GB-T植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性測定 指示植物法征求意見稿編制說明

一、任務(wù)來源

本國家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會2017年第三批國家標(biāo)準(zhǔn)

制修訂計劃，項(xiàng)目編號“20171817-T-424”。本項(xiàng)任務(wù)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并

歸口，定于2019年完成。本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組由中國計量大學(xué)等單位共同組成。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定目的及意義

植物激素是植物細(xì)胞接受特定環(huán)境信號誘導(dǎo)產(chǎn)生的、低濃度時可調(diào)節(jié)植物生

理反應(yīng)的活性物質(zhì)，因其在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育時表現(xiàn)出微量、精準(zhǔn)的調(diào)控模式，

因此陸續(xù)被開發(fā)為植物生長調(diào)節(jié)劑，其使用濃度低，效果好，在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用十分

廣泛，統(tǒng)計表明我國農(nóng)產(chǎn)品收益的相當(dāng)比例來自于植物生長調(diào)節(jié)劑的正確合理使

用。因此植物激素的研究一直受到科研領(lǐng)域、工業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用收到密切關(guān)注。

植物激素種類繁多，國外針對植物激素活性研究繼而開發(fā)的植物生長調(diào)節(jié)劑

中有效成分多達(dá)100多種，且劑型豐富，而我國對植物激素類次生代謝產(chǎn)物研究

起步較晚，總體處于跟跑階段，且產(chǎn)品同質(zhì)化嚴(yán)重，有效成分物質(zhì)少，劑型單一、

研制進(jìn)度慢，田間復(fù)配藥劑出現(xiàn)藥害概率高等問題，缺乏核心競爭力。主要原因

是其活性測定和功效評價缺乏統(tǒng)一的試驗(yàn)方法和標(biāo)準(zhǔn)，以植物激素類次生代謝物

為主要活性成分的產(chǎn)品質(zhì)量控制缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和先進(jìn)的技術(shù)等。因此，本課題

擬在前期工作基礎(chǔ)上，研究建立植物激素類活性物質(zhì)的活性測定、功效評價技術(shù)

等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果將為以植物激素類次生代謝產(chǎn)物為主要活性成分的活性評

價、產(chǎn)品研發(fā)和質(zhì)量控制提供強(qiáng)大的技術(shù)保障，有效推動次生代謝物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

植物體內(nèi)產(chǎn)生的激素有五大類，即生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸和乙烯，

存在多種具有類似生物活性的化合物，活性不一，其中吲哚乙酸（IAA）為主要

的天然生長素，但是其極不穩(wěn)定，從而通過人工合成了萘乙酸（NAA）、4-氯-IAA、

5-羥-IAA等結(jié)構(gòu)功能類似物，主要作用于于細(xì)胞的生長，特別是細(xì)胞的伸長；

玉米素（ZT）是主要的天然細(xì)胞分裂素，主要作用于細(xì)胞分裂及分化，除玉米

素外，植物中至今已發(fā)現(xiàn)了十幾種具有類似生理活性的物質(zhì)，以此為基礎(chǔ)，人工

合成開發(fā)了6-糠基氨基嘌呤、6-芐基氨基嘌呤等結(jié)構(gòu)功能類似物；脫落酸（ABA）

是主要的植物天然生長調(diào)節(jié)劑，主要導(dǎo)致休眠和促進(jìn)脫落，天然活性脫落酸的提

取成本較高，而傳統(tǒng)的化學(xué)合成法生產(chǎn)的脫落酸不僅成本高，且生理活性與天然

的存在顯著差異，至今只有美國等發(fā)達(dá)國家應(yīng)用于大規(guī)模農(nóng)業(yè)生產(chǎn)；赤霉酸（GA3）

是活性最高的天然赤霉素，可以加速細(xì)胞伸長，促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)大，大部分通過赤霉

菌發(fā)酵液分離提取，至今已分離鑒定出近百種生理活性類似的物質(zhì)。由于同類激

素中存在多種結(jié)構(gòu)類似物，且結(jié)構(gòu)、生產(chǎn)方式或劑型等不同，其生理活性則會產(chǎn)

生差異，因此植物激素的生理活性很單純難以濃度、純度等進(jìn)行判定。而生理活

性差異則會直接導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，使用效果不一。因此，對產(chǎn)品的生理活

性進(jìn)行測定評價是控制產(chǎn)品質(zhì)量、保障使用效果的關(guān)鍵，也是促進(jìn)新產(chǎn)品開發(fā)的

基礎(chǔ)。鑒于此，建立統(tǒng)一的生物活性評價標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義，是植物生長調(diào)節(jié)激

素類產(chǎn)品質(zhì)量控制的保障，同時為新產(chǎn)品的開發(fā)鑒定提供標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)。

鑒于產(chǎn)品使用效果的重要性，相關(guān)科研人員也從植物生長調(diào)節(jié)劑在促進(jìn)或抑制植

物生根、發(fā)芽、生長、開花、結(jié)果等方面展開了大量研究，國家也從農(nóng)作物生長

發(fā)育為出發(fā)點(diǎn)規(guī)定了植物生長調(diào)節(jié)劑用于調(diào)節(jié)小麥、水稻、棉花、玉米、黃瓜、

番茄、葡萄、大豆生長以及在馬鈴薯抑芽調(diào)控，促進(jìn)蘋果著色、提高蘋果果形指

數(shù)、促進(jìn)果樹成花與坐果的田間藥效小區(qū)試驗(yàn)的方法和基本要求，作為登記用的

藥效評價標(biāo)準(zhǔn)。而其余標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)范了植物激素的測定方法，包括免疫法、薄層色

譜、液相色譜等，都只能定量測定激素含量，而激素有效成分復(fù)雜，各成分間結(jié)

構(gòu)不同活性差異大，因此有必要制定統(tǒng)一的植物激素活性測定評價標(biāo)準(zhǔn)，以規(guī)范

植物激素類產(chǎn)品的生產(chǎn)和使用，保障和促進(jìn)該領(lǐng)域的健康發(fā)展。但是目前國內(nèi)外

均沒有相關(guān)激素的活性檢測標(biāo)準(zhǔn)。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則和依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》

進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)編寫，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容參考了與植物激素活性檢測相關(guān)問下，標(biāo)準(zhǔn)參照了

GB/T6379.1-2004《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）》第1部分總則

與定義和GB/T6379.2-2004《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度》第2部分確定標(biāo)準(zhǔn)測量

方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法。

標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中采用文獻(xiàn)調(diào)查法、專家座談法、科學(xué)試驗(yàn)法等多種研究方

法，確保方法的科學(xué)先進(jìn)，過程周密嚴(yán)謹(jǐn)，保障數(shù)據(jù)真實(shí)可信、結(jié)果明確。

本標(biāo)準(zhǔn)是為相關(guān)組織對提取或合成的植物激素類次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行活性檢

測提供技術(shù)支撐，考慮到科研、生產(chǎn)、監(jiān)管等不同需求，在方法選擇上，主要基

于產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、現(xiàn)有成熟的技術(shù)以及試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證基礎(chǔ)確定的，因此實(shí)用性較強(qiáng)。

已知小麥胚芽鞘切段對生長素類活性物質(zhì)具有特異性反應(yīng)，細(xì)胞分裂素類物

質(zhì)特異性響應(yīng)尾穗莧中莧紅素的合成，赤霉素類活性物質(zhì)能特異性激發(fā)大麥種子

糊粉層中α-淀粉酶活性，因此早已開展了大量這些指示植物來評價各類激素活性

的研究，但是由于對材料、方法缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，且由于植物生長的特異性，批

次間沒有可比性，因此并沒有達(dá)成共識；研究發(fā)現(xiàn)同一類激素不同結(jié)構(gòu)的活性物

質(zhì)在同等質(zhì)量或濃度條件下各物質(zhì)的生物活性不同，因此激素活性不能由物質(zhì)質(zhì)

量或濃度來直接衡量，但是同批次實(shí)驗(yàn)中，指示植物對同一類激素不同結(jié)構(gòu)的活

性物質(zhì)濃度的響應(yīng)具有一致性。本研究以此為理論基礎(chǔ)，規(guī)范了指示植物材料的

獲取、測定方法要求等要素，同時以每類激素中活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的天然活性物

質(zhì)或類似物為標(biāo)準(zhǔn)物，引入當(dāng)量活性作為生物活性評價指標(biāo)，即以單位濃度的植

物激素類次生代謝產(chǎn)物與其相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物促進(jìn)或抑制植物生長、發(fā)育與休眠能

力的相對值來評價不同物質(zhì)的活性。

四、標(biāo)準(zhǔn)工作過程

4.1、組成標(biāo)準(zhǔn)起草小組

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂有關(guān)程序和要求，召開標(biāo)準(zhǔn)制定研討會，組成了標(biāo)準(zhǔn)起

草工作組，明確了任務(wù)要求，安排了工作進(jìn)度，成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組，會議

研究討論了標(biāo)準(zhǔn)初稿，對起草小組在標(biāo)準(zhǔn)起草過程中的一些思考及難點(diǎn)問題進(jìn)行

了深刻討論，各單位代表就標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容及方法選擇進(jìn)行了討論。

4.2、開展相關(guān)調(diào)研情況

該標(biāo)準(zhǔn)屬于生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)，是支撐科研開發(fā)以及生產(chǎn)方、第三方組織

開展產(chǎn)品評價的技術(shù)依據(jù)。起草工作小組首先針對科研、生產(chǎn)和檢測開展了大量

的調(diào)研工作。從滿足實(shí)際檢測需要出發(fā)，開展了國內(nèi)外相關(guān)資料的收集和確認(rèn)工

作，資料的檢索和信息的收集過程中，分析比較了大量的國內(nèi)外文獻(xiàn)方法。

4.3、標(biāo)準(zhǔn)起草完善過程

在廣泛調(diào)查研究的基礎(chǔ)上，標(biāo)準(zhǔn)起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對項(xiàng)目進(jìn)行了預(yù)

研，課題組成員廣泛收集了國內(nèi)外植物激素活性測定/評價的標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)，了解

了國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)動態(tài)，并且明確了工作思路和進(jìn)程安排，分析了通過前期的實(shí)

驗(yàn)摸索、反復(fù)論證，確定了本標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)定的重要參數(shù)，開展了實(shí)際樣品的檢測。

然后依據(jù)GB/T1.1—2000《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》、

GB/T1.2—2002《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第2部分：標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的確

定方法》等標(biāo)準(zhǔn)編制要求，對本標(biāo)準(zhǔn)開展了起草工作。于2018年6月中旬，起

草工作小組完成了《植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性測定指示植物法》國

家標(biāo)準(zhǔn)（草案）。2018年12月，在杭州組織有關(guān)單位和專家分別召開了標(biāo)準(zhǔn)草

案討論會，重點(diǎn)對各個激素活性評價的重要指標(biāo)選取提出了完善建議。同時對方

法進(jìn)行了驗(yàn)證，針對驗(yàn)證所出現(xiàn)的問題，在2019年2月22組織專家對標(biāo)準(zhǔn)逐字

逐句進(jìn)行了討論完善，形成了《植物激素類次生代謝產(chǎn)物的生物活性測定指示

植物法》國家標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。

五、主要技術(shù)內(nèi)容

5.1、生長素測定

5.1.1小麥胚芽鞘切段獲取過程和材料優(yōu)化

理論研究發(fā)現(xiàn)小麥胚芽鞘切段對生長素類活性物質(zhì)具有特異性反應(yīng)，且在一

定濃度范圍內(nèi)，小麥胚芽鞘切段伸長量與生長素活性成正比。因此選用小麥胚芽

鞘切段作為試驗(yàn)材料。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)濕度、溫度、萌發(fā)時間及內(nèi)源生長素均會影響胚芽鞘生長及

胚芽鞘切斷的生長，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此我們對比了22℃、25℃、28℃三個溫

度下小麥的萌發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)25℃萌發(fā)效果最好，且濕度越高，胚芽鞘伸長得越

多，而光照會促進(jìn)芽的生長從而為胚芽鞘的獲取帶來困難，為保障后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求，

我們需要足量胚芽鞘，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選用萌發(fā)率在90%以上的小麥種子萌發(fā)時，

然后放置在底層鋪有濕潤濾紙的托盤上排列整齊，覆膜加蓋后在無光照的生化培

養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天左右效果最好，可以獲得滿足單次試驗(yàn)用量的材料。

由于小麥胚芽鞘的伸長能力、整齊度等會干擾試驗(yàn)，不同小麥品種的胚芽鞘

長度、彎曲度、發(fā)芽生長3天左右的整齊度不同，我們首先參考文獻(xiàn)“72份冬小

麥品種（系）胚芽鞘長度的聚類分析”，篩選出長胚芽鞘的品種（長麥6135、藍(lán)

糯0801和中優(yōu)9944）以便增強(qiáng)處理效應(yīng)，對這三個品種按上述條件培養(yǎng)3天后

進(jìn)行胚芽鞘長度觀測，發(fā)現(xiàn)三者長度無顯著差異，但是長麥6135（2.73±0.38cm）

的整齊度好于藍(lán)糯0801（2.65±0.63cm）和中優(yōu)9944（2.79±0.58cm），因此我們

選擇長麥6135作為試驗(yàn)材料的來源。

為進(jìn)一步保障材料的統(tǒng)一性，減小材料個體差異帶來的誤差，我們選擇長度

近似的幼苗，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長度為25~30mm的幼苗株其胚芽鞘長度比較合適，過

長時胚芽鞘容易彎曲，過短則取胚芽鞘困難。依據(jù)文獻(xiàn)報道，胚芽鞘頂端含有大

量生長素類物質(zhì)，因此，需從基部取下芽鞘，切去3~5mm頂端，而胚芽鞘上半

部分對生長素比較敏感，越靠近頂端伸長能力越強(qiáng)，考慮到可操作性，我們推薦

切取接下來的約6mm的切段作為試驗(yàn)材料。

我們對比了光照條件下準(zhǔn)備材料、處理，以及切段的獲取需在綠光暗室中進(jìn)

行。為除去材料中可能含有的本底生長素，需將6mm切段放入盛有磷酸-檸檬

酸緩沖液的大培養(yǎng)皿中以除去切段中的內(nèi)源激素。為減少處理時間不同所帶來的

影響，鑒于1h左右可以基本去除內(nèi)源生長素，我們規(guī)定放進(jìn)搖床搖1.5h，每半

小時換一次溶液，一定的轉(zhuǎn)速可以使材料與緩沖液充分接觸，便于內(nèi)源生長素的

滲出，而太高的轉(zhuǎn)速會加大材料碰撞的概率，對材料有一定的傷害，經(jīng)觀察，80

r/min及以下的轉(zhuǎn)速不會造成材料的劇烈碰撞。

為確定光照以及材料中含有的內(nèi)源激素對試驗(yàn)的影響，我們切取60個胚芽

鞘，15個為一組，分別經(jīng)0.5h、1h、1.5h和2h的磷酸-檸檬酸緩沖液洗滌后加

入磷酸-檸檬酸緩沖液培養(yǎng)24h，按胚芽鞘長度測量方法測定胚芽鞘的實(shí)際伸長

長度ΔL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.5h（1689±123μm）和2h（1702±145μm）處理后的ΔL顯

著小于處理0.5h（2314±746μm）和1h（2164±437μm）的實(shí)驗(yàn)組，且兩者間數(shù)

值和穩(wěn)定性均無顯著差異，而光照條件下培養(yǎng)則個體間伸長長度的差異顯著增加

（1746±527μm）。一定的轉(zhuǎn)速可以使材料與緩沖液充分接觸，便于內(nèi)源生長素

的滲出，而太高的轉(zhuǎn)速會加大材料與容器碰撞的概率，對材料有一定的傷害，經(jīng)

觀察，小于80r/min的轉(zhuǎn)速即可，因此建議全程無光照，且將試驗(yàn)材料放入盛有

磷酸-檸檬酸緩沖液的大培養(yǎng)皿中，置于搖床中搖1.5h（≤80r/min），每半小時

換一次溶液，以除去內(nèi)源生長素。

5.1.2胚芽鞘長度測量過程及條件優(yōu)化

為減小實(shí)驗(yàn)材料的個體差異帶來的影響，我們選取單個胚芽鞘作為一個試驗(yàn)

單元，分別放置到冷凍盒的不同格子中，將該冷凍盒中的不同格子作為不同的試

驗(yàn)重復(fù)，分別在每格底部標(biāo)記（如1~16），由于生物材料差異大，我們試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

15個以上重復(fù)才能獲得滿足分析需要的足量分析數(shù)據(jù)（取重復(fù)測試結(jié)果絕對差

值不超過算術(shù)平均值的20%的至少5組數(shù)據(jù)），因此推薦使用16格的50mL離

心管的冷凍盒。

為了保障試驗(yàn)環(huán)境和措施對結(jié)果的影響，我們首先觀測發(fā)現(xiàn)充足的空氣有利

于胚芽鞘的伸長生長，我們推薦每個格子加入5mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液或試樣溶液

保障胚芽鞘能懸浮于處理溶液，同時留出足夠大的空間。再者因?yàn)榍卸伪容^短，

而且用器具固定會造成損傷，不適合用游標(biāo)卡尺等長度測量工具，因此我們推薦

使用體式顯微鏡下測量長度。此外，我們比較了10-5mg/mLNAA處理12h，24h，

36h，48h后胚芽鞘伸長量（ΔL）與對照處理的小麥胚芽鞘伸長量（ΔL0）的比

值（ΔLn/ΔL0），由圖1可知，24h前生長素誘導(dǎo)使胚芽鞘伸長比較顯著，因此

我們推薦使用最適生長溫度25℃的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h為宜。

圖110-5mg/mLNAA處理不同時間胚芽鞘伸長量ΔL與對照ΔL0的比值

5.1.3活性的計算方法及檢出限

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同一濃度梯度的NAA處理不同批次的胚芽鞘切段，其伸長量與對

照的比值（ΔLn/ΔL0）不一致（圖2A），因此無法單純以胚芽鞘切段的伸長量來

評價生長素的生理活性。且不同批次間，NAA在10-6~10-4mg/mL范圍內(nèi)，小麥

胚芽鞘切段伸長量（ΔL）與對照中小麥胚芽鞘伸長量（ΔL0）的比值（ΔLn/ΔL0）

與NAA濃度的對數(shù)值均存在顯著的線性關(guān)系（圖2B），而同一批次小麥胚芽鞘

切段用不同的生長素活性的激素處理后，濃度在10-6~10-4mg/mL范圍內(nèi)，麥胚

芽鞘切段伸長量（ΔL）與對照中小麥胚芽鞘伸長量（ΔL0）的比值（ΔLn/ΔL0）

均與濃度成正比，且斜率無顯著差異（圖2C），說明單批次試驗(yàn)中小麥胚芽鞘切

段對生長素活性物質(zhì)濃度的響應(yīng)具有一致性，而批次間胚芽鞘切段伸長量的差異

可能和環(huán)境有關(guān)，因此我們引入當(dāng)量的理念，用活性較高的生長素類標(biāo)準(zhǔn)物作為

參照，計算與試樣中有效成分對小麥胚芽鞘切段的伸長作用相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)物的量，

作為試樣中有效成分的生長素生物活性。

由圖1A所知，天然活性的生長素IAA和穩(wěn)定的IAA結(jié)構(gòu)類似物NAA的活

性無顯著差異（圖2A），但是IAA容易降解，不利于試驗(yàn)的穩(wěn)定性，因此本實(shí)

驗(yàn)采用NAA作為標(biāo)準(zhǔn)物來評價生長素類物質(zhì)的生物活性。

圖2不同濃度生長素處理后胚芽鞘伸長量ΔL與對照ΔL0的比值

5.1.4試樣的制備

由于檢測對象包含商品化的植物生長調(diào)節(jié)劑或生產(chǎn)研發(fā)過程中的未知物質(zhì)，

存在液體、固體等多種狀態(tài)，為了便于統(tǒng)一，我們將單位濃度（mg/mL）的有效

物質(zhì)或未知物質(zhì)的生物活性來計算生長素活性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NAA濃度在10-8~10-3

mg/mL范圍內(nèi)，小麥胚芽鞘切段伸長與NAA濃度成正比，小于該濃度范圍作用

不明顯，大于該濃度范圍則濃度越高反而不利（見圖2A），因此我們需要多個梯

度的試樣進(jìn)行觀測，以排除高濃度的干擾。同時多次試驗(yàn)驗(yàn)證，NAA濃度在

10-6~10-4mg/mL范圍內(nèi)，小麥胚芽鞘切段伸長量與NAA濃度存在顯著的線性關(guān)

系，因此建議試驗(yàn)樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，并至少取3個稀釋濃度以便觀察數(shù)

據(jù)變化趨勢，保證至少有一個試樣濃度在線性作用范圍內(nèi)。

5.2、細(xì)胞分裂素測定

5.2.1尾穗莧幼苗獲取過程和材料優(yōu)化

研究表明：細(xì)胞分裂素類物質(zhì)特異性響應(yīng)尾穗莧中莧紅素的合成。尾穗莧幼

苗在光下能合成一種紅色色素（莧紅素），在暗中發(fā)芽的尾穗莧子葉不能合成莧

紅素，子葉呈白色。若供給細(xì)胞分裂素和酪氨酸，暗中萌發(fā)的尾穗莧子葉也能合

成莧紅素，且在一定濃度范圍的細(xì)胞分裂素中，莧紅素的合成量與細(xì)胞分裂素活

性成線性關(guān)系。因此選用尾穗莧子葉作為試驗(yàn)材料。

尾穗莧顏色有紅色、紫色、黃色、白色等，其中顏色的變化主要關(guān)系其莧紅

素合成能力，顏色越紅莧紅素含量越高，因此推薦使用紅色品系的尾穗莧的種子。

進(jìn)一步我們對實(shí)驗(yàn)環(huán)境及操作條件進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程中濕度、溫度

及萌發(fā)時間均會影響種子萌發(fā)及子葉中莧紅素的形成，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。首先我們

試驗(yàn)了22℃、25℃、28℃三個溫度下種子的萌發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)25℃種子萌發(fā)率比

22℃和28℃至少高5%，因此選擇25℃條件每天觀察種子萌發(fā)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)3

天的子葉可滿足試驗(yàn)要求，時間過短則子葉偏小或展開不充分，為縮短試驗(yàn)進(jìn)程，

我們推薦25℃萌發(fā)3天左右的黃化苗進(jìn)行試驗(yàn)。其次非同一環(huán)境萌發(fā)的幼苗對

后期結(jié)果的重復(fù)性影響較大，因此我們規(guī)定一個生物學(xué)重復(fù)的樣品需來源于同一

個培養(yǎng)環(huán)境，單次試驗(yàn)最少需300顆黃化苗，考慮到萌發(fā)率及其它因素的影響，

約需400顆種子（大約2g）。最后我們發(fā)現(xiàn)吸脹處理過久或萌發(fā)時濕度過大會產(chǎn)

生偏紅的子葉（非黃化苗），因此我們?yōu)榱撕Y選合適的萌發(fā)濕度環(huán)境，將種子統(tǒng)

一在鋪有兩層定性濾紙的18cm大培養(yǎng)皿中，再往里面加入適量的水，在萌發(fā)3

天時比較不同的水量及不同吸脹時間對種子萌發(fā)率、苗生長整齊度及非黃化苗產(chǎn)

生率的影響（表1）。結(jié)果顯示：當(dāng)選用萌發(fā)率在90%以上的尾穗莧種子萌發(fā)時，

2g左右的尾穗莧種子在吸脹5h后散鋪放于兩層消毒濾紙的18cm大培養(yǎng)皿中，

加入9mL蒸餾水，25℃黑暗培養(yǎng)72h發(fā)芽效果最好，可以獲得足量符合實(shí)驗(yàn)要

求的黃化苗。最后從中選取子葉大小均一的黃化幼苗作為試驗(yàn)材料，減少試驗(yàn)材

料的誤差。

表1吸脹時間和發(fā)芽培養(yǎng)加水量對尾穗莧種子萌發(fā)狀態(tài)的影響

種子萌發(fā)率生長整齊度非黃化苗產(chǎn)生率

吸脹時間387%±4%一般1%以下

（h）595%±2%好1%以下

培養(yǎng)皿中水量為9mL796%±3%好20%以上

培養(yǎng)皿中加水量775%±7%差1%以下

（mL）995%±2%好1%以下

吸脹5h時1197%±1%好10%以上

5.2.2莧紅素濃度測量過程及條件優(yōu)化

由于尾穗莧子葉小，單個子葉產(chǎn)生的莧紅素在后續(xù)提取測量中存在困難，因

此考慮將多個個體的子葉混合進(jìn)行莧紅素的提取，以此來減少試驗(yàn)過程誤差及實(shí)

驗(yàn)材料的個體差異帶來的誤差。由于后續(xù)處理過程中可能會出現(xiàn)少量生長缺陷或

子葉對細(xì)胞分裂素反應(yīng)不靈敏等情況的個體，因此我們推薦選取30株黃化苗進(jìn)

行處理，最終選取大小和顏色相對均一的40個子葉進(jìn)行莧紅素的測定。

同樣，為減少濕度引起的本身子葉發(fā)紅的影響，我們推薦使用兩層濾紙的6

cm培養(yǎng)皿加入1mL的處理溶液，使濾紙的濕潤度與前面篩選用于發(fā)芽的濕潤度

一致。經(jīng)25℃處理我們發(fā)現(xiàn)，24~48h是莧紅素合成的快速增長期，48h后莧紅

素含量增加不明顯，而由于生長空間的局限性，子葉生長狀態(tài)會變差，因此我們

推薦處理48h后進(jìn)行莧紅素合成量的檢測。

我們試驗(yàn)了凍融法、超聲破碎法和震蕩破碎法提取莧紅素的效果，10-4mg/mL

ZT處理后，選取大小、顏色均一的子葉360個，隨機(jī)分成9組，每組40個子葉，

分別采用凍融法、超聲破碎法和震蕩破碎法提取莧紅素，結(jié)果凍融法提取的三次

值（OD534–OD650）分別為0.205、0.279、0.166，超聲破碎法提取的三次值

（OD534–OD650）分別為0.312、0.286、0.257，震蕩破碎法提取的三次值

（OD534–OD650）分別為0.279、0.265、0.287，結(jié)果表明震蕩破碎法（0.277±0.011）

和超聲破碎法（0.285±0.028）提取量較凍融法（0.217±0.057）高，兩者沒有顯著

差異，但是超聲破碎法提取的標(biāo)準(zhǔn)誤大于震蕩破碎法，因此鑒于方法的穩(wěn)定性，

我們推薦使用震蕩破碎法。對震蕩破碎條件進(jìn)行摸索，我們發(fā)現(xiàn)加入適量（10~20

顆）小直徑的研磨珠可以促進(jìn)細(xì)胞破碎；震蕩時間過短或震蕩頻率過低會導(dǎo)致樣

品破碎不充分而震蕩時間過長或震蕩頻率過高會導(dǎo)致樣品過熱，破壞莧紅素，我

們選擇了30Hz、40Hz、50Hz、60Hz四個震蕩頻率以及破碎5min、10min、

15min三個時間，發(fā)現(xiàn)同樣的頻率下5min即可滿足要求，而50Hz、60Hz破

碎后莧紅素的含量高且無顯著差異，即50Hz，5min可用于破碎細(xì)胞提取莧紅

素（表2）。根據(jù)文獻(xiàn)報道，我們用紫外分光光度計在波長為534nm和650nm

處分別讀取光密度值OD534和OD650，記錄相減的差數(shù)，即莧紅素濃度的光密度

值D（OD534–OD650）。

表2不同的震蕩頻率和時間對尾穗莧提取的影響

時間

頻率（min）51015

（Hz）

300.169±0.024c0.172±0.021c0.171±0.023c

400.196±0.018b0.201±0.015b0.197±0.014b

500.278±0.012a0.279±0.011a0.283±0.017a

600.283±0.009a0.286±0.015a0.276±0.016a

5.2.3活性的計算方法

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同一濃度梯度的ZT處理不同批次的尾穗莧幼苗，莧紅素合成量不

一致（圖3A），因此無法單純以莧紅素合成量來評價細(xì)胞分裂素的生理活性。且

不同批次間，ZT濃度在10-5~10-3mg/mL范圍內(nèi)，處理的光密度值（D）與ZT濃

度的對數(shù)值均存在顯著的線性關(guān)系（圖3B），而同一批次尾穗莧幼苗用不同細(xì)胞

分裂素活性的激素處理后，濃度在10-5~10-3mg/mL范圍內(nèi)，處理的光密度值（D）

與激素濃度的對數(shù)值均存在顯著的線性關(guān)系，且斜率無顯著差異（圖3C），說明

單批次試驗(yàn)中莧紅素的合成對生長素活性物質(zhì)濃度的響應(yīng)具有一致性，而批次間

的差異可能和環(huán)境有關(guān)，因此我們引入當(dāng)量的理念，用活性較高的細(xì)胞分裂素類

標(biāo)準(zhǔn)物作為參照，計算與試樣中有效成分對莧紅素的合成作用相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)物的量，

作為試樣中有效成分的細(xì)胞分裂素生物活性。

圖3不同濃度細(xì)胞分裂素處理后莧紅素的合成量

試驗(yàn)中，我們選擇了天然細(xì)胞分裂素（ZT）、人工合成的激動素（KT）、6-

芐基氨基嘌呤（6-BA）進(jìn)行測試比較，發(fā)現(xiàn)尾穗莧子葉中莧紅素的合成對ZT更

為敏感（圖3C），因此本實(shí)驗(yàn)采用ZT作為標(biāo)準(zhǔn)物來評價細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的生

物活性。

5.2.4試樣的制備

由于檢測對象包含商品化的植物生長調(diào)節(jié)劑或生產(chǎn)研發(fā)過程中的未知物質(zhì)，

存在液體、固體等多種狀態(tài)，為了便于統(tǒng)一，我們將單位濃度的有效物質(zhì)或未知

物質(zhì)的生物活性來計算細(xì)胞分裂素活性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZT濃度在10-5~10-2mg/mL范

圍內(nèi)，莧紅素的合成量與ZT濃度成正比，小于該濃度范圍作用不明顯，大于該

濃度范圍則濃度越高反而不利（見圖3A），因此我們需要多個梯度的試樣進(jìn)行觀

測，以排除高濃度的干擾。多次試驗(yàn)驗(yàn)證，ZT濃度在10-5~10-3mg/mL范圍內(nèi)，

莧紅素的合成量與ZT濃度存在顯著的線性關(guān)系，因此建議試驗(yàn)樣品進(jìn)行10倍

梯度稀釋，并至少取3個稀釋濃度以便觀察數(shù)據(jù)變化趨勢，保證至少有一個試樣

濃度在線性作用范圍內(nèi)。

5.3、赤霉素類物質(zhì)生物活性的室內(nèi)測定

5.3.1無胚大麥半粒種子獲取過程和材料優(yōu)化

赤霉素類活性物質(zhì)能特異性激發(fā)大麥種子糊粉層中α-淀粉酶活性，α-淀粉酶

釋放不受植物天然提取物中其它非赤霉素類物質(zhì)和溶劑中雜質(zhì)的影響。大麥種子

在吸水后從胚中產(chǎn)生赤霉素，去胚的大麥種子不能產(chǎn)生赤霉素，因此選用無胚的

大麥半粒種子來作為試驗(yàn)材料。

由于不同小麥品種α-淀粉酶的活性不同，我們參考文獻(xiàn)“中國大麥地方品種

的α-淀粉酶酶活性研究”，選擇α-淀粉酶活性較高的品種二棱大麥，以便增強(qiáng)處

理效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)吸脹時間會影響α-淀粉酶活性，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此我們對

比了大麥半胚在吸脹0h、24h、48h、72h后，經(jīng)10-4mg/mL的GA3誘導(dǎo)后，

按活性測定步驟測定指示α-淀粉酶活性的OD580值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸脹48h

（1.891±0.158）和72h（1.803±0.215）處理后的OD580顯著高于不吸脹0h

（0.564±0.415）和吸脹24h（1.359±0.314）的實(shí)驗(yàn)組，且吸脹48h的結(jié)果更為

穩(wěn)定，因此推薦吸脹處理48h。

為確定洗滌時間以減少材料中含有的內(nèi)源激素對α-淀粉酶活性的激活作用，

我們切取120個大麥無胚半粒種子，10個為一組，分別經(jīng)0.5h、1h、1.5h和2

h的洗滌后加入乙酸緩沖液震蕩培養(yǎng)24h，按活性測定步驟測定指示α-淀粉酶活

性的OD580值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.5h（1.891±0.158）和2h（1.903±0.145）處理后的

OD580顯著小于處理0.5h（1.24±0.108）和1h（1.591±0.213）的實(shí)驗(yàn)組，且兩者

間數(shù)值和穩(wěn)定性均無顯著差異，而一定的轉(zhuǎn)速可以使材料與緩沖液充分接觸，便

于內(nèi)源激素的滲出，而太高的轉(zhuǎn)速會加大材料碰撞的概率，對材料有一定的傷害，

經(jīng)觀察，大于50r/min可以使離心管中的種子有一定的擺幅，而小于100r/min

的轉(zhuǎn)速不會引起種子間劇烈碰撞，因此建議將吸脹48h后的半粒種子放進(jìn)50mL

離心管中，以50~100r/min揺1.5h，每0.5h換一次水。

5.3.2α-淀粉酶活性測量測量過程及條件優(yōu)化

為減小實(shí)驗(yàn)材料的個體差異帶來的影響，我們選取10個大麥無胚半粒種子

作為一個試驗(yàn)單元。依據(jù)文獻(xiàn)，采用碘能使淀粉變藍(lán)的原理，我們用淀粉作為底

物，用I2-KI溶液檢測處理后淀粉的剩余量，來指示α-淀粉酶活性：活性越高，

淀粉越少，則溶液呈現(xiàn)的藍(lán)色越淺，在通過紫外分光光度計在波長為580nm處

檢測得到的光密度值則越小。為了便于操作和標(biāo)準(zhǔn)化，我們對該檢測體系中的量

值進(jìn)行了規(guī)定：從處理后的離心管中吸取上清液0.4mL至新的10mL離心管中，

加入1.6mL0.1%淀粉溶液，混勻，30℃水浴10min進(jìn)行淀粉水解反應(yīng)。再加入

I2-KI溶液2mL，蒸餾水定容至5mL，充分搖勻（溶液呈藍(lán)色），采用紫外分光

光度計讀取每管中溶液的OD580值。

5.3.3活性的計算方法及檢出限

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同一濃度GA3處理不同批次的大麥無胚乳半粒種子，α-淀粉酶活性

不一致（圖4A），因此無法單純以α-淀粉酶活性來評價赤霉素的生理活性。且不

-5.5-3

同批次間，GA3濃度在10~10mg/mL范圍內(nèi)，處理的光密度OD580值與GA3

濃度的對數(shù)值均存在顯著的線性關(guān)系（圖4B），而同一批次大麥無胚乳半粒種子

用不同赤霉素活性的激素處理后，濃度在10-5~10-3mg/mL范圍內(nèi)，處理的光密度

OD580值與激素濃度的對數(shù)值均存在顯著的線性關(guān)系，且斜率無顯著差異（圖4C），

說明單批次試驗(yàn)中α-淀粉酶活性對赤霉素類活性物質(zhì)濃度的響應(yīng)具有一致性，而

批次間α-淀粉酶活性的差異可能和環(huán)境有關(guān)，因此我們引入當(dāng)量的理念，用赤霉

素類標(biāo)準(zhǔn)物作為參照，計算與試樣中有效成分對α-淀粉酶活性作用相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)物

的量，作為試樣中有效成分的赤霉素生物活性。

圖4不同濃度赤霉素處理后α-淀粉酶活性

試驗(yàn)中，我們選擇了赤霉酸GA3，GA2，GA1來進(jìn)行測試比較，發(fā)現(xiàn)α-淀粉

酶活性對GA3更為敏感（圖4C），因此本實(shí)驗(yàn)采用GA3作為標(biāo)準(zhǔn)物來評價生長

素類物質(zhì)的生物活性。

5.3.4試樣的制備

由于檢測對象包含商品化的植物生長調(diào)節(jié)劑或生產(chǎn)研發(fā)過程中的未知物

質(zhì)，存在液體、固體等多種狀態(tài)，為了便于統(tǒng)一，我們將單位濃度（mg/mL）的

有效物質(zhì)或未知物質(zhì)的生物活性來計算赤霉素活性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GA3濃度在

-6-3

10~10mg/mL范圍內(nèi)，α-淀粉酶活性與GA3濃度成正比，小于該濃度范圍作用

不明顯，大于該濃度范圍則濃度越高反而不利（見圖4A），因此我們需要多個梯

度的試樣進(jìn)行觀測，以排除高濃度的干擾。同時多次試驗(yàn)驗(yàn)證，GA3濃度在

-5.5-3

10~10mg/mL范圍內(nèi)，α-淀粉酶活性與GA3濃度存在顯著的線性關(guān)系，因此

建議試驗(yàn)樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，并至少取3個稀釋濃度以便觀察數(shù)據(jù)變化趨

勢，保證至少有一個試樣濃度在線性作用范圍內(nèi)。

六、驗(yàn)證情況及結(jié)果分析

三種激素活性測定的標(biāo)準(zhǔn)物線性濃度范圍見下表3

表3測定方法中所用標(biāo)準(zhǔn)物的線性濃度范圍

序號激素可檢測范圍

1生長素10-6~10-4mg/mL

2細(xì)胞分裂素10-5~10-3mg/mL

3