發(fā)生洗脫液流干,露出凝膠顆粒的現(xiàn)象,否則重新填裝。注意第33頁,共64頁,2024年2月25日,星期天裝配好的凝膠柱第34頁,共64頁,2024年2月25日,星期天在提取血紅蛋白實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液是什么?它的目的是什么?思考第35頁,共64頁,2024年2月25日,星期天在提取血紅蛋白實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液是什么?它的目的是什么?使用的是磷酸緩沖液,目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境,保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能,便于觀察(紅色)和材料的科學(xué)研究。思考第36頁,共64頁,2024年2月25日,星期天你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎?思考第37頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻,就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙,使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過,攪亂洗脫液的流動(dòng)次序,影響分離的效果。你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎?思考第38頁,共64頁,2024年2月25日,星期天3)樣品加入與洗脫50cm高第39頁,共64頁,2024年2月25日,星期天3)樣品加入與洗脫①緩沖液緩慢下降50cm高第40頁,共64頁,2024年2月25日,星期天②加透析樣品第41頁,共64頁,2024年2月25日,星期天注意正確的加樣操作:①不要觸及破壞凝膠面②貼壁加樣③使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)注意第42頁,共64頁,2024年2月25日,星期天3)樣品加入與洗脫①緩沖液緩慢下降50cm高③樣品滲入凝膠床:④洗脫:⑤收集:②加透析樣品第43頁,共64頁,2024年2月25日,星期天收集得到的純化后的蛋白第44頁,共64頁,2024年2月25日,星期天AVSEQ08.DAT第45頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
1.你是否完成了對(duì)血液樣品的處理?你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎?三實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)第46頁,共64頁,2024年2月25日,星期天觀察你處理的血液樣品離心后是否分層?如果分層不明顯,可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外,離心速度過高和時(shí)間過長,會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀,也得不到純凈的紅細(xì)胞,影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。
1.你是否完成了對(duì)血液樣品的處理?你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎?三實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)第47頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
2.你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生?你的色譜柱裝填得成功嗎?你是如何判斷的?第48頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
2.你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生?你的色譜柱裝填得成功嗎?你是如何判斷的?由于凝膠是一種半透明的介質(zhì),因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈,檢查凝膠是否裝填得均勻。此外,還可以加入大分子的有色物質(zhì),例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖,觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整,說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡,輕輕敲打柱體以消除氣泡,消除不了時(shí)要重新裝柱。第49頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
3.你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中,紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎?請描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況,并據(jù)此判斷分離效果?第50頁,共64頁,2024年2月25日,星期天如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話,能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整,隨著洗脫液緩慢流出;如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬,說明分離的效果不好,這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。
3.你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中,紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎?請描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況,并據(jù)此判斷分離效果?第51頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
1.在分離血紅蛋白的整個(gè)過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么?思考第52頁,共64頁,2024年2月25日,星期天讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi),維持結(jié)構(gòu)和功能。
1.在分離血紅蛋白的整個(gè)過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么?思考第53頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
2.與其他真核細(xì)胞相比,紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)?這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?思考第54頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
2.與其他真核細(xì)胞相比,紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)?這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?血紅蛋白是有色蛋白,因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀,大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。思考第55頁,共64頁,2024年2月25日,星期天3.你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎?第56頁,共64頁,2024年2月25日,星期天3.你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎?血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步,包括:樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液,即:樣品的處理;再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì),即樣品的粗分離;然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去,即:樣品的純化;最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。第57頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
1.用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中,關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述,正確的是
A.相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)
B.相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)
C.相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)
D.二者根本無法比較第58頁,共64頁,2024年2月25日,星期天
1.用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中,關(guān)于蛋白
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