年產50萬支人乳頭瘤病毒疫苗工廠設計

宮頸癌是的女性最常見惡性腫瘤之一，是女性生殖系統第二位的惡性腫瘤中，也是全球第四大常見致死癌癥，研究證實95%以上的宮頸癌伴有人乳頭瘤病毒(HumanPapilloma,HPV)感染。HPV預防性疫苗接種成為預防宮頸癌的生物技術有限公司得雙價人乳頭瘤病毒疫苗(商品名：馨可寧)于2019年12月31日獲國家藥監(jiān)局批準上市注冊申請，2020年1月3日下午，萬泰公司已經打破HPV疫苗由默沙東公司(Merck)和葛蘭素史克公司(GSK)生產的壟斷本設計年產50萬支人乳頭瘤病毒疫苗的生產車間，每支含有40μgHPV16關鍵詞：人乳頭瘤病毒；高密度發(fā)酵工藝；基因工程Oneofthemostcommonfemalemalignancyiscervicalcancer,thecancerisinsecondplaceinthefemalereproductivesystem,andisalsotheworld'sfourthmostcommonfatalcancer,studiesconfirmthatmorethan95%ofcervicalcancersassociatedwithhumanPapillomaVirus(HPV)infection.ProphylacticHPVvaccinationasanimportantmeansofpreventingcervicalcancer.HPVvaccineresearchanddevelopmentofdomesticenterprisesincludingShanghaiInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd,NationalVaccine&SerumInstitute,BravoVax,ShanghaiZerunBiotechnologyCo.,Ltd,INNOVAX.WhichbytheINNOVAX.InManhattanbivalenthumanPapillomaVirusvaccine(tradename:Cecolin)on31December2019bytheStateFoodandDrugAdministrationapprovedformalproductionofvaccines,thevaccineisarecombinanthumanChina'sfirstindependentlydevelopedHPVvaccines,HPVvaccinebythebreakMerckandGlaxoSmithKline(GSK)productionmonopoly.Butacompany'sproductionishardlyenoughtosupplythewholeofChina.Therefore,thisdesignwillcancervaccinerecombinantEscherichiacoliastherawmaterial,theapplicationofhigh-densityfermentationprocess,aftertheproductionoftheproteinpurificationtechniques,mixedwithotheringredientsCecolinsaThisdesignedtoproduce500,000HPVvaccineproductionplant,eachcomprisingtherecombinantprotein40μgHPV16,20μgHPV18recombinantprotein,210μgaluminumsalt,Al(OH)3,packagedasapre-filledsyringe,aninjectiondosageform,specificationsfor60μg/0.5mL/support.Thisdesigncombinesthecervicaldocumentsandstandards,completedtheprocessofdesignandplantlayoutdesign,materialswerecalculatedheatbalance,selectionfermenterdesign,majorequipment.engineeredvaccine;DesignWorkshop 52人乳頭瘤病毒疫苗的生產工藝確定 62.1重組大腸桿菌的發(fā)酵工藝 62.1.1培養(yǎng)基 7 82.1.3溫度 82.1.4溶解氧濃度 82.1.5誘導條件 82.1.6菌體接種量 92.1.7補料方式 2.2蛋白質的純化工藝 2.2.1菌體的收集 2.2.2菌體的洗滌 2.2.3包涵體的破碎 2.2.4包涵體的溶解 2.2.5HP親和層析 2.2.6包涵體的復性 2.2.7去鹽濃縮 2.3冷凍干燥工藝 2.4疫苗的灌裝工藝 2.5各項指標檢測 2.5.1蛋白無菌檢測 2.5.2蛋白純度檢測 2.5.3蛋白濃度檢測 2.5.4蛋白內毒素檢測 2.5.5蛋白活性檢測(ELISA法) 2.5.6蛋白的表達與Westernblot檢測 2.6工藝流程 3工藝計算 3.1工藝基礎數據 3.2發(fā)酵罐的選型 3.2.1發(fā)酵罐臺數的確定 3.2.2主要尺寸的計算 3.2.3發(fā)酵罐冷卻面積的計算 3.2.4發(fā)酵罐攪拌器的設計 3.2.5發(fā)酵罐設備結構的空氣分布器 3.2.6發(fā)酵罐的密封方式 3.2.7發(fā)酵罐設備材料的選擇 3.2.8發(fā)酵罐支座的選擇 3.3種子罐的選型 203.3.1種子罐臺數的確定 203.3.2主要尺寸的計算 203.3.3種子罐冷卻面積的計算 213.3.4種子罐攪拌器的設計 223.3.5種子罐設備結構的空氣分布器 223.3.6種子罐的密封方式 223.3.7種子罐設備材料的選擇 223.3.8種子罐支座的選擇 233.4原料消耗計算 233.4.1每周期消耗培養(yǎng)基計算 233.4.2原料消耗匯總表 243.5熱量衡算 253.5.1發(fā)酵工藝熱量計算 253.5.2發(fā)酵過程中的無菌空氣消耗量計算 263.6其他主要設備選型 263.6.1高壓蒸汽滅菌鍋 263.6.2切向流過濾系統 273.6.3去鹽濃縮設備 273.6.4離心機的選型 283.6.5高壓均質機 293.6.6噴霧冷凍干燥機 293.6.7粉針劑分裝機 293.7輔助部門 3.7.1理化分析室 3.7.2微生物實驗室 3.7.3原料倉庫 3.7.4成品倉庫 3.7.5供水系統 3.7.6供氣系統 3.7.7供電系統 4全廠車間布置概況 4.1廠址選擇 4.2車間布置 參考文獻 致謝 錯誤!未定義書簽。附錄 1.種子罐設計 2.發(fā)酵罐設計 3.車間布置圖 4.工藝流程圖 5人乳頭瘤病毒(HumanPapillomaVirus,HPV)是子宮頸癌形成的原因，由德國科學家哈拉爾·德祖·爾豪森(HaraldzurHausen)在2008年發(fā)現，哈拉爾也因此獲得當年諾貝爾生理及醫(yī)學獎，同時也為HPV疫苗的研究及應用打下了堅固基礎。本設計疫苗為基因工程疫苗，是將大腸桿菌經過基因重組技術，將編碼病原微生物保護性抗原的基因重組到其中，經培養(yǎng)后，提取、純化所表達的保護性抗原制成的疫苗。1.1.1人乳頭瘤病毒的危害人乳頭瘤病毒是通過性傳播的病毒[1],是宮頸癌發(fā)生及發(fā)展的主要致病因素。宮頸癌的發(fā)病率是女性生殖系統惡性腫中的第二位，也是全球第四大常見致死癌癥[2],每年約有25萬人死于宮頸癌，且發(fā)病率及致死率呈逐年上升的趨勢[3]。2015年中國惡性腫瘤發(fā)病約392.9萬人，其中11.1%為子宮頸癌，位居我國惡性腫瘤發(fā)病第八位，每年有近10萬宮頸癌新發(fā)病例和3萬死亡病例。目前，被發(fā)現的HPV基因型有200多種，可分為高危類型和低危型，但僅有少數高危型是HPV16/18/31/33/35/39等為最常見的高危型，其中由HPV16型和HPV18型感染的宮頸癌占所有由高危型感染的宮頸癌的發(fā)病率71%[5]。1.1.2人乳頭瘤病毒疫苗研究進展及市場HPV屬乳頭瘤病毒科，由外殼蛋白包裹基因組構成，病毒基因組為7900bp的雙鏈閉和環(huán)狀DNA分子，可分為早期編碼區(qū)(E)、晚期編碼區(qū)(L)及非編碼區(qū)(LCR)[6]。L區(qū)又可分為L1基因(編碼主要結構衣殼蛋白)和L2基因(編碼次要結構衣殼蛋白)。HPV感染的預防性疫苗目前以L1蛋白作為主要成分組蛋白被認為是未來治療性疫苗的重要組成部分[0,已有許多實驗室在研究，但目前獲得顯著成績較少。雖然宮頸癌有較高的發(fā)病率和致死率，但同時也是最容易預防的惡性腫瘤之一，且目前被認為是唯一可以預防的癌癥。最先獲得批準用于臨床試驗的是美國默克公司Gardasil和英國葛蘭素史克Cervarix兩種四價預防性疫苗在2006年，這兩種疫苗相繼獲批上市在全球100多個國家和地區(qū)推廣，普遍人群接種后可望預防90%的宮頸癌、外陰癌和肛門癌2007年，澳大利亞成為首個提供免費四價宮頸癌疫苗的國家，促使21歲-30歲女性生殖道疣發(fā)生率在五年間下降8.2%[8]。2016年7月18日批準二價HPV6疫苗希瑞適被批準上市，第二年5月18日批準四價佳達修被批準上市，第三年4月29日批準九價佳達修被批準上市。目前國內研發(fā)HPV疫苗企業(yè)主要包括上海生物制品、北京生物制品、武漢博沃、上海澤潤、廈門萬泰等。其中由廈門萬泰滄海生物技術有限公司得雙價人乳頭瘤病毒疫苗(商品名：馨可寧)于2019年12月31日獲國家藥監(jiān)局批準上市注冊申請，2020年1月3日下午，萬泰公司已經開始正式生產疫苗，該疫苗是我國首個自主研發(fā)生產的重組人乳頭瘤病毒疫苗，并于5月起可預約接種。表1.1我國已批準上市的HPV疫苗雙價疫苗四價疫苗九價疫苗生產企業(yè)葛蘭素史克廈門萬泰滄海生物技術有限公司默克默克產品名稱卉妍康馨可寧佳達修佳達修96(30μg)6(20μg)16(60μg)L1VLP型別45(20μg)含L1序列桿生產細胞株狀病毒載體的粉紋夜蛾昆蟲重組大腸桿菌釀酒酵母釀酒酵母細胞佐劑500μgASO4A1(OH)3225μgAAHS500μgAAHS注：ASO4是氫氧化鋁加上50μg的3—O—脫?；?—單磷酰脂質A;AAHS是無定形羥基磷酸硫酸鋁；L1是主衣殼蛋白。2人乳頭瘤病毒疫苗的生產工藝確定2.1重組大腸桿菌的發(fā)酵工藝本設計采用高細胞密度發(fā)酵工藝(highcelldensitycultivation,HCDC),通7過提高細菌的發(fā)酵密度來優(yōu)化目標產品的比生產率，具有縮短生產周期、降低生產成本、減少設備投資、提高生產效率、增加生產效益等優(yōu)點。本設計采用的基因工程菌是重組大腸桿菌，該菌的構建決定了所合成的目的蛋白的生產能力和潛力，但在實際生產過程中有諸多因素可影響該菌的生產能力，如培養(yǎng)基成分、pH值、發(fā)酵溫度、溶解氧濃度、誘導條件、菌體接種量、補料方式等。2.1.1培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基可適用于大腸桿菌高密度發(fā)酵，培養(yǎng)基的組分是最重要的一部分，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基有利于菌體的生長和產物的表達，但某些過量的營養(yǎng)物質會給菌體的生產和產物的表達帶來抑制作用，甚至會造成菌體的自溶。一般情況下，葡萄糖的抑制濃度為50g/L。表2.1碳氮比含量對培養(yǎng)基的影響碳氮比含量影響①促進乙酸的代謝與合成偏高②菌體繁殖數量減少③代謝不平衡①菌體生長旺盛偏低②菌體提前進入衰退期③產物積累偏少無機鹽是維持菌體新陳代謝的重要成分，一般情況下，無機離子對大腸桿菌的抑制濃度為：氨(3g/L)、Fe2+(1115g/L)、Mg2+(817g/L)、PO?3-(10g/L)、Zn2+(0.1038g/L)l?]。本設計主要采用以下3種培養(yǎng)基。表2.2培養(yǎng)基的組分培養(yǎng)基組分濃度LB培養(yǎng)基g/L發(fā)酵基礎培養(yǎng)基g/L發(fā)酵流加培養(yǎng)基g/L蛋白胨10;酵母粉5;氯化鈉10;氨芐西林至75μg/mL蛋白胨15;酵母粉9;葡萄糖5;K2HPO43;微量元素溶液1mL;MgSO40.8(單獨滅菌)蛋白胨78;酵母粉10.78;葡萄糖600;MgSO4·7H2O9(單獨滅菌)注：微量元素溶液組分：FeSO4·7H2O2.8g,CoSO4·7H202.8g,MnCl2·4H2O2g,CaCl2·2H201.5g,ZnSO4·7H2O0.3g,CuCl2·2H2O0.2g,將上述物質溶于1mol/L煮沸的H2SO4溶液中，并持續(xù)攪拌直至完全溶解，除菌過濾。培養(yǎng)基均用注射用水定容，121℃高壓滅菌20min。8大腸桿菌最適pH在7.0-7.2之間。合適的酸堿度在菌體培養(yǎng)的過程中能夠帶來體保持旺盛的生長狀態(tài)等正面影響，若培養(yǎng)基的pH偏高或偏低都會給菌體的生長繁殖帶來諸多負面影響，如菌體失活、胞內蛋白變形等。大腸桿菌的培養(yǎng)過程中主要的副產物是乙酸，該副產物可以使培養(yǎng)基pH下降，對菌體的生長和產物的表達都有抑制作用。同時，氨水作為氮源在發(fā)酵過程中也會引起培養(yǎng)環(huán)境的酸堿度下降。因此，在高密度發(fā)酵培養(yǎng)重組大腸桿菌的過程中，應實時監(jiān)控發(fā)酵罐內pH值的變化，通過及時流加酸或堿來調節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度，使菌體可以持續(xù)處在合適的生長環(huán)境。程雪蓮[10]等以重組大腸桿菌DALA為實驗菌株，研究了該菌株在機械攪拌通風發(fā)酵罐發(fā)酵過程中前后期pH對產物積累的影響，結果發(fā)現，先pH6.5,后pH6.0時產物的積累情況優(yōu)于先pH6,后pH5.5。2.1.3溫度培養(yǎng)環(huán)境中的溫度高低直接影響菌體的生長密度和目的產物的表達，不同菌種的最適培養(yǎng)溫度有所差異，即使是同一菌種在誘導目的產物表達的前后最適溫度也也不一定相同。劉斌[11]等通過用IPTG誘導大腸桿菌重組構建BL21-FMDV-B4工程菌株條件的優(yōu)化發(fā)現37℃為最適溫度，與35℃條件下誘導的細胞密度差異較大。柴家前[12]等通過實驗得出高溫有利于提高細菌的密度，而低溫有利于目的產物的表達。所以采用不同培養(yǎng)階段不同的培養(yǎng)溫度以此控制菌體密度和提高目的產物的產量。大腸桿菌最適培養(yǎng)溫度為37℃,在誘導階段同樣采用37℃,誘導8h{l3]。2.1.4溶解氧濃度大腸桿菌為好氧微生物，影響其生長繁殖的因素中，溶氧濃度為重要因素之一。由于氧在水中溶解度很小，在常溫常壓下僅9.1mg/L,好氧菌在對數生長期時會快熟繁殖，同時對氧氣需求量大幅提升，若供氧不足會導致菌體缺氧死亡等不利影響。在發(fā)酵后期，即產物積累時，發(fā)酵液粘度上升，造成溶氧減少，若供氧不足，則會造成產物積累減少等不利影響。程雪蓮[10]等以重組大腸桿菌DALA為實驗對象，研究其在機械攪拌通風發(fā)酵罐發(fā)酵過程中溶解氧對產物積累的影響，結果顯示發(fā)酵前期轉速500r/min,通氣為2vvm,后期轉速250r/min,通氣量1vvm條件下產物積累情況優(yōu)于在酵前期轉速400r/min,通氣量2vvm,后期轉速200r/min,通氣量2vvm的條件。2.1.5誘導條件基因工程菌在前期構建過程中加入了可誘導的強啟動子，在合成目的產物的9過程中利用啟動子，目的是為了提高產率。這種操作不同于普通菌的產物合成，通常在菌種培養(yǎng)過程中先進行菌種增殖，提高菌體密度，再進行誘導。獲得更多目的產物可體通過提高菌體密度實現。何勇智[14]等用0.5mmol/LIPTG對菌種誘導，結果顯示目的產物產量較傳統的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)提高6倍，同時證明乳糖的誘導效果不及IPTG。陳玉梅[4]等利用重組菌pESUMO-16L1分別實驗了誘導劑IPTG的濃度、誘導時的溫度、時間及添加時間等，結果顯示，誘導劑加入時間差異對L1蛋白的表達量有顯著影響，當OD600為0.8~1.0時加入誘導劑的效果比在OD600為0.6時加入的誘導效果要好很多，目的蛋白的產量顯著提高不少。同時也發(fā)現誘導劑IPTG的濃度變化對重組HPVL1蛋白的表達量影響不大。由于缺少該菌前期的生產優(yōu)化試驗，本設計結合他人文獻數據，采用當發(fā)酵液D600≥0.8時，加入100mL100mol/LIPTG誘導8h[ll]。2.1.6菌體接種量接種量的計算方式為,接種量的大小決定細菌在培養(yǎng)基中繁殖表2.3接種量的優(yōu)缺點對比優(yōu)點缺點①使培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分被利用得①菌體前期過快生長繁殖接種量過多接種量過少更充分②限制外來雜菌的生長繁殖，減少生產過程中的污染概率③使菌體提前進入目的產物合成期，縮短培養(yǎng)時間①提高比生長速率，延長對數生長期②營養(yǎng)物質消耗劇增③發(fā)酵液變濃稠④溶解氧下⑤降菌體自溶⑥目的產物偏少①不利于產物的合成②延長了生產周期③降低了生產效益因此，在接種過程中應該根據菌體的具體生長情況確定接種量。馬永凱[15]等對重組菌株DE3-pEGX6p-1-PFMAP進行接種量優(yōu)化實驗中，利用正交試驗優(yōu)化50L發(fā)酵罐發(fā)酵條件，結果顯示5%(v/v)的接種量為最適接種量。舒暢[10等對發(fā)酵產酶的重組大腸桿菌BI21(DE3)/mtg條件進行優(yōu)化，通過單因素實驗法以及利用響應面模型，得出5%接種量下生產酶活為為優(yōu)化前的1.56由于缺少該菌前期的生產優(yōu)化試驗，本設計結合他人文獻數據，采用5%(v/v)接種量。2.1.7補料方式大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中由于大腸桿菌繁殖較快，營養(yǎng)物質會被迅速消耗，所以在生產中通常采用分批補料方式給菌種進行營養(yǎng)物的補充。目前分批補料技術被應用地最多，分批補料技術(fedbatchculture)是指在發(fā)酵過程中，對微生物生長所需的某些營養(yǎng)物質進行連續(xù)投料，其方法主要包括反饋補料法和非反饋補表2.4高密度發(fā)酵培養(yǎng)流加補料方法比較補料方法特點優(yōu)點缺點反饋恒糖濃度法可監(jiān)測糖濃度，調節(jié)流加速率及時準確費用較高補料恒pH值法操作簡單有滯后性恒溶氧法碳源耗盡，溶解氧上升操作簡單有滯后性恒速補料非反饋補變速補料料指數補料補料速率不變補料速率改變可控制流加速度，控制一定比生長速率操作簡單可調節(jié)補料速率可控制抑制物濃度補料目的性差，無法控制比生長速率可變形差可變性差，不能及時調節(jié)趙雨等利用基因工程菌E.coilBL21(DE3)pET28+(PyNpase)在發(fā)酵體積為5L的高密度發(fā)酵中，試驗恒pH-補料分批發(fā)酵、恒速流加分批發(fā)酵、分批發(fā)酵三種不同的發(fā)酵方式對該菌的生長密度的影響，結果表明恒pH-補料發(fā)酵模式為最適合大腸桿菌工程菌的高密度發(fā)酵，該模式為pH為6.5,甘油補料35mL/h。結合趙雨等研究成果及表2.4,本設計將采用指數-恒pH值混合流加的補料方式，補料類型為甘油，流速35mL/h。選擇原因如下：該補料方式可以根據菌體生長的具體情況及時補充菌體生長所需營養(yǎng)物質，同時能以恒定的特定生長速率適當抑制乙酸等副產品的生成。IPTG加入后，目的產物將快速、大量產生，培養(yǎng)環(huán)境粘度上升，且溶氧能力很快達到飽和狀態(tài)，單位體積的培養(yǎng)基中所能提供給菌體的溶氧量逐漸下降，從而導致菌體合成乙酸和葡萄糖。此時，反饋控制恒定pH值可以根據環(huán)境中pH的細微變化迅速地調節(jié)pH值，減輕甚至抑制副產物乙酸的積累，有效地提高菌體密度和外源性蛋白的表達。2.2蛋白質的純化工藝蛋白質純化的意思是變性蛋白的純化，純化是為了去除非目的蛋白，提高產品純度。工業(yè)生產中常采用操作簡單、成本低廉的稀釋復性，但由于其復性后體積較大，復性體系組分復雜，所以再上一步工藝中需要充分考慮蛋白濃縮和純化方法的選擇，例如菌種在基因編輯中加入特定基因序列。2.2.1菌體的收集在實驗室試驗階段中少量菌體菌體的收集一般采用離心機梯度離心，但在生產過程中梯度離心耗時長、單次離心菌液少、成本較高，無法滿足大批量生產需求。目前市場上已有連續(xù)式離心機，但受到運行參數、離心力、能耗、早期投資等多方面限制，導致該技術無法在現實生產中得到推廣和廣泛應用。隨著工藝技術的不斷提高，切向流過濾(TFF)系統目前正在進入生產過程。TFF是一種能夠有效的分離液固混合體系的方法，它能解決單向過濾堵塞膜孔的問題。當采用TFF時，大部分處理液流動方向為平行膜表面且保持較高流速，而不是垂直通過膜結構(如圖2.1所示)。除了水處理應用外，沿膜表面只有一小部分切向流會被滲透。以從培養(yǎng)液中分離細胞為例，單次操作滲透液約占1%~5%,95%~99%將成為保留液通過系統內輸送至處理容器再次快速、平行流過膜結構，形成一種連續(xù)的過濾操作。但TFF也有局限性，需結合離心設備去除幾乎所有發(fā)酵液，提高菌體收集率。濾液濾液濾液濾液濾液圖2.1中空纖維切向流過濾示意圖2.2.2菌體的洗滌本設計將濃縮后的菌液采用離心機在4℃、3000rpm的條件下離心10min,收集沉淀，將收集好的菌泥用PBSBuffer溶液反復重懸3次。2.2.3包涵體的破碎本設計采用高壓均質機對包涵體進行破碎處理，步驟大致為：均質機清洗→加入菌液→待均質均質機出口送料后設定壓力→重復均質次→均結結束后料液排空最后將收集好的破碎菌液在4℃、1000rpm的條件下離心20min,棄上清，收集沉淀。2.2.4包涵體的溶解解液邊用玻璃棒攪拌、移液器不斷攪拌吹打至終濃度達到10~20mg/mL,室溫放置15min使包涵體可以充分在裂解液中溶解。溶解完全后的液體需通過濾紙過濾掉少數難溶物質，保證裂解液的澄清，所收集的濾液為粗提蛋白，需保存在≤-20℃?zhèn)溆没蜻M入下一工段。2.2.5HP親和層析宋浩[17等對重組大腸桿菌誘導生產的蛋白LT-A進行包涵體復性液親和層析，鎮(zhèn)柱使用HP5mL柱和Crude5mL柱各上樣400mL包涵體稀釋復性液濃縮液，流速5mL/min,結果發(fā)現使用Crude鎮(zhèn)親和柱時穿出液中蛋白含量較高，所以Crude親和柱對蛋白的親和力不高，同時在利用300mM咪唑洗脫時只有少量蛋白洗脫。相反，再利用HP柱時，穿出液中蛋白含量較少，利用300mM咪唑洗脫時可將所有蛋白洗脫。綜上，HP親和柱比Crude更適合作為蛋白的親和層析純化。使用HP親和柱的收率為75.3%。步驟大致為：裝柱→柱填料平衡→上樣→洗脫蛋白→洗滌柱體詳見《生物化學實驗手冊》。2.2.6包涵體的復性純化后的蛋白在尿素中處于變性狀態(tài)，需要對其進行復性。本設計采用在4℃下快速加入1倍樣品體積的復性Buffer,全復性過程需要再磁力攪拌器下進行，保證復性液得到充分攪拌。2.2.7去鹽濃縮本設計采用電滲析脫鹽系統的濃縮設備對復性液進行去鹽濃縮。該設備是利用帶電離子膜的反離子遷移原理，以電位差為驅動力，在直流電場作用下，將帶電離子從電子元件中分離出來的膜工藝。2.3冷凍干燥工藝冷凍干燥是把物質中的水分通過凝固再升華去除，而物質本身保留原有骨架李冰[18]等利用絲膠蛋白粉進行冷凍干燥、噴霧干燥兩種干燥工藝的對比實驗，結果發(fā)現，冷凍干燥過程復雜、耗時長、能耗高，且單次處理量少，只適合實驗室操作，不適合在生產中應用。而噴霧干燥過程簡單、耗時短，兼具可連續(xù)進料、處理量大和成本低廉、設備簡單、可在生產中應用等特點。本設計采用噴霧冷凍干燥工藝處理蛋白濃縮的液，干燥過程為先濃縮后干燥。濃縮條件為在50～60℃,0.1MPa,真空濃縮至約100mL。然后進行噴霧干燥，出風溫度控制在65～95℃之間。2.4疫苗的灌裝工藝(1)將兩種干燥好的蛋白質按比例混合，并加入佐劑，A1(OH)?;(2)預充注射器包裝上貼簽、裝盒。2.5各項指標檢測疫苗主要成分為具有免疫活性的物質。在疫苗的生產過程中，所使用到的材料的來源和種類都各不相同，并且生產工藝復雜同時易受多種因素影響，所以在實際的生產過程中應該做到對每一個工藝環(huán)節(jié)以及每個工藝所使用到的每一種材料進行質量控制，并且根據實際生產狀況制定出適用于生產的質量控制標準。表2.5各階段檢測項目菌種培養(yǎng)的過程中培養(yǎng)物收獲后疫苗成品細菌純度菌體純度疫苗鑒別細菌總數培養(yǎng)基pH值培養(yǎng)基耗氧量細菌總數活菌含量抗原含量疫苗理化測定疫苗純度測定疫苗效力測定疫苗異常毒性檢查疫苗無菌檢查疫苗細菌內毒素檢查疫苗中工藝雜質殘留物2.5.1蛋白無菌檢測取待測蛋白樣品各5份，按照1:50的比例將樣品接種至T.G培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)3天，培養(yǎng)完成后按照表2.6完成后續(xù)檢測。表2.6無菌檢測后續(xù)操作方法TBS小管T.G培養(yǎng)基取樣量培養(yǎng)溫度培養(yǎng)天數理應培養(yǎng)結果無菌生長2.5.2蛋白純度檢測取20μL蛋白進行SDS電泳，方法按照《分子克隆實驗指南》(第三版)聚丙烯酰胺凝膠電泳方案操作。目的蛋白純度應不低于90%。2.5.3蛋白濃度檢測本設計采用BCA蛋白濃度測定試劑盒微孔酶標儀法檢測蛋白濃度，方法以2.5.4蛋白內毒素檢測本設計采用內毒素檢測試劑盒凝膠法檢測抗原中內毒素含量，方法以試劑盒分別將HPV16蛋白和HPV18蛋白用包被緩沖液稀釋，加入96孔板中培養(yǎng)；加入室溫封閉；加入稀釋的血清樣本、標準品及陽性質控血清室溫孵育；加入HRP標記的羊抗人IgG室溫孵育；加入底物顯色液，顯色30min;用0.18mol/L硫酸終止顯色反應。于酶標儀450nm波長處讀取A值。以陰性血清及陽性血清注：除終止顯色反應外，每步操作前均需要用PBST充分洗滌樣品。將誘導完成后收集的菌液，進行SDS分析，確定目的蛋白的表達，方法按照《生物化學試驗手冊》聚丙烯酰胺凝膠電泳方案操作。2.6工藝流程實輸室踏段菌種菌種擴大培養(yǎng)發(fā)牌階段發(fā)肺滯清發(fā)酵語實消發(fā)酵藏發(fā)酵霾蛋白趣樣純化階段洗滌。破碎包涵體溶鮮親和服析包涵體整性。濃雄真空冷凍干煤取樣檢潤階段無葡檢測純度檢測濃度檢測類毒素檢測活性檢測表達與WB檢測灌裝階段兩種藍白混合加入佐劑貼簽裝盒圖2.2工藝流程圖3工藝計算3.1工藝基礎數據根據車間生產要求，該車間所設計的人乳頭瘤病毒疫苗的生產能力為50萬支，每支含有40μgHPV16重組蛋白、20μgHPV18重組蛋白、210μg鋁鹽，Al(OH)3,為預充注射器包裝，劑型為注射劑，規(guī)格為60μg/0.5mL/支。即需要16型重組蛋白20000mg,18型重組蛋白10000mg。按照全年365天計算，放假和大中修理等特殊情況約共45天。則全年工作日365-45=320d為了達到生產目標則每天的生產能力為：16型重組蛋白2000÷320=62.50mg/d18型重組蛋白1000÷320=31.25mg/d全天24小時不間斷工作則每小時的生產能力為：16型重組蛋白62.50÷24=2.604mg/h18型重組蛋白31.25÷24=1.302mg/h生產工藝屬于間歇式生產工藝，周期為32個小時，則全年的周期為：320×24÷32=240個周期則每個周期的生產能力為：16型重組蛋白2.604×32=83.328mg/周期18型重組蛋白1.302×32=41.664mg/周期已知HP親和層析的收率為75.3%[11],在包涵體溶解復性階段收率為14.7%[]、在濃縮階段收率為90.3%I3.2發(fā)酵罐的選型20mg目的蛋白，本設計采用容積約10L發(fā)酵罐，填充率為30%,通風發(fā)酵。發(fā)酵罐參數比例高徑比H?:D攪拌器直徑D;相鄰兩組攪拌器的間距S擋板寬度W擋板與罐壁的距離Bh?+ho封頭高度h其中h?=(1/4)D當封頭公稱直徑≤2m時，hb=25mm;當封頭公稱直徑>2m時，ho=40mm液柱高度HrHo?+ha+液柱高度Hr (η為裝料系數)圖3.1發(fā)酵罐示意圖3.2.1發(fā)酵罐臺數的確定D一罐內徑D一攪拌游直徑S一和鄰兩組攪件器的距H—雄總高度H—傾柱高度H一液柱高度C一下組攪拌路與罐底距商W—當板覺度B—擋板與罐壁的部離h一坩頭高度h?一封頭短書秈高度九一坩頭直達高度發(fā)酵16型重組蛋白所需發(fā)酵罐數量：發(fā)酵18型重組蛋白所需發(fā)酵罐數量：3.2.2主要尺寸的計算圓柱部分體積V1:橢圓形封頭體積V2:(式1)(式3)H?=H?η+h?+h?(式4)發(fā)酵罐參數數值發(fā)酵罐直徑D(mm)相鄰兩組攪拌器的間距S(mm)封頭短半軸高度h?(mm)封頭直達高度h(mm)圓柱部分體積V?(L)植圓形封頭體積V?(L)3.2.3發(fā)酵罐冷卻面積的計算本設計發(fā)酵罐選用的換熱器為內部豎式列管換熱器。20℃,冷卻水出水溫度約30℃,發(fā)酵液溫度37℃,發(fā)酵液比熱容c=4kJ·kg1.℃1,發(fā)酵液裝液量V:V=10L×30%=3L放出熱量Q:Q=mcAt=Ve△t=473.34kJ·h-1(式5)(式6)換熱面積F:3.2.4發(fā)酵罐攪拌器的設計為了最大程度增加溶氧量，本設計采用六直葉圓盤渦輪攪拌器，攪拌器直徑D;=57mm。(1)攪拌器主要尺寸攪拌器葉寬K:K=0.2D=28.5mm攪拌器圓盤直徑R:(2)轉速轉速采用150rbp/min。3.2.5發(fā)酵罐設備結構的空氣分布器本罐使用單管進風。3.2.6發(fā)酵罐的密封方式本罐采用雙面機械密封方式，處理軸與罐的動靜問題。3.2.7發(fā)酵罐設備材料的選擇設備采用1Gr18Ni9Ti制作。3.2.8發(fā)酵罐支座的選擇因發(fā)酵罐較小，可選用支承式支座。支承式支座實際承受載荷Q:其中水平力P:P=am,g+0.25Pv(式8)其中水平風載荷Pw:式8、9、10中：k一不均勻系數，安裝3個支座時支k=1;m?一設備總重量(包括殼極基附件，內部介質基保溫層溫層的質量kg;3.3種子罐的選型本設計發(fā)酵罐接種量為5%,每周期運作30個填充率為30%的10L發(fā)酵罐，則至少需要4.5L種子液，因此可采用容積約10L發(fā)酵罐，填充率為50%,通風按照表3.1對發(fā)酵罐進行相應的設計。3.3.1種子罐臺數的確定3.3.2主要尺寸的計算橢圓形封頭體積V2:罐的全容積V0:液柱高度HL:H?=H?η+h?+h?表3.2計算得種子罐參數及尺寸(式1)(式2)(式3)(式4)發(fā)酵罐參數數值員柱部分高Ho(mm)發(fā)酵罐直徑D(mm)攪拌器直徑D;(mm)擋板寬度W(mm)擋板與罐壁的距離B(mm)相鄰兩組攪拌器的間距S(mm)封頭短半軸高度h?(mm)封頭直達高度h,(mm)圓柱部分體積V?(L)橢圓形封頭體積V?(L)液柱高度Hr(mm)3.3.3種子罐冷卻面積的計算本設計發(fā)酵罐選用的換熱器為內部豎式列管換熱器。平均溫差為：發(fā)酵液裝液量V:V=10L×50%=5L放出熱量Q:Q=mcAt=Vpe△t=7889kJ·h1換熱面積F:(式6)3.3.4種子罐攪拌器的設計為了最大程度增加溶氧量，本設計采用六直葉圓盤渦輪攪拌器，攪拌器直徑D;=57mm。(3)攪拌器主要尺寸攪拌器葉寬K:K=0.2D=28.5mm攪拌器圓盤直徑R:δ=8mm(4)轉速轉速采用150rbp/min。3.3.5種子罐設備結構的空氣分布器本罐使用單管進風。3.3.6種子罐的密封方式本罐采用雙面機械密封方式，處理軸與罐的動靜問題。3.3.7種子罐設備材料的選擇設備采用1Gr18Ni9Ti制作。3.3.8種子罐支座的選擇其中水平力P:其中水平風載荷Pw:Pw=1.2fq?D?H?×10(式10)式8、9、10中：D—支麻安裝尺寸，nm,D=2s?;g—重力加速度，取g=9.8m/3;k—不均勻系數，安裝3個支座時支k=1;m?一設備總重量(包括殼極基附件，內部介質基保溫層溫層的質量kg;n—支座數量；a—地震影響震影響根據式8、9、10可得出Q=12.015kN。由JB/T4712.4-2007表2查A型支座允許載荷[Q]=20KN。經計算，結果所選支座滿足需求。3.4原料消耗計算3.4.1每周期消耗培養(yǎng)基計算由3.2.1可知每周期共需要30個10L發(fā)酵罐。表3.1每周期消耗培養(yǎng)基的量培養(yǎng)基名稱計算方式培養(yǎng)基成分含量(g)搖瓶種子培養(yǎng)基接種量5%,每周期運作30蛋白胨個發(fā)酵罐，按5%的損失計酵母粉算，則需要4.725L/周期氯化鈉發(fā)酵基礎培養(yǎng)基每個發(fā)酵罐裝液量為30%,損失量為5%,則需要94.5L/周期蛋白胨酵母粉葡萄糖微量元素溶液流加培養(yǎng)基平均流加速度為80mL/h,共發(fā)酵2h,損失量為5%,則需要5.04I流加速度35mL/h,誘導8h誘導前誘導后蛋白胨酵母粉葡萄糖MgSO4·7H2O甘油微量元素溶液每升發(fā)酵基礎培養(yǎng)基需要1mL微量元素溶液，每周期需要94.5L發(fā)酵基礎培養(yǎng)基，損失量為5%,則需要100mLFeSO4·7H2OMnC12·4H2O3.4.2原料消耗匯總表表3.2每周期原料消耗匯總表試劑名稱每周期用量葡萄糖氯化鈉酵母粉蛋白胨甘油MgSO4MgSO4·7H20K2HPO4FeSO4·7H2OCoSO4·7H2OMnC12·4H2OCaC12·2H2OZnSO4·7H2OCuC122H2O928.625g0.2800g0.2800g0.2000g0.1500g0.0300g0.0204g3.5熱量衡算生產工藝中需要消耗能量主要在發(fā)酵過程，其他流程消耗熱量較少，不進行3.5.1發(fā)酵工藝熱量計算(1)種子罐罐空消蒸汽用量(2)種子罐實消蒸汽用量經過發(fā)酵罐實消，發(fā)酵液溫度為121℃,發(fā)酵液起始溫度(室溫)為25℃,Q=cm△t=1.815x10kJQ=1.2Q=2.178×10°kJ(3)發(fā)酵罐空消蒸汽用量V=300×0.5×(127-20)÷(2706580-533.83×4.186=20.615kg(4)發(fā)酵罐實消蒸汽用量經過發(fā)酵罐實消，發(fā)酵液溫度為121℃,發(fā)酵液起始溫度(室溫)為25℃,已知發(fā)酵液比熱容c=4kJ·kg1.℃1,則發(fā)酵液從25℃加熱到121℃所需要吸收的Q=cmAt=1.089×10°kJQ=1.2Q=1.306×10°kJ通過查表可得0.2MPa的飽和水蒸氣，溫度121℃,汽化潛熱值r=22017kJ/kg,則水蒸氣消耗量m已知種子罐填充率50%,通氣速率1vvm,可得種子罐無菌空氣量V:V=種子罐體積x通氣速率x填充率=5×10?m3/h(式11)已知發(fā)酵罐填充率30%,通氣速率1vvm,可得單罐發(fā)酵罐無菌空氣量V:(式12)V=發(fā)酵罐體積x通氣速率x填充率=3×10*m3/h(式12)3.6其他主要設備選型3.6.1高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋選用雙扉滅菌柜，干熱、濕熱各一臺，其主要參數如下表：(1)雙扉式干熱滅菌柜的選型干熱滅菌柜選用南京維鋼機械科技有限公司的DMH系列雙扉式干熱滅菌柜，其主要參數如下：參數工作室尺寸外形尺寸加熱功率循環(huán)風機功率排濕、冷卻風機功率溫度范圍重量配套電機主要材質800×800×1000(mm)1850×1200×1950(mm)250W+250W室溫-350℃(可調)不銹鋼316L,外不銹鋼304-2B(2)濕熱滅菌器的選型濕熱滅菌器選用河南省匯邦醫(yī)療器械有限公司的SQ-Z60大型脈動蒸汽滅菌器，其主要參數如下表：參數容積產品形式加熱方式功率電源外形尺寸內膽尺寸重量設計壓力額定工作壓力設計溫度工作溫度脈動次數立式電加熱1190×810×1580(mm)①500*1000(mm)0-99次3.6.2切向流過濾系統切向流過濾系統選用美國Cytiva的GE?KTAMflux全自動切向流過濾系統，設備如下圖：3.6.3去鹽濃縮設備去鹽濃縮設備選用德蘭梅勒的電滲析除鹽系統濃縮設備，設備如下圖：3.6.4離心機的選型離心機選用湖南湘儀離心機儀器有限公司的高速冷凍離心機H2500R-2,其主要參數如下表：參數H2500R-2支持電源溫度精度最高轉速總功率最短加/減速時間最大相對離心力整機噪聲轉速精度最大容量外形尺寸(長×寬×高)轉子識別定時范圍外包裝尺寸(長×寬×高)凈重溫度設置范圍AC220±22V,50Hz,25A25000r/min64800xg<62dB(A)4×1000mL730x930x960(mm)/lmin～99h:59min920×1040×1560(mm-20～40℃離心腔直徑3.6.5高壓均質機高壓均質機選用上海巴崴奧商貿有限公司的M-110EH高壓微射流均質機，其主要參數如下：參數M-110EH最高處理壓力最大流量最高進料溫度電源要求儀器管路壓縮空氣要求樣品最小加入量機器尺寸重量30000psi(172MPa)450mL/mir3Ph,380V,5HP(3.7KW)壓力為35-150psi,在50psi壓力下流量為1SCFM,露點溫度為0-35F73×87×148cm3.6.6噴霧冷凍干燥機噴霧冷凍干燥機選用無錫市精誠粉體機械有限公司的YPG-50壓力噴霧干燥機，其主要參數如下：參數YPG-50進風溫度排風溫度水分蒸發(fā)量加熱方式干燥塔直徑外形尺寸70-110℃高壓蒸汽或蒸汽+電6×4×133.6.7粉針劑分裝機粉針劑分裝機選用長沙一星制藥機械有限公司的預充式注射器準全自動灌裝機YCF2(2)Z型，其主要參數如下：參數YCF2(2)Z型適用規(guī)格生產能力灌裝頭數加塞頭數預消毒注射器、卡式瓶0.5-20ml2個2個灌裝泵控制及驅動方式灌裝精度加塞合格率電功率機器重量外形尺寸陶瓷轉閥泵伺服數控控制系統(全伺服型)(含層流罩)2500mm×1200mm×2400mm(L×W×H)(含層流罩)3.7輔助部門3.7.1理化分析室理化分析室用于蛋白純度檢測、濃度檢測、毒素檢測、活性檢測、表達與Westernblot檢測。3.7.2微生物實驗室微生物實驗室用來分析菌種的純度，以及蛋白的無菌檢測。3.7.3原料倉庫菌種的保藏有嚴格的環(huán)境要求，應額外設置一個倉庫滿足菌種保藏的需求。3.7.4成品倉庫成品倉庫應建于生產車間內的一個獨立房間，避免污染。3.7.5供水系統本設計的工廠用水有為下面幾處：(1)生活用水；(2)消防用水；(3)生產工藝過程用水；(4)化驗用水；(5)設備清洗用水。工廠用水需要以經濟合理為原則，首要考慮安全性。由于本設計為藥品生產工廠，諸多步驟需要使用到去離子水等，因此還需專門的制水設備，同時需要監(jiān)控好水質。3.7.6供氣系統本設計所使用的天然氣由當地天然氣公司供應，理應供應壓力為0.1MPa。天然氣的作用在本設計中占據非常重要一部分，如種子罐、發(fā)酵罐的空消和實消等。所以本設計設計在車間內設立分氣缸，以便滿足各生產流程的需求。3.7.7供電系統本設計所使用的電由當地供電局提供，理應供應為高壓供電，由于車間設備最大電壓為380/220V,所以需設立配電房將電壓降低在輸送至各車間。4全廠車間布置概況廠房的運行需要GMP認證，在GMP認證檢查中，廠房的工藝布局為重要檢查項目之一。WHO的GMP對廠房要求的原則是以下三點：①廠房選址②設計③施工、改造和保養(yǎng)適合生產操作。廠房的布局必須服從以下三點：①低危險性②無交叉污染③能有效地清潔和保養(yǎng)。為了避免產品質量在生產的各個階段均無負面影響，《藥品生產質量管理規(guī)范(1998年修訂)》(即GMP)中的第九條明確指出：“廠房應按生產工藝流程及所要求的空氣潔凈級別進行合理布局”。這一條例是要求廠房的工藝布局須在人流、物流均無交叉且互不干擾的前提下按照生產工藝流程