生物（人教版選修1）課件專題2課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

專題二微生物的培養(yǎng)與應用課題二土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)1．解釋選擇培養(yǎng)基；2．闡明統(tǒng)計菌落數(shù)目、設置對照、土壤取樣及稀釋的方法；3．掌握從土壤中分離分解尿素的微生物及進行平板計數(shù)的方法。一、研究思路1．篩選菌株(1)Taq細菌能耐受93℃左右的高溫，是美國微生物學家托馬斯·布魯克于1966年在美國黃石國家公園的一個熱泉中發(fā)現(xiàn)的，這說明，在尋找目的菌株時，要根據(jù)它對____________的要求，到___________中去尋找。生存環(huán)境相應環(huán)境(2)選擇培養(yǎng)基：允許____________的微生物生長，同時______________其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。(3)選擇分解尿素細菌的培養(yǎng)基特點：________是唯一氮源；按物理性質歸類為_______培養(yǎng)基。特定種類抑制或阻止尿素固體在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物是否一定是所需要的微生物？為什么？提示：不一定。因為微生物的培養(yǎng)是一個非常復雜的過程，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物不一定是所需要的微生物，還需要進一步的驗證。2．統(tǒng)計菌落數(shù)目(1)測定微生物數(shù)量的常用方法有_____________和_________________。(2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目①為了保證結果準確，一般設置__________個平板，選擇菌落數(shù)在____________的平板進行計數(shù)，并取__________。②統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目_____，因此，統(tǒng)計結果一般用_________而不是_________來表示?；罹嫈?shù)法顯微鏡直接計數(shù)法多于330～300平均數(shù)低菌落數(shù)活菌數(shù)3．設置對照設置對照的主要目的是排除實驗組中_____________對實驗結果的影響，提高實驗結果的________。例如為了排除培養(yǎng)基是否被雜菌污染了，需用_____________________________作為空白對照。對照實驗是指除了_________的條件外，其他條件都______的實驗，其作用是比照實驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應的結果。非測試因素可信度培養(yǎng)該種微生物的無菌培養(yǎng)基被測試相同二、實驗設計關于土壤中某樣品細菌的分離與計數(shù)的實驗操作步驟如下：1．土壤取樣土壤微生物中70%～80%為______，主要分布在距地表___________的近_____性土壤中。細菌3～8

cm中2．樣品的稀釋樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的__________。由于不同微生物在土壤中含量不同，因此分離不同的微生物要選用不同的稀釋度范圍，以保證獲得_____________________、適于計數(shù)的平板。一般來說，細菌稀釋度為_________________倍，放線菌稀釋度為______________倍，真菌稀釋度為______________倍。第一次實驗時，可將稀釋范圍放寬些，以保證能從中選擇出適于計數(shù)的平板。菌落數(shù)目菌落數(shù)在30～300之間104、105、106103、104、105102、103、1043．微生物的培養(yǎng)與觀察不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)______和培養(yǎng)______。細菌一般在______℃培養(yǎng)______d，放線菌一般在25～28℃培養(yǎng)5～7d，霉菌一般在________℃的溫度下培養(yǎng)_____d。在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取______________時的記錄作為結果，以防止因______________而導致遺漏菌落的數(shù)目。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間)，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。菌落的特征包括_____________________________等方面。溫度時間30～371～225～283～4菌落數(shù)目穩(wěn)定培養(yǎng)時間不足形狀、大小、隆起程度、顏色三、對分離得到的分解尿素細菌的鑒定在對能分解尿素的細菌進行初步篩選后，還需要借助生物化學的方法對分離的菌種作進一步的鑒定。在細菌分解尿素的化學反應中，細菌合成的_______將尿素分解成了____。氨會使培養(yǎng)基的堿性_______，pH________。因此，我們可以通過檢測培養(yǎng)基_______變化來判斷該化學反應是否發(fā)生。在以______為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入_______指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變____，說明該細菌能夠__________。脲酶氨增強升高pH尿素酚紅紅分解尿素一、選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物的生長，促進需要的微生物的生長。目的是從眾多微生物中分離出所需要的微生物。1．加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌。2．加入高濃度的食鹽溶液可得到金黃色葡萄球菌。3．如培養(yǎng)基中缺乏氮源時，可以分離固氮微生物，因為非固氮微生物不能在此培養(yǎng)基上生存。4．當培養(yǎng)基的某種營養(yǎng)成分為特定化學成分時，也具有分離效果。例如，石油是唯一碳源時，可以抑制不能利用石油的微生物的生長，使能夠利用石油的微生物生存，達到分離出能消除石油污染的微生物的目的。5．改變微生物的培養(yǎng)條件，也可以達到分離微生物的目的，如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)只能得到耐高溫的微生物。1．在培養(yǎng)基中加入尿素(唯一氮源)，以分離出能分解尿素的細菌，這種加入尿素的培養(yǎng)基在功能上屬于(

)A．選擇培養(yǎng)基 B．固體培養(yǎng)基C．液體培養(yǎng)基 D．半固體培養(yǎng)基解析：選擇培養(yǎng)基是從功能上對培養(yǎng)基進行分類的，B、C、D三項所述的培養(yǎng)基是根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)進行分類的。題述培養(yǎng)基能分離出以尿素為唯一氮源的細菌，故是一種選擇培養(yǎng)基。答案：A二、微生物數(shù)量測定1．方法：稀釋涂布平板法——統(tǒng)計活菌數(shù)測定土壤中的細菌數(shù)，一般選用104、105、106倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)，測定放線菌一般選用103、104和105倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)，測定真菌一般用102、103和104倍的稀釋液進行平板培養(yǎng)。實驗時，每一濃度至少涂布3個平板，以增強實驗的說服力和準確性。當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品大約含有多少個活菌。2．計數(shù)規(guī)則①選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)②計算方法：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×MC代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V代表涂布平板時所用稀釋液的體積(mL)3．顯微鏡直接計數(shù)法與稀釋涂布平板法的比較顯微鏡直接計數(shù)法是利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法。此法是將經(jīng)過適當稀釋的菌懸液放在血球計數(shù)板的載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的(0.1mm3)，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計得的是活菌和死菌的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。此法的優(yōu)點是直觀、快速，但需要與血球計數(shù)板配套使用，且計數(shù)隨機性大，所以對菌體數(shù)量不能做出較為宏觀、全面的反映。平板菌落計數(shù)法通常做梯度稀釋，所以計數(shù)的線性范圍大。由于是菌懸液涂布，所以比較均勻，能較好地反映菌落的疏密程度，重復性、平行性好，是經(jīng)典的計數(shù)方法。但需要平板上長出菌落一段時間后才能計數(shù)，因此速度慢是最大的缺點。4．實驗設計注意事項(1)設置重復組。實驗要有足夠的次數(shù)，才能避免結果的偶然性，使結論更有說服力與準確性。如該實驗中，可在每個稀釋度下設置3個選擇培養(yǎng)基平板；計數(shù)時在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數(shù)，求平均值。這樣也可以為實驗是否成功提供參考，如重復組結果不一致，則意味著操作有誤，需要重新實驗。(2)設置對照。對照的設置也會增加實驗結果的可信度和說服力。如在該實驗中，可在配制培養(yǎng)基時，準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基兩種，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用，在相同的稀釋度下，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)應明顯多于選擇培養(yǎng)基的。另外，要設置空白對照，即在培養(yǎng)基中不加土樣，如果空白對照的培養(yǎng)基上沒有菌落生長，則說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。2．用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)，在對應稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結果，正確的是(

)A．涂布了1個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230B．涂布了2個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C．涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163D．涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值233解析：在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性，所以A、B兩項不正確。C項雖涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結果與另兩個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地用3個平板的計數(shù)值求平均值。答案：D選擇培養(yǎng)基的特點和應用

某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難以降解的有機化合物A，研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到能高效降解化合物A的細菌(“目的菌”)。實驗的主要步驟如下。請分析回答問題：(1)培養(yǎng)基中加入化合物A的目的是篩選______，這種培養(yǎng)基屬于______培養(yǎng)基。(2)“目的菌”生長所需的氮源和碳源是來自培養(yǎng)基中的_____，實驗需要振蕩培養(yǎng)，由此推測“目的菌”的代謝類型是_____。(3)培養(yǎng)若干天后，應選擇培養(yǎng)瓶中化合物A含量______的培養(yǎng)液，接入新的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)，使“目的菌”的數(shù)量______。(4)轉為固體培養(yǎng)時，常采用______的方法接種，獲得單菌落后繼續(xù)篩選。(5)若要研究“目的菌”的生長規(guī)律，可將單個菌落進行液體培養(yǎng)，采用______的方法進行計數(shù)，以時間為橫坐標，以______為縱坐標，繪制生長曲線。(6)實驗結束時，使用過的培養(yǎng)基應該進行______處理后，才能倒掉。解析：題干中首先說明了化合物A是有機物，后來在培養(yǎng)基中又增加了磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素，通過比較各培養(yǎng)瓶中化合物A的多少，選出“目的菌”，由此還可推斷出“目的菌”所需碳源和氮源都來自化合物A，是異養(yǎng)型。獲得“目的菌”后，再進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中及培養(yǎng)結束后注意滅菌。答案：(1)“目的菌”選擇(2)化合物A異養(yǎng)需氧型(3)減少增加(4)平板劃線(5)定期取樣“目的菌”數(shù)目的對數(shù)(6)滅菌土壤中微生物的分離與計數(shù)

探究如何從土壤中分離自生固氮菌與計數(shù)。實驗原理農(nóng)田的表層土壤中，自生固氮菌的含量比較多。將用表層土壤制成的稀泥漿，接種到無氮培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。在這種情況下，只有自生固氮菌才能生長繁殖。用這種方法，可以將自生固氮菌與其他細菌分離開來。材料用具農(nóng)田的表層土壤、無氮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、盛9mL無菌水的大試管若干。無菌移液管、無菌涂布器、無菌培養(yǎng)皿、盛90mL無菌水的錐形瓶、酒精燈、恒溫箱。方法步驟(1)倒平板。分別將無氮培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒平板，應在______操作。(2)制備土壤稀釋液。取土樣10g加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。用無菌移液管吸取上清液1mL，轉至9mL無菌水的大試管中，依次稀釋到107倍稀釋度。為實現(xiàn)無菌操作，試管口和移液管應在離火焰______cm處。(3)涂布。按照由107～103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進行平板涂布，每個稀釋度下，無氮培養(yǎng)基應至少涂布______個平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基涂布______個平板。(4)培養(yǎng)。放入恒溫箱內(nèi)，在適宜溫度條件下培養(yǎng)3～4d。一般每隔______小時統(tǒng)計一次，選取______時的記錄作為結果，這樣可以防止_____________________。(5)細菌的計數(shù)。當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在______的平板進行計數(shù)。如果測試的平均值為50，則每克樣品中的菌落數(shù)是______。(稀釋度是105)(6)預期結果。相同稀釋度下，牛肉膏蛋白胨平板上的菌落數(shù)______(填“多于”或“少于”)無氮培養(yǎng)基上的數(shù)目。理由是______________________。解析：考查微生物的分離及計數(shù)。要分離自生固氮菌，采用選擇培養(yǎng)基分離的方法，缺乏氮源的培養(yǎng)基可用來分離自生固氮微