錳過(guò)氧化物酶（ManganeseperoxidaseMnp）試劑盒說(shuō)明書(shū)

第第頁(yè)錳過(guò)氧化物酶（Manganeseperoxidase，Mnp）試劑盒說(shuō)明書(shū)錳過(guò)氧化物酶（Manganeseperoxidase，Mnp）試劑盒說(shuō)明書(shū)微量法100T/96S注意：正式測(cè)定之前選擇23個(gè)預(yù)期差別大的樣本做猜測(cè)定。測(cè)定意義：錳過(guò)氧化物酶（EC1.11.1.13）是一種含亞鐵血紅素的過(guò)氧化物酶，重要存在于擔(dān)子菌中，屬于木質(zhì)素降解酶系，能有效的降解木質(zhì)素及廢水和土壤中比較難降解的氯化物，疊氮化合物、DTT，多環(huán)芳烴等。測(cè)定原理：錳過(guò)氧化物酶在Mn2+存在的條件下，將愈創(chuàng)木酚氧化為四鄰甲氧基連酚，在465nm有特征汲取峰。自備試驗(yàn)用品及儀器：天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。試劑構(gòu)成和配制：試劑一：液體110mL×1瓶，4℃保管。試劑二：液體2mL×1支，4℃保管。試劑三：液體5mL×1瓶，4℃避光保管。試劑四：液體2mL×1支，4℃保管。酶液提?。?.組織：依照質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。2.細(xì)胞：依照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波碎裂細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。3.培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。測(cè)定操作：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)整波長(zhǎng)至465nm，蒸餾水調(diào)零。2、測(cè)定前將試劑一、二、三、四在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）放置10min以上。3、樣本測(cè)定表試劑名稱（L）測(cè)定管樣本20試劑一100試劑二20試劑三40試劑四20在微量石英比色皿或96孔板中按次序加入上述試劑，立刻混勻并計(jì)時(shí)，記錄465nm下30s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和2min30s后的吸光值A(chǔ)2.計(jì)算ΔA＝A2A1.注意：若一次性測(cè)定樣本較多，可將試劑一、二、三、四按比例配成混合液，在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）放置10min以上，測(cè)定時(shí)加入20L樣本和180L混合液測(cè)定。酶活計(jì)算公式：a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下1．依照蛋白濃度計(jì)算酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。MnP活性（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=413×ΔA÷Cpr2．依照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。MnP活性（nmol/min/g鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×W÷V樣總）÷T=413×ΔA÷W3．依照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。MnP活性（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T=413×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量4．依照液體體積計(jì)算酶活性定義：每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。MnP活性（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=413×ΔAε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，2×104L；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2minb.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下1．依照蛋白濃度計(jì)算酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。MnP活性（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=826×ΔA÷Cpr2．依照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活性定義：每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。MnP活性（nmol/min/g鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×W÷V樣總）÷T=826×ΔA÷W3．依照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活性定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。MnP活性（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T=826×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量4．依照液體體積計(jì)算酶活性定義：每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。MnP活性（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=826×ΔAε：愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù)：12100L/mol