實(shí)驗(yàn)七酵母醇脫氫酶的提純

關(guān)于實(shí)驗(yàn)七酵母醇脫氫酶的提純1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握目的物質(zhì)的提純掌握酵母醇脫氫酶的提純方法和原理掌握酵母醇脫氫酶活力測(cè)定的方法

第2頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)和難點(diǎn)2.1實(shí)驗(yàn)原理2.1酶活力測(cè)定第3頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、實(shí)驗(yàn)原理酶是一類由活細(xì)胞產(chǎn)生的，對(duì)其特異底物具有高效催化作用的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)部分：酶蛋白(apoenzyme)輔助因子(cofactor)金屬離子小分子有機(jī)化合物全酶(holoenzyme)第4頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶蛋白決定反應(yīng)的特異性輔助因子決定反應(yīng)的種類與性質(zhì)金屬離子的作用穩(wěn)定酶的構(gòu)象；參與催化反應(yīng)，傳遞電子；在酶與底物間起橋梁作用；中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力等。小分子有機(jī)化合物的作用在反應(yīng)中起運(yùn)載體的作用，傳遞電子、質(zhì)子或其它基團(tuán)。第5頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天NAD+尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸,輔酶I

當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)。酶活力(EnzymeActivity)也稱酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活性是研究酶的特性、分離純化以及酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用時(shí)的一項(xiàng)不可缺少的指標(biāo)。酶活力是用在一定條件下，它所催化某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度來(lái)表示。酶反應(yīng)速度(指初速度)可用單位時(shí)間內(nèi)單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示.其單位為mol/s。第6頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天

比活力(性)(SpecificActivity)是酶純度的量度，即指：?jiǎn)挝恢亓康牡鞍踪|(zhì)中所具有酶的活力單位數(shù)，一般用IU/mg蛋白質(zhì)來(lái)表示。一般來(lái)說(shuō)，酶的比活力越高，酶越純.第7頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天抽提由于大多數(shù)酶蛋白屬于球蛋白，因此，一般可用稀鹽、稀酸或稀堿的水溶液抽提酶。抽提液的具體組成和抽提條件的選擇，取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶與其他物質(zhì)的連結(jié)。選用pH，首先考慮酶的穩(wěn)定性。選用pH不應(yīng)超過(guò)酶的pH穩(wěn)定范圍。其次，從抽提效果出發(fā)，最好遠(yuǎn)離待抽提酶的等電點(diǎn)。也就是說(shuō)，酸性蛋白宜用堿性溶液抽提；堿性蛋白宜用酸性溶液抽提。第三，在某些情況下，抽提還兼有切斷酶與細(xì)胞內(nèi)其它成分間可能有的聯(lián)系，從這點(diǎn)出發(fā)，選用pH4—6為佳。第8頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天鹽大多數(shù)蛋白質(zhì)在低濃度的鹽溶液中有較大的溶解度。所以，抽提液一般采用等滲溶液。最普通的為0.020—0.050mol/L的磷酸緩沖液,0.15mol/LNaCl等。焦磷酸鈉和檸檬酸鈉的緩沖液有助于切斷酶和其他物質(zhì)的聯(lián)系,也常用.據(jù)報(bào)道，少數(shù)情況下用水抽提亦佳,這可能與低滲破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān).溫度通常控制在0一4℃左右.如果酶比較穩(wěn)定時(shí)，可以例外。第9頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天抽提液用量常采用原料量的1—5倍。有時(shí)，為了抽提效果好些需要反復(fù)抽提。濃縮提取液或發(fā)酵液的酶蛋白濃度一般很低，如發(fā)酵液中酶蛋白濃度一般為0.1％一1％。因此，在分離純化過(guò)程中，酶溶液往往需要濃縮。濃縮的方法很多，如：鹽析或溶劑沉淀法、超過(guò)濾法、離子交換樹(shù)脂法等。這些方法既是濃縮的方法，又是分離純化的手段。再如真空濃縮、冷凍濃縮法、蒸發(fā)法、凝膠吸水法、聚乙二醇吸水法等。第10頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶和雜蛋白的性質(zhì)差異大體上可有以下幾個(gè)方面，根據(jù)這些差異.其分離方法可有：

(1)根據(jù)分子大小輕重設(shè)計(jì)的方法。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過(guò)濾法等。

(2)根據(jù)溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。

(3)按分子所帶正負(fù)電荷多少分離的方法，如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。

(4)按穩(wěn)定性差異建立的分離方法，如選擇性熱變性法表面變性法等。

(5)按親和作用的差異建立的分離方法，如親和層析法等.第11頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天結(jié)晶是指分子通過(guò)氫鍵、離子鍵或分子間力按規(guī)則并且周期性排列的一種固體形式，由于各種分子間形成結(jié)晶的條件不同，也由于變性蛋白質(zhì)和酶不能形成結(jié)晶，因此，結(jié)晶既是一種酶是否純凈的標(biāo)志，又是一種酶和雜蛋白分離的方法。第12頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天鹽冰浴的降溫原理與溶液的凝固點(diǎn)下降有關(guān)。當(dāng)食鹽和冰均勻地混合在一起時(shí)，冰因吸收環(huán)境熱量稍有融化變成水，食鹽遇水而溶解，使表面水形成了濃鹽溶液。由于濃鹽溶液的冰點(diǎn)較純水低，而此時(shí)體系中為濃鹽溶液和冰共存，因此體系的溫度必須下降才能維持這一共存狀態(tài)（濃鹽溶液和冰的共存溫度應(yīng)該比純水的冰點(diǎn)更低）。這將導(dǎo)致更多的冰融化變成水來(lái)稀釋濃鹽溶液，在融化過(guò)程中因大量吸熱而使體系溫度降低。

第13頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天低溫冰鹽浴配方：(碎冰用量100克)

浴溫(℃)鹽類及用量(克)

-4.0CaCl2?6H2O(20g)

-9.0CaCl2?6H2O(41g)

-21.5CaCl2?6H2O(81g)

-40.3CaCl2?6H2O(124g)

-54.9CaCl2?6H2O(143g)

-21.3NaCl(33g)

-17.7NaNO3(50g)-30.0NH4Cl(20g)+NaCl(40g)

-30.6NH4NO3(32g)+NH4CNS(59g)-30.2NH4Cl(13g)+NaNO3(37.5g)-34.1KNO3(2g)+KCNS(112g)-37.4NH4CNS(39.5g)+NaNO3(54.4g)-40NH4NO3(42g)+NaCl(42g)第14頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天酵母醇脫氫酶醇脫氫酶的輔酶NAD，能催化乙醇脫氫變成乙醛，脫下的氫則使NAD還原。當(dāng)有過(guò)量醇存在時(shí)，NAD+被還原的速度與酶活力成正比，酶活力越高，單位時(shí)間產(chǎn)生的NADH越多。NADH對(duì)340nm紫外線有強(qiáng)吸收，NAD+無(wú)此能力，因此可以測(cè)定A340nm的方法測(cè)得反應(yīng)體系中NADH含量，從而得知酶活力的大小。第15頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、操作步驟1）粗提：20g酵母干粉中加入80mL0.066MNa2HPO4溶液中37℃水浴2h，室溫放置3h，4000rpm冷凍離心20min;（目的是活化酵母，使其分泌酵母醇脫氫酶，并提取醇脫氫酶到溶液中）2)熱變性沉淀雜蛋白：每組取上清液20ml，留取2mL到試管①中（冰?。?，其余的放置于55℃水浴20min，迅速冷卻；4000rpm冷凍離心20min；（目的是去除熱敏感性蛋白質(zhì)）3）有機(jī)溶劑沉淀雜蛋白：取上清液，留取2mL到試管②中（冰?。?，其余的量體積后，在鹽冰浴條件下加入0.5倍體積的冰丙酮，混勻，靜止5min，4000rpm冷凍離心20min；（目的去除雜蛋白）第16頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天4）有機(jī)溶劑沉淀酵母醇脫氫酶：取上清液，留取2mL到試管③中（冰?。?，其余的量體積后，在鹽冰浴條件下逐滴加入0.55倍體積的冰丙酮，沉淀完全后，4000rpm冷凍離心20min；（目的是沉淀酵母醇脫氫酶）5）棄上清，加入5ml水溶解沉淀，置于試管④中（冰?。?；6）將每一步獲得的溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，測(cè)定酶活（利用催化醇脫氫的方法）和蛋白質(zhì)濃度（利用考馬斯亮藍(lán)法）；目的是確定每一步的純化效果。第17頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)定蛋白質(zhì)濃度：從試管①②③④中分別取0.2ml，用0.9%NaCl定容至20ml，置于試管①’②’③’④’中。試管0①’②’③’④’樣液（ml）011110.9%NaCl（ml）10000考馬斯亮藍(lán)（ml）44444第18頁(yè),共21頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)定酶活力：將試管①②③④按以下比例稀釋：①1ml＋4mlK2HPO4②0.5ml＋4.5mlK2HPO4③0.5ml＋4.5mlK2HPO4④0.5ml＋4.5mlK2HPO4

向石英比色皿中依次加入0.06M焦磷酸鈉0.5ml，3M乙醇0.1ml，0.0015MNAD0.1ml，蒸餾水2.2ml，稀釋的樣液1ml（對(duì)照液中加蒸餾水）。每隔15s測(cè)一次A340，直至不變。以每分鐘