實(shí)驗(yàn)分離以尿素為氮源的微生物

關(guān)于實(shí)驗(yàn)分離以尿素為氮源的微生物課題背景：尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。但是尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當(dāng)土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨氣以后，才能被植物利用。而土壤中的細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?。?頁,共30頁，2024年2月25日，星期天什么是尿素和脲酶？（NH2）2C=O+H2O脲酶2NH3+CO2尿素：又稱脲，是蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物。脲酶：降解尿素的酶。第3頁,共30頁，2024年2月25日，星期天如何篩選分解尿素的細(xì)菌？原理：培養(yǎng)基中的唯一氮源是尿素，只有能分解尿素的細(xì)菌（能合成脲酶）能夠在該培養(yǎng)基上正常生長和繁殖。碳源氮源第4頁,共30頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)原理利用將尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基分離出能利用尿素的細(xì)菌，再通過稀釋涂布分離法，將該菌分散開來，以形成單菌落。細(xì)菌合成的脲酶能將尿素分解成NH3，致使pH升高，堿性增強(qiáng)，使酚紅指示劑變紅。酸堿指示劑：酸黃堿紅第5頁,共30頁，2024年2月25日，星期天例題：下列能選擇出分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基是（）A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、瓊脂、水B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、瓊脂、水

C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、瓊脂、水D.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、水選擇培養(yǎng)基：只能以尿素為唯一氮源。第6頁,共30頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)設(shè)備及用品三角瓶、試管和試管架、培養(yǎng)皿、超凈臺(tái)、移液器、玻璃刮刀、酒精燈。第7頁,共30頁，2024年2月25日，星期天從土壤中采集微生物土壤采樣方法：用小鏟子去除5cm表土，取離地面5-15cm處的土樣1克，盛于預(yù)先滅菌的牛皮紙袋中扎緊。從有哺乳動(dòng)物排泄物的地方取得第8頁,共30頁，2024年2月25日，星期天稀釋涂布分離法玻璃刮刀第9頁,共30頁，2024年2月25日，星期天Step1：培養(yǎng)基的配制和滅菌全營養(yǎng)LB培養(yǎng)基/25mL尿素培養(yǎng)基/25mL蛋白胨0.25g酵母提取物0.12gNaCl0.25g瓊脂糖0.5g水25mL葡萄糖0.025gNaCl0.12gK2HPO40.12g酚紅0.25g瓊脂糖0.5g水15mL尿素溶液10mL特別注意：尿素溶液用G6玻璃漏斗過濾，使之無菌。第10頁,共30頁，2024年2月25日，星期天Step2：倒平板②將已滅菌的LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基在酒精燈火焰旁分別倒入培養(yǎng)皿中，在超凈臺(tái)上搖勻，平放至凝固。冷卻至60℃第11頁,共30頁，2024年2月25日，星期天Step3：制備細(xì)菌懸液1g土樣99mL無菌水10-2稀釋液10-3、10-4、10-5稀釋液第12頁,共30頁，2024年2月25日，星期天怎樣梯度稀釋菌液？高濃度→低濃度，換槍頭微量移液器第13頁,共30頁，2024年2月25日，星期天平行重復(fù)第14頁,共30頁，2024年2月25日，星期天每一個(gè)稀釋度的菌液：接種到3個(gè)培養(yǎng)皿中。第15頁,共30頁，2024年2月25日，星期天Step4：用涂布分離法分離細(xì)菌全營養(yǎng)LB培養(yǎng)基（對(duì)照組）尿素培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）10-310-410-5需要倒3個(gè)LB平板，9個(gè)尿素平板重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3第16頁,共30頁，2024年2月25日，星期天取10-3、10-4和10-5的土壤稀釋液各0.1mL，分別加到有LB培養(yǎng)基和尿素培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。第17頁,共30頁，2024年2月25日，星期天在酒精燈火焰旁打開培養(yǎng)皿，用玻璃刮刀將菌液涂布到整個(gè)平板上。70%酒精第18頁,共30頁，2024年2月25日，星期天恒溫培養(yǎng)箱Step5：恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)培養(yǎng)皿要倒置將培養(yǎng)皿倒置，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。第19頁,共30頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)結(jié)果：全營養(yǎng)培養(yǎng)基中有較多的菌落，而尿素培養(yǎng)基中只有少量的菌落。Step6：觀察培養(yǎng)基中的菌落數(shù)第20頁,共30頁，2024年2月25日，星期天Step7：統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：①選擇菌落數(shù)在30～300的平板計(jì)數(shù)。②每個(gè)稀釋度取3個(gè)平板取其菌落的平均值。③統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。第21頁,共30頁，2024年2月25日，星期天例題：用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中．得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確的是（）

A.涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是230B.涂布了兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C.涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163D.涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是2l0、240和250，取平均值233第22頁,共30頁，2024年2月25日，星期天例題：稀釋涂布平板法分離純化土壤中微生物的正確操作步驟是（）①土壤取樣②稱取10g土壤加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，制備土壤提取液③吸取0.1mL溶液進(jìn)行平板涂布④依次稀釋至101、102、103、104、105、106、107的稀釋度A．①②③④B．①③②④C．①②④③D．①④②③第23頁,共30頁，2024年2月25日，星期天思考與練習(xí)（1）為什么要用瓊脂糖代替瓊脂配制固體培養(yǎng)基？（2）有脲酶的細(xì)菌在生態(tài)穩(wěn)態(tài)上起什么作用？（3）有脲酶的細(xì)菌菌落周圍為什么有著色的環(huán)帶出現(xiàn)？（4）與全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較，為什么尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落？瓊脂是未被純化的混合物，內(nèi)含一定量的含氮化合物。能將尿素轉(zhuǎn)化為氨，供植物利用，而對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中N元素的循環(huán)有重要作用。細(xì)菌合成的脲酶能將尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚紅指示劑變紅。能利用尿素的細(xì)菌在土壤菌群中只占極少數(shù)量。第24頁,共30頁，2024年2月25日，星期天例題：（2012·浙江高考）幽門螺桿菌（Hp）感染是急慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素。在患者體內(nèi)采集樣本并制成菌液后，進(jìn)行分離培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)基本步驟如下：請(qǐng)回答：（1）在配制培養(yǎng)基時(shí)，要加入尿素和酚紅指示劑，這是因?yàn)镠p含有

，它能以尿素作為氮源；若有Hp，則菌落周圍會(huì)出現(xiàn)

色環(huán)帶。（2）下列對(duì)尿素溶液進(jìn)行滅菌的最適方法是

滅菌。A.高壓蒸汽B.紫外燈照射C.70%酒精浸泡D.過濾脲酶紅第25頁,共30頁，2024年2月25日，星期天（3）步驟X表示

。在無菌條件下操作時(shí)，先將菌液稀釋，然后將菌液

到培養(yǎng)基平面上。菌液稀釋的目的是獲得

菌落。（4）在培養(yǎng)時(shí)，需將培養(yǎng)皿倒置并放在

中。若不倒置培養(yǎng)，將導(dǎo)致

。（5）臨床上用14C呼氣實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人體是否感染Hp，其基本原理是Hp能將14C標(biāo)記的

分解為NH3和14CO2。接種涂布單（個(gè)）恒溫培養(yǎng)箱無法形成單菌落尿素第26頁,共30頁，2024年2月25日，星期天倒平板平板劃線分離練一練，識(shí)一識(shí)稀釋涂布分離接種環(huán)玻璃刮刀第27頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共30頁，2024年2月25日，星期天例題：（2011·新課標(biāo)全國卷）有些細(xì)菌可分解原油，從而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同學(xué)欲從污染的土壤中篩選出能高效降解原油的菌株?；卮饐栴}：（1）在篩選過程中，應(yīng)將土壤樣品稀釋液接種于以

為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，從功能上講，該培養(yǎng)基屬于

培養(yǎng)基。（2）純化菌種時(shí)，為了得到單菌落，常采用的接種方法有兩種，即

和

。（3）為了篩選出高效菌株，可比較單菌落周圍分解圈的大小，分解圈大說明該菌株的降解能力

。（4）通常情況下，在微生物培養(yǎng)過程中，