GB-T植物轉(zhuǎn)基因成分測(cè)定 目標(biāo)區(qū)域測(cè)序法征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明

一、任務(wù)來(lái)源

本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)2018年第二批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)

劃，項(xiàng)目編號(hào)“20180930-T-424”。本項(xiàng)任務(wù)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，定于2019

年完成。本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組由江漢大學(xué)等單位共同組成。

二、目的和意義

（一）國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

第一個(gè)遺傳修飾即轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化開(kāi)發(fā)出現(xiàn)在1996年，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，

轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品逐年增加。根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）的報(bào)告，全世

界至2013年，已經(jīng)有27種轉(zhuǎn)基因作物類型和336種品種被開(kāi)發(fā)出來(lái)，在27年國(guó)家種植

面積達(dá)到1.75億公頃。在中國(guó)，至2015年，已經(jīng)有37種轉(zhuǎn)基因作物被批準(zhǔn)進(jìn)口，用作

加工原料。在許多國(guó)家（包括中國(guó)），因?yàn)檎凸姄?dān)心轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的食品安全或環(huán)境

安全的危害，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品持有不信任的態(tài)度。為了保護(hù)公眾的知情權(quán)，許多國(guó)家（也包

括中國(guó)）通過(guò)立法對(duì)轉(zhuǎn)基因食品與飼料進(jìn)行管制和跟蹤。

為了適應(yīng)轉(zhuǎn)基因立法要求和確保產(chǎn)品的合法與可追蹤，有效且精準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因篩選、鑒

定和定量方法是十分必要的。除少部分以蛋白免疫反應(yīng)顯色為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法外，DNA聚

合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法是應(yīng)用最廣泛的方法，也是目前轉(zhuǎn)基因檢

測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的主要方法。根據(jù)檢測(cè)的特異性水平分為篩選方法、基因特異性方

法、載體特異性方法和轉(zhuǎn)基因事件特異性方法。大部分情況下，需要逐個(gè)做一系列的PCR

反應(yīng)來(lái)鑒定待測(cè)樣品中的轉(zhuǎn)基因成分。首先，需要篩選在轉(zhuǎn)基因中常用的元件，然后，對(duì)

篩選獲得的懷疑樣品鑒定事件特異性的序列，以便對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行確認(rèn)。轉(zhuǎn)基因品種數(shù)

量和轉(zhuǎn)基因事件十分龐大且復(fù)雜，因此，單個(gè)PCR反應(yīng)來(lái)鑒定所有的轉(zhuǎn)基因元件與事件是

不現(xiàn)實(shí)的。同時(shí)，單重PCR反應(yīng)鑒定耗時(shí)、費(fèi)力且成本高。因此，在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品快速增長(zhǎng)

的背景下，部分研究者提出了轉(zhuǎn)基因的高通量篩選與鑒定方法。已經(jīng)應(yīng)用的高通量篩選與

鑒定方法包括多重PCR、多重PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)、以及預(yù)制好的實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系。

多重PCR的目的是在單個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)。多重PCR需要對(duì)試劑和引物的濃

度與組成進(jìn)行仔細(xì)的優(yōu)化。由于普通電泳技術(shù)的低分辨率，傳統(tǒng)的多重PCR加電泳檢測(cè)技

術(shù)僅可以檢測(cè)5-6個(gè)目標(biāo)。實(shí)時(shí)PCR多重檢測(cè)的能力也受限于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)通道的數(shù)量限

制和可以獲取的熒光染料的種類的限制。為了解決轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的通量問(wèn)題，一些新技術(shù)被

1

用于了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)中。這些新技術(shù)的策略是將多重PCR與毛細(xì)管電泳或者芯片雜交技

術(shù)相結(jié)合。特別地，DNA芯片具有同時(shí)分析上千種目標(biāo)的能力，我國(guó)也有部分標(biāo)準(zhǔn)采用DNA

芯片雜交進(jìn)行轉(zhuǎn)基因元件的篩選。然而，不論P(yáng)CR產(chǎn)物的檢測(cè)通量有多高，轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)

通量還要受限于多重PCR可以擴(kuò)增的目標(biāo)數(shù)量的限制。其它基于多重PCR開(kāi)發(fā)的技術(shù)所受

到的限制還包括選擇性擴(kuò)增，以及由于多重引物組合并存于同一反應(yīng)中的相互干擾導(dǎo)致的

非特異性背景擴(kuò)增。為了克服末端多重PCR技術(shù)帶來(lái)的上述缺陷，低濃度的引物和少數(shù)PCR

循環(huán)數(shù)的預(yù)擴(kuò)增步驟被用來(lái)增加模板DNA的量。多種高通量DNA檢測(cè)方法中應(yīng)用了預(yù)擴(kuò)增

策略，包括核酸序列擴(kuò)增后芯片雜交技術(shù)、多重定量PCR后芯片雜交技術(shù)和多重微液滴PCR

后的毛細(xì)管電泳技術(shù)。多重定量PCR后芯片雜交技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)91個(gè)目標(biāo)，然而，以

芯片為基礎(chǔ)的分析方法十分復(fù)雜且昂貴，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用中是不現(xiàn)實(shí)的。

商業(yè)化的預(yù)制實(shí)時(shí)PCR芯片通常是96孔或者384孔，里面預(yù)埋了引物與探針，因此，

可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)。例如，JointReaseachCentre開(kāi)發(fā)的實(shí)時(shí)PCR為基礎(chǔ)的96孔板

可以同時(shí)分析2個(gè)樣本的48個(gè)目標(biāo)。也開(kāi)發(fā)了384孔板，用于分析7個(gè)樣本中的47個(gè)目

標(biāo)，且可以重復(fù)2次。一般來(lái)說(shuō)，如果需要分析多個(gè)目標(biāo)，配制好的多重PCR體系只能分

析少數(shù)幾個(gè)樣本。

（二）存在的問(wèn)題

大部分轉(zhuǎn)基因元件，都起源于微生物，而在植物生長(zhǎng)的過(guò)程中，微生物可能感染植物，

導(dǎo)致檢出的轉(zhuǎn)基因元件即可能是轉(zhuǎn)基因成份也可能是微生物基因，因此轉(zhuǎn)基因元件檢測(cè)只

能作物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的篩選手段，還需要根據(jù)轉(zhuǎn)基因事件檢測(cè)進(jìn)行確定。由此，產(chǎn)生了以下

嚴(yán)重的問(wèn)題：

（1）篩選實(shí)驗(yàn)顯著增加了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)成本與時(shí)間；

（2）無(wú)法鑒定未知的轉(zhuǎn)基因事件的產(chǎn)品；

（3）已有的轉(zhuǎn)基因事件數(shù)量寵大，且每次檢測(cè)一種轉(zhuǎn)基因事件，若需要證明產(chǎn)品為

非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，需要做大量的檢測(cè)，不具有現(xiàn)實(shí)可行性，但是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品

又恰恰是公眾與管理部門(mén)關(guān)心的核心問(wèn)題。

現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法都是基于PCR反應(yīng)進(jìn)行的，PCR產(chǎn)物形成的氣溶膠可能污染實(shí)

驗(yàn)室。由此產(chǎn)生以下問(wèn)題：

（1）轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室防污染級(jí)別要求很高；

（2）實(shí)驗(yàn)人員防污染操作要求嚴(yán)格；

（3）轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的假陽(yáng)性無(wú)法徹底避免。

2

最后，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法大多為定性檢測(cè)方法，即使只有0.1%以下的轉(zhuǎn)基因成份，

也會(huì)按照100%的轉(zhuǎn)基因成份等同對(duì)待，導(dǎo)致?tīng)?zhēng)議。

（三）項(xiàng)目的意義

為了解決現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)存在的問(wèn)題，本標(biāo)準(zhǔn)綜合了分子雜交技術(shù)、高通量測(cè)

序技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)，采用目標(biāo)區(qū)域測(cè)序法對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)。在目標(biāo)區(qū)域測(cè)序

法中，外源基因定性與定量鑒定流程如下：第一步，將樣品基因組DNA破碎后連接帶有樣

品條形碼和隨機(jī)條形碼的接頭；第二步，對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；第三步，利用探針捕

獲擴(kuò)增產(chǎn)物；第四步，利用帶有測(cè)序接頭的引物擴(kuò)增捕獲產(chǎn)物構(gòu)建文庫(kù)；第五步，利用二

代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序；最后一步，利用軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制

并獲得鑒定結(jié)果。

目標(biāo)區(qū)域測(cè)序法改進(jìn)了現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的上述局限，包括不同同檢測(cè)多種外源

基因的問(wèn)題、不能檢測(cè)新的轉(zhuǎn)基因事件的問(wèn)題、不能依據(jù)轉(zhuǎn)基因元件確認(rèn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的問(wèn)

題，不能檢測(cè)多種混合生物產(chǎn)品的問(wèn)題、不同外源基因方法不能通用的問(wèn)題、測(cè)試樣本生

物污染造成的假陽(yáng)性問(wèn)題、氣溶膠污染造成的假陽(yáng)性問(wèn)題和轉(zhuǎn)基因成份的定量檢測(cè)問(wèn)題。

總之，本標(biāo)準(zhǔn)的目的是建立適用于所有多種植物轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的準(zhǔn)確、高通量、簡(jiǎn)單、快捷

且定量鑒定標(biāo)準(zhǔn)方法，對(duì)食品安全、環(huán)境安全、轉(zhuǎn)基因安全管理等具有重要意義。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則

（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則

1、科學(xué)性

轉(zhuǎn)基因鑒定結(jié)果往往是行政處罰的依據(jù)，方法的選擇具備科學(xué)性。

2、高效性

海關(guān)或行政抽查，往往需要同時(shí)鑒定大批樣品，標(biāo)準(zhǔn)操作需要遵循高效原則。

3、通用性

現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因鑒定標(biāo)準(zhǔn)中，不同外源基因成份采用不同的鑒定方法，極大地增加了鑒

定工作量，本標(biāo)準(zhǔn)采用的方法具備通用性。

（二）標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)

1、標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)遵循GB1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則》

的有關(guān)要求。

2、標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)內(nèi)容參考我國(guó)相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，包括：GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)

3

驗(yàn)室技術(shù)要求、GB/T19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法、GB/T19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)

品檢測(cè)抽樣和制樣方法和GB/T19495.5轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

（PCR）檢測(cè)方法。

四、標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容

（一）關(guān)于實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析中的準(zhǔn)確性與參數(shù)值的確定。

標(biāo)準(zhǔn)方法同時(shí)檢測(cè)待測(cè)樣品中的多個(gè)外源基因與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，且每個(gè)外源基因與內(nèi)標(biāo)

準(zhǔn)基因同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位置，只要有一個(gè)外源基因的一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)被確證檢出，就可以確定

該待測(cè)樣品為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，極大地降低了測(cè)試樣品假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，每一種外源基因

成份的確認(rèn)需要同時(shí)有外源基因與非外源基因起源物種的邊界序列的雜交序列作為證據(jù)，

極大地降低了微生物污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。利用樣品條形碼，可以區(qū)分空氣中的氣溶

膠和待測(cè)樣品的測(cè)序片段，基本杜絕了空氣污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)?？傊?，標(biāo)準(zhǔn)方法從

多個(gè)層面，極大地降低了轉(zhuǎn)基因定性檢測(cè)的錯(cuò)誤。外源基因與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在同一反應(yīng)體系

中進(jìn)行檢測(cè)，降低了反應(yīng)條件差異對(duì)定量的影響；利用隨機(jī)條形碼還原模板分子極大降地

降低了擴(kuò)增效率的影響；每個(gè)外源基因的檢測(cè)多個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域檢測(cè)多至數(shù)萬(wàn)次，可以

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理，盡量消除系統(tǒng)中殘留的隨機(jī)誤差的影響?？傊?，多個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)共同

作用，增加了轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

本標(biāo)準(zhǔn)利用測(cè)序數(shù)據(jù)同，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的全面監(jiān)控，包括交叉污染、基因組DNA

用量、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序數(shù)量和測(cè)序數(shù)據(jù)中的模板片段數(shù)量，以確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的質(zhì)量與不

合格的原因，根據(jù)不合格的原因作出相應(yīng)的后續(xù)處理方式。結(jié)果監(jiān)控實(shí)驗(yàn)質(zhì)量?jī)?yōu)于在過(guò)程

中進(jìn)行預(yù)防的方式，例如，通過(guò)DNA定量的方式加入一定量的DNA以確保在足夠的DNA分

子用于檢測(cè)，然而，并不能保證定量的準(zhǔn)確性，在不知道問(wèn)題原因時(shí)，也不知道后續(xù)操作

如何進(jìn)行。本標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量監(jiān)控，避免了類似的問(wèn)題。

本標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定測(cè)序的測(cè)序片段數(shù)量為每個(gè)待測(cè)樣本1G，有效Reads（非特異的Reads）

最低按20%計(jì)，那么，最低有0.2G的有效數(shù)據(jù)。那么，按300bp的片段長(zhǎng)度計(jì)算，片段

的Reads數(shù)量為0.65M。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因與外源基因的有效檢測(cè)區(qū)域（存在對(duì)應(yīng)模板DNA的檢

測(cè)區(qū)域）按12個(gè)計(jì)算，那么，平均每個(gè)區(qū)域有5.5萬(wàn)Reads覆蓋。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定按GB/T

19495.5-2018規(guī)定的最低用量使用模板DNA的量，即最低有2.5萬(wàn)個(gè)模板分子。當(dāng)有5.5

4

萬(wàn)Reads去覆蓋2.5萬(wàn)個(gè)模板分子時(shí)，91%的模板分子至少可以被1個(gè)Read所覆蓋，即可

以被檢出，也即每個(gè)探針位點(diǎn)的檢出模板分子的數(shù)量約為2萬(wàn)個(gè)。即使按本標(biāo)準(zhǔn)的最低檢

出限0.1%計(jì)，平均可以檢出的外源基因的模板數(shù)量為20個(gè)，其不被檢出，即檢出的模板

分子的數(shù)目小于2條的理論概率0.05%，理論成功率為99.95%。

利用本標(biāo)準(zhǔn)的方法，我們檢測(cè)了55個(gè)含有1%的外源基因的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)樣品（表一）

和3個(gè)不含有外源基因的標(biāo)準(zhǔn)樣品。其中，55個(gè)含有1%的外源基因的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)樣品均

通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出含有至少一種外源基因成份，成功率100%。3個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的樣品

均通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢測(cè)不含有外源基因成份，成功率100%

表一、轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)樣品清單

序號(hào)產(chǎn)品名稱檢測(cè)參數(shù)

CaMV35S啟動(dòng)子、

1FMV35S啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子、FMV35S啟動(dòng)子、NOS啟動(dòng)子/終止子

NOS啟動(dòng)子/終止子

2NPTII、HPT和PMINPTII、HPT和PMI

3GUSGUS

4CP4-epspsCP4-epsps

5bar或patbar或pat

6BarnaseBarnase

7H7-1甜菜H7-1、FMV35S啟動(dòng)子、Cp4-epsps

8MON863玉米MON863、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、nptII

9MIR604玉米MIR604、NOS終止子

10MIR162玉米MIR162

11NK603玉米NK603、NOS終止子、Cp4-epsps

5

12T25玉米T25、CaMV35S啟動(dòng)子、pat

13MON89034玉米MON89034、CaMV35S啟動(dòng)子、FMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子

14BVLA430101玉米BVLA430101

1559122玉米59122、CaMV35S啟動(dòng)子

16MON88017玉米MON88017、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子

173272玉米3272、NOS終止子

18DAS-40278玉米DAS-40278

19Bt11玉米Bt11、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、cry1Ab

20Bt176玉米Bt176、CaMV35S啟動(dòng)子

21J101苜蓿J101

22MON810玉米MON810、CaMV35S啟動(dòng)子、cry1Ab

23IE09S034玉米IE09S034

24雙抗12-5玉米雙抗12-5

25MON89788大豆MON89788、FMV35S啟動(dòng)子、Cp4-epsps

26A2704-12大豆A2704-12、CaMV35S啟動(dòng)子、pat

27A5547-127大豆A5547-127、CaMV35S啟動(dòng)子、pat

28356043大豆356043、CaMV35S啟動(dòng)子

29305423大豆305423

30CV127大豆CV127

31GTS40-3-2大豆GTS40-3-2、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、Cp4-epsps

32大豆大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

6

33MON87705大豆MON87705、Cp4-epsps

34MON87769大豆MON87769

35MON87708大豆MON87708

36MON87701大豆MON87701

37FG72大豆FG72

38MON1445棉花MON1445、FMV35S啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子

39轉(zhuǎn)Bt基因棉花Bt基因

40LLcotton25棉花LLcotton25、CaMV35S啟動(dòng)子

41MON88913棉花MON88913、CaMV35S啟動(dòng)子、Cp4-epsps

42MON15985棉花MON15985、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、nptII

43GHB614棉花GHB614

44MS1*RF1油菜MS1*RF1

45MS8*RF3油菜MS8*RF3

46MS1*RF2油菜MS1*RF2

47GT73油菜GT73、FMV35S啟動(dòng)子、Cp4-epsps

48T45油菜T45、CaMV35S啟動(dòng)子、pat

49Oxy-235油菜Oxy-235、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子

50Topas油菜Topas

51油菜油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

52MON88302油菜MON88302

53Bt基因水稻Bt基因

54TT51-1水稻TT51-1、NOS終止子、cry1Ab/Ac

7

55M12水稻M12、NOS終止子

56水稻水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

57科豐2號(hào)水稻科豐2號(hào)、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子

58J163苜蓿J163

利用表一中的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行混合，制作成含有0.1%的外源基

因的轉(zhuǎn)基因樣品，共計(jì)116個(gè)樣品（含重復(fù)）。利用本標(biāo)準(zhǔn)的方法，對(duì)獲得的116個(gè)轉(zhuǎn)基

因陽(yáng)性樣品進(jìn)行了檢測(cè)，其中有112個(gè)樣品被判定含有一種或多種轉(zhuǎn)基因成份，正確率為

96.56%。利用標(biāo)準(zhǔn)中的方法，我們繼續(xù)對(duì)100個(gè)已知的非轉(zhuǎn)基因植物品種的樣品進(jìn)行了測(cè)

試，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何轉(zhuǎn)基因成份，結(jié)論的正確率為100%。因此，本標(biāo)準(zhǔn)在95%以上的概率保

證下，可以檢出0.1%的轉(zhuǎn)基因成份。

當(dāng)轉(zhuǎn)基因成份含量為10%時(shí)，依舊按以上參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，平均可以檢出的外源基因的

模板片段的數(shù)量為2046個(gè)，那么，按二項(xiàng)分布，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，檢出的轉(zhuǎn)基因成份

的理論模板片段的數(shù)量為2006個(gè)到2148個(gè)，轉(zhuǎn)基因含量的理論變異不超過(guò)10%。事實(shí)上，

我們利用3個(gè)已知的100%的轉(zhuǎn)基因品種的粉未（含有Bt基因的水稻與玉米品種各1個(gè)，

含有Bar基因的水稻品種1個(gè)），與已知的非轉(zhuǎn)基因品種的樣品混合，制作了200個(gè)含

有10%的外源基因的轉(zhuǎn)基因樣品，利用本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)這200個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，獲得第個(gè)樣品

檢出的外源基因的含量，計(jì)算第個(gè)樣品呷檢出的外源基因的與參考值10%的偏差

i

。C結(jié)i果表明，在i200個(gè)樣品中，只有8個(gè)樣品的CiRSD的值超過(guò)了10%，

Ci?10%

R因S此Di，=確定10%了本×標(biāo)10準(zhǔn)0在%96%的概率保障下，定量檢測(cè)下限為10%。

（二）關(guān)于片段化的大小

對(duì)于高通量測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建來(lái)說(shuō)，文庫(kù)中DNA片段大小一般為300bp左右。對(duì)于植物

樣品來(lái)說(shuō)，提取的DNA一般來(lái)說(shuō)是比較完整的，因此，大于300bp是可以實(shí)現(xiàn)的。對(duì)于食

品樣品來(lái)說(shuō)，DNA可能在食品的加工過(guò)程中已經(jīng)降解，平均長(zhǎng)度不足300bp。因此，為了

滿足多種情況，本標(biāo)準(zhǔn)中，規(guī)定片段化大小為100bp至1000bp。

（三）關(guān)于實(shí)驗(yàn)操作

由于本標(biāo)準(zhǔn)中，多重?cái)U(kuò)增循環(huán)數(shù)在20個(gè)以下，處于線性增長(zhǎng)期，采用二代高通量測(cè)

序?qū)U(kuò)增的線性產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，可以在不同基因間進(jìn)行比較，獲得準(zhǔn)確的定量。實(shí)驗(yàn)室的

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氣溶膠污染樣本條形碼在分析中被排除。因此，本標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)于加上條形碼后的樣品，

防止氣溶膠污染的要求并不是十分嚴(yán)格，只要求實(shí)驗(yàn)分區(qū)、單向流動(dòng)、設(shè)備器具專用且保

持通風(fēng)，這些要求在普通實(shí)驗(yàn)室可以滿足，使得本標(biāo)準(zhǔn)可以在多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施。

本標(biāo)準(zhǔn)采用二代高通量測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)。與傳統(tǒng)的基于實(shí)時(shí)PCR或者電泳檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方

法比較，二代高通量測(cè)序的在定量檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍只取決于測(cè)序深度，并沒(méi)有檢測(cè)的下限

與上限的限制，因此，不需要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定定量檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍。

本標(biāo)準(zhǔn)中，不同樣本采用不同的樣本條形碼且樣本條形碼在30天內(nèi)不重復(fù)，在實(shí)驗(yàn)

室通風(fēng)良好的要求下，30天內(nèi)足夠進(jìn)行一輪實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外的氣體交換。因此，在實(shí)驗(yàn)室的氣

溶膠中，不存在相同的樣本條形碼，可以根據(jù)樣本條形碼，從測(cè)序數(shù)據(jù)中將氣溶膠的數(shù)據(jù)

排除在外，因此，不需要實(shí)驗(yàn)PCR反應(yīng)的空白對(duì)照。

本標(biāo)準(zhǔn)中，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因與外源基因在相同的反應(yīng)管中進(jìn)行反應(yīng)，因此，誤差小。根據(jù)

我們的200個(gè)轉(zhuǎn)基因含量為10%的轉(zhuǎn)基因樣品的檢測(cè)結(jié)果，在96%的概率保證下，定量誤

差不超過(guò)10%，因此，不需要設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)，以校正不同反應(yīng)管中的誤差。同樣由于同一