【生物】重組DNA技術(shù)的基本工具課件-2023-2024學(xué)年高二下人教版選擇性必修三

1980年世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問(wèn)世超級(jí)小鼠：轉(zhuǎn)入大鼠的生長(zhǎng)激素基因，使小鼠體重為正常個(gè)體的二倍。中國(guó)抗蟲(chóng)棉之父郭三堆普通棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉棉鈴蟲(chóng)抗蟲(chóng)棉花核心技術(shù)于1995年申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利，1998年正式授權(quán)，2001年該專(zhuān)利被國(guó)際知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織及國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局授予發(fā)明專(zhuān)利金獎(jiǎng)。它標(biāo)志著我國(guó)成為繼美國(guó)之后，世界上獨(dú)立自主研制成功抗蟲(chóng)棉的第二個(gè)國(guó)家。

按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品?；蚬こ滩僮魉剑篋NA分子水平轉(zhuǎn)基因技術(shù)、DNA重組技術(shù)、基因拼接技術(shù)

原理：基因重組克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙、定向改造生物性狀普通棉花蘇云金芽孢桿菌Bt抗蟲(chóng)蛋白基因普通棉花細(xì)胞DNA含Bt抗蟲(chóng)蛋白基因棉花抗蟲(chóng)棉基因工程的可行性所有細(xì)胞生物遺傳物質(zhì)都是DNA，且DNA分子在結(jié)構(gòu)上具有統(tǒng)一性，保證了目的基因可插入受體細(xì)胞的DNA中所有的生物共用同一套密碼子，保證目的基因能在受體細(xì)胞中表達(dá)出相同蛋白

優(yōu)點(diǎn)：基因工程轉(zhuǎn)基因技術(shù)、DNA重組技術(shù)、基因拼接技術(shù)“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車(chē)”切割DNA分子連接DNA片段將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞選擇性必修三第3章第1節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本工具CT制作自學(xué)時(shí)間P71Thequestion：Q3：“分子手術(shù)刀”的作用位點(diǎn)？Q2：“分子手術(shù)刀”的來(lái)源？Q1：“分子手術(shù)刀”是什么？Q4：“分子手術(shù)刀”的類(lèi)型有哪些？一“分子手術(shù)刀”限制性?xún)?nèi)切核酸酶限制酶2.作用位點(diǎn)：切斷特定部位的磷酸二酯鍵1.主要來(lái)源：原核生物目前分離出數(shù)千種磷酸二酯鍵2.作用位點(diǎn)：切斷特定部位的磷酸二酯鍵識(shí)別序列

長(zhǎng)度一般為4-8個(gè)或其他數(shù)量的脫氧核苷酸，最常見(jiàn)的為6個(gè)核苷酸。3.種類(lèi)EcoRⅠ限制酶G

AA

TT

CC

TT

AA

GSmaⅠ限制酶E口Rone斯馬oneC

CC

GG

GGGG

CC

C回文序列：正反讀一樣限制酶的命名

EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個(gè)字母R型菌株從中分離的第一個(gè)限制酶流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindIHindIIHindIII

粘質(zhì)沙雷氏桿菌(Serratiamarcesens)中分離的第一種限制酶為Sma

ⅠEcoRⅠ限制酶G

AA

TT

CC

TT

AA

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間磷酸二酯鍵切開(kāi)粘性末端：-G-CTTAAAATTGCCTTAAG磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵切斷幾個(gè)磷酸二酯鍵?SmaⅠ限制酶識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間磷酸二酯鍵切開(kāi)平末端：-CCC-GGG磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵C

CC

GG

GGGG

CC

CGGGC

CCCC

C

GGG

要想獲得某個(gè)目的基因需要幾個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，要用限制酶必須切斷幾個(gè)磷酸二酯鍵？產(chǎn)生幾個(gè)粘性末端？GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGAATTCGGCTTAA目的基因目的基因目的基因兩側(cè)各具備一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGAATTCGGCTTAA目的基因目的基因CCCGGGGAATTCGGGCCCCTTAAGGGGGCCCCTTAA目的基因目的基因目的基因兩側(cè)各具備一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，但每種酶的切點(diǎn)最好只有一個(gè)，否則獲得的目的基因會(huì)出現(xiàn)自我環(huán)化。提示：如圖寫(xiě)出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。下圖甲是一個(gè)DNA片段，箭頭處代表不同限制酶的切點(diǎn)，據(jù)圖回答：（1）用EcoRⅠ酶切，能得到

種DNA片段；（2）用PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；（3）同時(shí)用SmaⅠ和PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；（4）只用PstⅠ酶切，最多能得到

種DNA片段。2355

要想獲得某個(gè)目的基因選擇怎樣的限制酶？最終會(huì)形成多少個(gè)DNA片段？

現(xiàn)有一長(zhǎng)度為1000堿基對(duì)(bp）的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，用Kpn1單獨(dú)酶切得到400bp和600bp兩種長(zhǎng)度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同時(shí)酶切后得到200bp和600bp兩種長(zhǎng)度的DNA分子。該DNA分子的酶切圖譜正確的是

請(qǐng)判斷：以下黏性末端是由

種限制酶作用產(chǎn)生的。3①②③結(jié)論：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端細(xì)菌等原核生物容易受到自然界外源DNA（如噬菌體）的入侵。所以它在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了套完善的防御機(jī)制。這類(lèi)原核生物之所以長(zhǎng)期進(jìn)化而不滅絕，限制酶就是它的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它會(huì)利用限制酶來(lái)切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。思考：根據(jù)所掌握的知識(shí)，推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？思考：為什么限制酶不切割細(xì)菌本身的DNA分子？細(xì)菌自身的DNA沒(méi)有限制酶識(shí)別的特定序列或者識(shí)別序列被修飾（甲基化），所以不會(huì)限制酶切割自身的DNA。自學(xué)時(shí)間P72Thequestion：Q1：“分子縫合針”是什么？Q2：“分子縫合針”的類(lèi)型有哪些，它們發(fā)揮作用有何區(qū)別？Theanswer：GC

TT

AA

AA

TT

C

G目的基因G

C

TT

AA

AA

TT

C

G目的基因二“分子縫合針”DNA連接酶DNA連接酶磷酸二酯鍵GC

TT

AA

AA

TT

C

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

G目的基因1、功能：通過(guò)形成磷酸二酯鍵將不同DNA分子的相同末端進(jìn)行連接氫鍵自動(dòng)恢復(fù)Theanswer：二“分子縫合針”DNA連接酶2、種類(lèi)Theanswer：二“分子縫合針”DNA連接酶E·coliDNA連接酶

T4DNA連接酶E考里（來(lái)源大腸桿菌，連接粘性末端）

（來(lái)源T4噬菌體，連接粘性末端和平末端效率低）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGEcoRⅠ限制酶E·coliDNA連接酶或

T4DNA連接酶DNA連接酶不識(shí)別堿基序列，只與末端類(lèi)型有關(guān)CCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCSmaⅠ限制酶

T4DNA連接酶有2個(gè)不同來(lái)源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ進(jìn)行切割，各限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下：哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶SpeⅠ切割的A片段產(chǎn)生的DNA片段相連接，為什么？XbaⅠ因?yàn)閄baⅠ與SpeⅠ切割產(chǎn)生了相同的黏性末端（可互補(bǔ)）結(jié)論：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端名稱(chēng)作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶歸納總結(jié)——與DNA相關(guān)的五種酶的比較DNA磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對(duì)之間的氫鍵將雙鏈DNA切成兩個(gè)或多個(gè)片段將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈DNADNA片段脫氧核苷酸磷酸二酯鍵DNA自學(xué)時(shí)間P72Thequestion：Q1：“分子運(yùn)輸車(chē)”是什么？Q2：作為“分子運(yùn)輸車(chē)”具有哪些條件？Theanswer：三“分子運(yùn)輸車(chē)”載體種類(lèi)受體細(xì)胞不同點(diǎn)質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動(dòng)物病毒細(xì)菌細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別大腸桿菌擬核質(zhì)粒質(zhì)粒環(huán)狀DNATheanswer：三“分子運(yùn)輸車(chē)”載體目的基因插入位點(diǎn)一個(gè)和多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)在受體細(xì)胞中自我復(fù)制或整合到染色體DNA中隨受體DNA同步復(fù)制標(biāo)記基因便于重組DNA分子的篩選抗性基因：四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因目的基因重組DNA分子載體“拼接”受體細(xì)胞導(dǎo)入EcoRⅠ限制酶CCCGGGGAATTCGGGCCCCTTAAGGGGGCCCCTTAA目的基因SmaⅠ限制酶CTTAAGAAGTTC質(zhì)粒GGGccccccGGGCCCGGAAGTTCGEcoRⅠ限制酶SmaⅠ限制酶GGGGCCCCTTAA目的基因CCCGGAAGTTCGCCCGGGAAGTTCGCGAACCTT重組質(zhì)粒GGC①正向連接②正向連接③反向連接多個(gè)限制酶切位點(diǎn)：防止目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化或目的基因與質(zhì)粒反向連接GGGGCCCCTTAA目的基因CCCGGAAGTTCG質(zhì)粒CCCGGGAAGTTCGCGAACCTT重組質(zhì)粒GGC

質(zhì)粒的自身環(huán)化

由于用同種限制酶切割，會(huì)產(chǎn)生相同黏性末端，則可能導(dǎo)致目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接。圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問(wèn)題。1.上述操作中不宜選用SmaI，原因是SmaI會(huì)破壞

和

。2.在基因工程的操作中，不宜只選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，

。目的基因抗性基因目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中標(biāo)記基因便于重組DNA分子的篩選CT制作1、結(jié)構(gòu)單位：脫氧核糖核甘酸OPOH磷酸H3PO3OHO堿基CH2CCCCOHHHHOHH脫氧核糖G鳥(niǎo)嘌呤含氮T胸腺嘧啶A腺嘌呤C胞嘧啶Review：DNA脫氧核糖核酸1’2’3’4’5’腺嘌呤脫氧核苷酸鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸2、脫氧核苷酸的種類(lèi)AGCTRe