非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法1、范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的試劑、儀器和耗材、操作步驟、結(jié)果判定、實(shí)驗(yàn)室生物安全等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬脾臟、淋巴結(jié)、血液等組織和血粉中非洲豬瘟病毒核酸的檢測(cè)。2、規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489

實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541

獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3、試劑3.1

DNA提取試劑DNA提取試劑的配制見(jiàn)附錄A，或選取商品化的病毒DNA提取試劑盒并參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。3.2

2×PCR緩沖液2

×

PCR緩沖液的配制見(jiàn)附錄A。3.3

引物探針3.3.1

采用針對(duì)非洲豬瘟病毒VP72基因（核苷酸序列見(jiàn)附錄B）的引物及探針：上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'熒光探針ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'3.3.2

可以使用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）在陸生動(dòng)物診斷技術(shù)和疫苗手冊(cè)（ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals）第2.8.1章AfricanSwineFever中提供的引物和探針，并按照手冊(cè)中規(guī)定的檢測(cè)程序和判定標(biāo)準(zhǔn)操作：上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'下游引物ASF-OIE-rPCRR：5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'熒光探針ASF-OIE-Probe：5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3

使用國(guó)家農(nóng)業(yè)行政主管部門(mén)批準(zhǔn)的其他引物、探針，應(yīng)對(duì)檢測(cè)程序和判定標(biāo)準(zhǔn)作相應(yīng)調(diào)整。3.4

陰性及陽(yáng)性對(duì)照陰性及陽(yáng)性對(duì)照的制備方法見(jiàn)附錄C。3.5

其他試劑消毒液、5U/μLTaqDNA聚合酶、無(wú)菌無(wú)核酸酶水、0.01mol/LPBS（pH7.2）。消毒液配制見(jiàn)附錄A，0.01mol/LPBS配制見(jiàn)附錄A。4、儀器和耗材分析天平（感量0.1mg）、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（最高離心速度不低于12000r/min）、冰盒、實(shí)時(shí)熒光PCR儀及配套反應(yīng)管（板）、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2

μL，20

μL，200μL，1000

μL）、1.5mL離心管（無(wú)核酸酶）。5、操作步驟5.1

樣品采集及運(yùn)輸樣品采集及運(yùn)輸按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行，采集豬的脾臟、淋巴結(jié)、血液等組織材料或血粉用于檢測(cè)，樣品應(yīng)在冷藏條件下盡快運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，避免反復(fù)凍融。采樣時(shí)應(yīng)穿戴個(gè)人生物安全防護(hù)裝備，實(shí)施現(xiàn)場(chǎng)消毒和廢棄物處理。5.2

樣品處理檢測(cè)前樣品應(yīng)在二級(jí)生物安全柜中處理。取0.1g～0.2g組織或血粉，經(jīng)研磨破碎后加1mL的0.01mol/LPBS（pH7.2）制成勻漿，經(jīng)10000r/min離心取上清；全血、血清樣品直接取1mL，置于1.5mL離心管內(nèi)蓋緊管帽。將上述處理的樣品置于60℃條件下滅活30min。5.3

樣品保存采集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h；如需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過(guò)3次）。5.4

病毒DNA提取5.4.1

DNA提取應(yīng)在樣本制備區(qū)內(nèi)采用以下方法進(jìn)行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑，則按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。5.4.2

待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的份數(shù)總和用n表示，取n個(gè)滅菌1.5mL離心管，逐管編號(hào)。5.4.3

每管加入200μLDNA提取液1，然后分別加入待測(cè)樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各200μL，1份樣品換用1個(gè)吸頭，混勻器上震蕩混勻5s。于4℃～25℃條件下，13000r/min離心10min。DNA提取液1見(jiàn)附錄A。5.4.4

盡可能吸取上清、棄去，吸頭不要碰到沉淀，再加入10

μLDNA提取液2，混勻器上震蕩混勻5s。于4℃～25℃條件下，2000r/min離心10s。DNA提取液2見(jiàn)附錄A。5.4.5

100℃干浴或沸水浴10min。5.4.6

加入90μL無(wú)DNA酶的滅菌去離子水，13000r/min離心10min，上清即為提取的DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。無(wú)DNA酶的滅菌去離子水見(jiàn)附錄A。5.5

實(shí)時(shí)熒光PCR操作5.5.1

在反應(yīng)混合物配制區(qū)、樣品制備區(qū)和檢測(cè)區(qū)分別進(jìn)行5.5.2～5.5.4。5.5.2

每個(gè)檢測(cè)反應(yīng)體系需使用20μL實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液。根據(jù)5.4.2中設(shè)定的n值，按附錄D配制反應(yīng)液，充分混勻后分裝，每個(gè)PCR反應(yīng)管20μL。轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)管至樣品制備區(qū)。5.5.3

在上述5.5.2的反應(yīng)管中分別加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管總體積達(dá)到25

μL，記錄反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的樣品編號(hào)。蓋緊管蓋后，瞬時(shí)離心。5.5.4

將5.5.3加樣后的反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄反應(yīng)管擺放順序。選定5-羧基熒光素（FAM）作為報(bào)告基團(tuán)，小溝結(jié)合物（MGB）為淬滅基團(tuán)，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)變性95℃/3min；95℃/15s，52℃/10s，60℃/35s，45個(gè)循環(huán)；在每次循環(huán)的60℃退火延伸時(shí)收集熒光。試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)收集的Ct值和熒光曲線判定結(jié)果。6、結(jié)果判定6.1

結(jié)果分析條件設(shè)定實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)閾值設(shè)定原則：閾值線超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且相交于陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的拐點(diǎn)，或根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整。每個(gè)樣品反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值。6.2

結(jié)果描述及判定當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤28.0且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)Ct值無(wú)擴(kuò)增曲線時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立，實(shí)例參考附錄E。當(dāng)被檢樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線且Ct值≤38.0時(shí)，判為非洲豬瘟病毒核酸陽(yáng)性；被檢樣品無(wú)Ct值，判為非洲豬瘟病毒核酸陰性；對(duì)于Ct值＞38.0的樣品且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，應(yīng)重檢，重檢仍出現(xiàn)上述結(jié)果的判為陽(yáng)性，否則判為陰性。7、實(shí)驗(yàn)室生物安全要求7.1

本方法涉及非洲豬瘟感染性樣品的實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在（動(dòng)物）生物安全三級(jí)試驗(yàn)室中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室生物安全管理要求見(jiàn)GB19489。國(guó)家農(nóng)業(yè)行政主管部門(mén)另有規(guī)定的，按其規(guī)定執(zhí)行。7.2

使用過(guò)的實(shí)驗(yàn)器材和液體廢棄物應(yīng)先經(jīng)過(guò)消毒液浸泡處理，再經(jīng)高溫高壓處理后廢棄。剩余樣品等固體廢棄物應(yīng)在生物安全柜中密封包裝，經(jīng)表面消毒后移出，再經(jīng)高溫高壓處理后廢棄。一附錄

A

(規(guī)范性附錄)

試劑的配制A.1DNA提取液1PEG8000晶體20.74g，NaCL17.53g，加去離子水定容到100mL。A.2DNA提取液21mol/LTris.Hcl2mL，2mol/LKCL5mL，0.5mol/LEDTA0.5mL，NP-401mL，加去離子水定容到100mL。即KCL14.912g，Tris堿12.114g，1.2068mL濃HCl，EDTA14.612g，NaOH6g,

加去離子水定容到100mL。A.32×PCR緩沖液滅菌去離子水

70mL三羥甲基氨基甲烷（Tris）

0.79g氯化鉀

1.865g曲拉通X-1000.5mLdATP(100mmol/L)2.5mLdTTP(100mmol/L)2.5mLdGTP(100mmol/L)2.5mLdCTP(100mmol/L)2.5mL六水氯化鎂

0.61g鹽酸調(diào)pH至9.0滅菌去離子水加至100mLA.4

消毒液8‰氫氧化鈉或3‰福爾馬林或3%鄰苯基苯酚或碘化合物等其他消毒試劑均可。A.5

磷酸鹽緩沖液（PBS）的配方A.5.1A液0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液：NaH2PO4·H2O27.6g，溶于蒸餾水中，最后定容至1000mL。A.5.2B液0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液：Na2HPO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g），加蒸餾水溶解，最后定容至1000mL。A.5.30.01mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制取A液14mL、B液36mL，加NaCl8.5g，用蒸餾水定容至1000mL。經(jīng)過(guò)濾除菌后，無(wú)菌條件下分裝。A.6

無(wú)DNA酶的滅菌去離子水無(wú)DNA酶的滅菌去離子水是用1%DEPC處理后的去離子水，電阻應(yīng)該大于18.2mΩ。二附錄B（資料性附錄）非洲豬瘟病毒VP72基因參考序列1ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGGGAAGGCCGACAAGATTATA61TTGGCCCAAGACTTGCTGAATAGCAGGATCTCTAACATTAAAAATGTGAACAAAAGTTAT121GGGAAACCCGATCCCGAACCCACTTTGAGTCAAATCGAAGAAACACATTTGGTGCATTTT181AATGCGCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTAGGGTTTGAATACAATAAAGTACGCCCGCAT241ACGGGTACCCCCACCTTGGGAAACAAGCTTACCTTTGGTATTCCCCAGTACGGAGACTTT301TTCCATGATATGGTGGGCCATCATATATTGGGTGCATGTCATTCATCCTGGCAGGATGCT361CCGATTCAGGGCACGTCCCAGATGGGGGCCCATGGGCAGCTTCAAACGTTTCCTCGCAAC421GGATATGACTGGGACAACCAAACACCCTTAGAGGGCGCCGTTTACACGCTTGTAGATCCT481TTTGGAAGACCCATTGTACCCGGCACAAAGAATGCGTACCGAAACTTGGTTTACTACTGC541GAATACCCCGGAGAACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGTAAATGGAAATTCCCTA601GACGAATATAGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAA661ATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCAGTGGCCCT721CTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAACCTATTCTTACCGAT781GAAAATGATACGCAGCGAACGTGTAGCCATACCAACCCGAAATTTCTTTCACAGCATTTT841CCCGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATCACGGAC901GCAACGTATCTGGACATAAGACGTAATGTTCATTACAGCTGTAATGGACCTCAAACCCCT961AAATACTATCAGCCCCCTCTTGCGCTCTGGATTAAGTTGCGCTTTTGGTTTAATGAGAAC1021GTGAACCTTGCTATTCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAGCGCTTTATCACCATAAAG1081CTTGCATCGCAAAAGGATTTGGTGAATGAATTTCCTGGACTTTTTGTACGCCAGTCACGT1141TTTATAGCTGGACGCCCCAGTAGACGCAATATACGCTTTAAACCATGGTTTATCCCAGGA1201GTCATTAATGAAATCTCGCTCACGAATAATGAACTTTACATCAATAACCTGTTTGTAACC1261CCTGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTTCGCTTTTCGCTGATACGTGTCCATAAA1321ACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACCACCACGATGAAAAACTAATGTCTGCTCTTAAA1381TGGCCCATTGAATATATGTTTATAGGATTAAAACCTACCTGGAACATCTCCGATCAAAAT1441CCTCATCAACACCGAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTATGCAGCCC1501ACTCACCACGCAGAGATAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCA1561TCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATT1621TCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCT1681TACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGA