生物（人教版選修1）課件專題2課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

專題二微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題二土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)1．解釋選擇培養(yǎng)基；2．闡明統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目、設(shè)置對(duì)照、土壤取樣及稀釋的方法；3．掌握從土壤中分離分解尿素的微生物及進(jìn)行平板計(jì)數(shù)的方法。一、研究思路1．篩選菌株(1)Taq細(xì)菌能耐受93℃左右的高溫，是美國(guó)微生物學(xué)家托馬斯·布魯克于1966年在美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)熱泉中發(fā)現(xiàn)的，這說(shuō)明，在尋找目的菌株時(shí)，要根據(jù)它對(duì)____________的要求，到___________中去尋找。生存環(huán)境相應(yīng)環(huán)境(2)選擇培養(yǎng)基：允許____________的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)______________其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。(3)選擇分解尿素細(xì)菌的培養(yǎng)基特點(diǎn)：________是唯一氮源；按物理性質(zhì)歸類為_(kāi)______培養(yǎng)基。特定種類抑制或阻止尿素固體在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物是否一定是所需要的微生物？為什么？提示：不一定。因?yàn)槲⑸锏呐囵B(yǎng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長(zhǎng)繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物不一定是所需要的微生物，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。2．統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目(1)測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法有_____________和_________________。(2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般設(shè)置__________個(gè)平板，選擇菌落數(shù)在____________的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取__________。②統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目_____，因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用_________而不是_________來(lái)表示?；罹?jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法多于330～300平均數(shù)低菌落數(shù)活菌數(shù)3．設(shè)置對(duì)照設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中_____________對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的________。例如為了排除培養(yǎng)基是否被雜菌污染了，需用_____________________________作為空白對(duì)照。對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了_________的條件外，其他條件都______的實(shí)驗(yàn)，其作用是比照實(shí)驗(yàn)組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實(shí)是所測(cè)試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。非測(cè)試因素可信度培養(yǎng)該種微生物的無(wú)菌培養(yǎng)基被測(cè)試相同二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)關(guān)于土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：1．土壤取樣土壤微生物中70%～80%為_(kāi)_____，主要分布在距地表___________的近_____性土壤中。細(xì)菌3～8

cm中2．樣品的稀釋樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長(zhǎng)的__________。由于不同微生物在土壤中含量不同，因此分離不同的微生物要選用不同的稀釋度范圍，以保證獲得_____________________、適于計(jì)數(shù)的平板。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)菌稀釋度為_(kāi)________________倍，放線菌稀釋度為_(kāi)_____________倍，真菌稀釋度為_(kāi)_____________倍。第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，可將稀釋范圍放寬些，以保證能從中選擇出適于計(jì)數(shù)的平板。菌落數(shù)目菌落數(shù)在30～300之間104、105、106103、104、105102、103、1043．微生物的培養(yǎng)與觀察不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)______和培養(yǎng)______。細(xì)菌一般在______℃培養(yǎng)______d，放線菌一般在25～28℃培養(yǎng)5～7d，霉菌一般在________℃的溫度下培養(yǎng)_____d。在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取______________時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因______________而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。一般來(lái)說(shuō)，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間)，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。菌落的特征包括_____________________________等方面。溫度時(shí)間30～371～225～283～4菌落數(shù)目穩(wěn)定培養(yǎng)時(shí)間不足形狀、大小、隆起程度、顏色三、對(duì)分離得到的分解尿素細(xì)菌的鑒定在對(duì)能分解尿素的細(xì)菌進(jìn)行初步篩選后，還需要借助生物化學(xué)的方法對(duì)分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定。在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的_______將尿素分解成了____。氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性_______，pH________。因此，我們可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基_______變化來(lái)判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。在以______為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入_______指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變____，說(shuō)明該細(xì)菌能夠__________。脲酶氨增強(qiáng)升高pH尿素酚紅紅分解尿素一、選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)需要的微生物的生長(zhǎng)。目的是從眾多微生物中分離出所需要的微生物。1．加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌。2．加入高濃度的食鹽溶液可得到金黃色葡萄球菌。3．如培養(yǎng)基中缺乏氮源時(shí)，可以分離固氮微生物，因?yàn)榉枪痰⑸锊荒茉诖伺囵B(yǎng)基上生存。4．當(dāng)培養(yǎng)基的某種營(yíng)養(yǎng)成分為特定化學(xué)成分時(shí)，也具有分離效果。例如，石油是唯一碳源時(shí)，可以抑制不能利用石油的微生物的生長(zhǎng)，使能夠利用石油的微生物生存，達(dá)到分離出能消除石油污染的微生物的目的。5．改變微生物的培養(yǎng)條件，也可以達(dá)到分離微生物的目的，如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)只能得到耐高溫的微生物。1．在培養(yǎng)基中加入尿素(唯一氮源)，以分離出能分解尿素的細(xì)菌，這種加入尿素的培養(yǎng)基在功能上屬于(

)A．選擇培養(yǎng)基 B．固體培養(yǎng)基C．液體培養(yǎng)基 D．半固體培養(yǎng)基解析：選擇培養(yǎng)基是從功能上對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行分類的，B、C、D三項(xiàng)所述的培養(yǎng)基是根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)進(jìn)行分類的。題述培養(yǎng)基能分離出以尿素為唯一氮源的細(xì)菌，故是一種選擇培養(yǎng)基。答案：A二、微生物數(shù)量測(cè)定1．方法：稀釋涂布平板法——統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)測(cè)定土壤中的細(xì)菌數(shù)，一般選用104、105、106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，測(cè)定放線菌一般選用103、104和105倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，測(cè)定真菌一般用102、103和104倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每一濃度至少涂布3個(gè)平板，以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力和準(zhǔn)確性。當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的菌落來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品大約含有多少個(gè)活菌。2．計(jì)數(shù)規(guī)則①選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)②計(jì)算方法：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×MC代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)V代表涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積(mL)3．顯微鏡直接計(jì)數(shù)法與稀釋涂布平板法的比較顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法是將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的菌懸液放在血球計(jì)數(shù)板的載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的(0.1mm3)，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)?yè)Q算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得的是活菌和死菌的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速，但需要與血球計(jì)數(shù)板配套使用，且計(jì)數(shù)隨機(jī)性大，所以對(duì)菌體數(shù)量不能做出較為宏觀、全面的反映。平板菌落計(jì)數(shù)法通常做梯度稀釋，所以計(jì)數(shù)的線性范圍大。由于是菌懸液涂布，所以比較均勻，能較好地反映菌落的疏密程度，重復(fù)性、平行性好，是經(jīng)典的計(jì)數(shù)方法。但需要平板上長(zhǎng)出菌落一段時(shí)間后才能計(jì)數(shù)，因此速度慢是最大的缺點(diǎn)。4．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)(1)設(shè)置重復(fù)組。實(shí)驗(yàn)要有足夠的次數(shù)，才能避免結(jié)果的偶然性，使結(jié)論更有說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。如該實(shí)驗(yàn)中，可在每個(gè)稀釋度下設(shè)置3個(gè)選擇培養(yǎng)基平板；計(jì)數(shù)時(shí)在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，求平均值。這樣也可以為實(shí)驗(yàn)是否成功提供參考，如重復(fù)組結(jié)果不一致，則意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。(2)設(shè)置對(duì)照。對(duì)照的設(shè)置也會(huì)增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度和說(shuō)服力。如在該實(shí)驗(yàn)中，可在配制培養(yǎng)基時(shí)，準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基兩種，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用，在相同的稀釋度下，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基的。另外，要設(shè)置空白對(duì)照，即在培養(yǎng)基中不加土樣，如果空白對(duì)照的培養(yǎng)基上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，則說(shuō)明培養(yǎng)基沒(méi)有被雜菌污染。2．用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確的是(

)A．涂布了1個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是230B．涂布了2個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C．涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163D．涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值233解析：在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性，所以A、B兩項(xiàng)不正確。C項(xiàng)雖涂布了3個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另兩個(gè)相差太遠(yuǎn)，說(shuō)明在操作過(guò)程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡(jiǎn)單地用3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值求平均值。答案：D選擇培養(yǎng)基的特點(diǎn)和應(yīng)用

某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難以降解的有機(jī)化合物A，研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細(xì)菌(“目的菌”)。實(shí)驗(yàn)的主要步驟如下。請(qǐng)分析回答問(wèn)題：(1)培養(yǎng)基中加入化合物A的目的是篩選______，這種培養(yǎng)基屬于______培養(yǎng)基。(2)“目的菌”生長(zhǎng)所需的氮源和碳源是來(lái)自培養(yǎng)基中的_____，實(shí)驗(yàn)需要振蕩培養(yǎng)，由此推測(cè)“目的菌”的代謝類型是_____。(3)培養(yǎng)若干天后，應(yīng)選擇培養(yǎng)瓶中化合物A含量______的培養(yǎng)液，接入新的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)，使“目的菌”的數(shù)量______。(4)轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng)時(shí)，常采用______的方法接種，獲得單菌落后繼續(xù)篩選。(5)若要研究“目的菌”的生長(zhǎng)規(guī)律，可將單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，采用______的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以______為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。(6)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使用過(guò)的培養(yǎng)基應(yīng)該進(jìn)行______處理后，才能倒掉。解析：題干中首先說(shuō)明了化合物A是有機(jī)物，后來(lái)在培養(yǎng)基中又增加了磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素，通過(guò)比較各培養(yǎng)瓶中化合物A的多少，選出“目的菌”，由此還可推斷出“目的菌”所需碳源和氮源都來(lái)自化合物A，是異養(yǎng)型。獲得“目的菌”后，再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中及培養(yǎng)結(jié)束后注意滅菌。答案：(1)“目的菌”選擇(2)化合物A異養(yǎng)需氧型(3)減少增加(4)平板劃線(5)定期取樣“目的菌”數(shù)目的對(duì)數(shù)(6)滅菌土壤中微生物的分離與計(jì)數(shù)

探究如何從土壤中分離自生固氮菌與計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)原理農(nóng)田的表層土壤中，自生固氮菌的含量比較多。將用表層土壤制成的稀泥漿，接種到無(wú)氮培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。在這種情況下，只有自生固氮菌才能生長(zhǎng)繁殖。用這種方法，可以將自生固氮菌與其他細(xì)菌分離開(kāi)來(lái)。材料用具農(nóng)田的表層土壤、無(wú)氮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、盛9mL無(wú)菌水的大試管若干。無(wú)菌移液管、無(wú)菌涂布器、無(wú)菌培養(yǎng)皿、盛90mL無(wú)菌水的錐形瓶、酒精燈、恒溫箱。方法步驟(1)倒平板。分別將無(wú)氮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒平板，應(yīng)在______操作。(2)制備土壤稀釋液。取土樣10g加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻。用無(wú)菌移液管吸取上清液1mL，轉(zhuǎn)至9mL無(wú)菌水的大試管中，依次稀釋到107倍稀釋度。為實(shí)現(xiàn)無(wú)菌操作，試管口和移液管應(yīng)在離火焰______cm處。(3)涂布。按照由107～103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布，每個(gè)稀釋度下，無(wú)氮培養(yǎng)基應(yīng)至少涂布______個(gè)平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基涂布______個(gè)平板。(4)培養(yǎng)。放入恒溫箱內(nèi)，在適宜溫度條件下培養(yǎng)3～4d。一般每隔______小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次，選取______時(shí)的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止_____________________。(5)細(xì)菌的計(jì)數(shù)。當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在______的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果測(cè)試的平均值為50，則每克樣品中的菌落數(shù)是______。(稀釋度是105)(6)預(yù)期結(jié)果。相同稀釋度下，牛肉膏蛋白胨平板上的菌落數(shù)______(填“多于”或“少于”)無(wú)氮培養(yǎng)基上的數(shù)目。理由是______________________。解析：考查微生物的分離及計(jì)數(shù)。要分離自生固氮菌，采用選擇培養(yǎng)基分離的方法，缺乏氮源的培養(yǎng)基可用來(lái)分離自生固氮微