基因重組和雜交育種

關(guān)于基因重組和雜交育種

雜交：

兩個(gè)性狀不同的菌株之間進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合，遺傳物質(zhì)交換，重新組合成新的遺傳型個(gè)體的方式。

基因重組：兩個(gè)獨(dú)立基因內(nèi)的遺傳基因，通過一定的途徑轉(zhuǎn)移到一起，形成新的穩(wěn)定基因組的過程稱為基因重組或遺傳重組，簡稱重組。第2頁,共38頁，2024年2月25日，星期天重組和雜交的關(guān)系（1）基因重組是在核酸分子水平上的一個(gè)概念，是遺傳物質(zhì)在分子水平上的雜交。而雜交是在細(xì)胞水平上進(jìn)行的，但其中包含了核酸分子水平上的重組。（2）基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。（3）真核生物中的有性雜交、準(zhǔn)性雜交、原生質(zhì)體融合以及原核生物中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原生質(zhì)體融合等。第3頁,共38頁，2024年2月25日，星期天微生物中各種基因重組形式的比較整體染色體局部雜交高頻率低頻率部分染色體個(gè)別或少數(shù)基因細(xì)胞融合或聯(lián)結(jié)性細(xì)胞真菌的游行生殖體細(xì)胞真菌的準(zhǔn)性生殖細(xì)胞間暫時(shí)溝通細(xì)菌的接合性導(dǎo)細(xì)胞間不接觸吸收游離DNA片段轉(zhuǎn)化噬菌體攜帶DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)由噬菌體提供遺傳物質(zhì)完整噬菌體溶源轉(zhuǎn)變噬菌體DNA轉(zhuǎn)染重組范圍供體和受供體間的關(guān)系第4頁,共38頁，2024年2月25日，星期天一二四三轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)接合原生質(zhì)體融合形式一、原核生物的基因重組第5頁,共38頁，2024年2月25日，星期天（一）轉(zhuǎn)化（transformation）定義：受體菌直接吸收供體菌的DNA片段并把它整合到自己的基因組中，而獲得供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化（或者轉(zhuǎn)化作用）。

1、概述:

轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)：不需兩個(gè)細(xì)胞直接接觸，供體DNA提取出來，注入受體即可。

轉(zhuǎn)化子通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代第6頁,共38頁，2024年2月25日，星期天2、感受態(tài)定義：指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，凡能發(fā)生轉(zhuǎn)化，其受體細(xì)胞必須處于感受態(tài)—從時(shí)間上來看，有的出現(xiàn)在生長的指數(shù)期后期—在具有感受態(tài)的微生物中，感受態(tài)細(xì)胞所占比例和維持時(shí)間也不同—外界環(huán)境因子也有重要影響（一）轉(zhuǎn)化（transformation）第7頁,共38頁，2024年2月25日，星期天（一）轉(zhuǎn)化（transformation）

轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是離體的DNA片段。一般原核生物的核基因組是一條環(huán)狀DNA長鏈，不管在自然條件或認(rèn)為條件下都極易斷裂成碎片，故轉(zhuǎn)化因子通常都只是15kb作用的片段。轉(zhuǎn)化的頻率通常為0.1%~1.0%,最高為20%。3、轉(zhuǎn)化因子4、轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化過程被研究得較深入的是G+S.pneumoniae

第8頁,共38頁，2024年2月25日，星期天G+細(xì)菌的轉(zhuǎn)化過程及其機(jī)制示意圖第9頁,共38頁，2024年2月25日，星期天（一）轉(zhuǎn)化（transformation）5、轉(zhuǎn)染

指用提純的病毒核酸去感染其宿主細(xì)胞或其原生質(zhì)體，可增至出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。

從表面上看，轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化相似，但實(shí)質(zhì)上兩者的區(qū)別十分明顯。因?yàn)樽鳛檗D(zhuǎn)染的病毒核酸，絕不是作為供體基因的功能，被感染的宿主也絕不是能形成轉(zhuǎn)化子的受菌體。第10頁,共38頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)導(dǎo)的種類

通過缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。

(二)轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）

普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得部分新性狀的重組細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)第11頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

(二)轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）

1、普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對(duì)供體菌基因組上任何小片段DNA進(jìn)行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。（1）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)or完全轉(zhuǎn)導(dǎo)）以S.typhimurium為例

用野生型菌株作供體菌

營養(yǎng)缺乏型突變株作受體菌

P22噬菌體作轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)第12頁,共38頁，2024年2月25日，星期天由P22噬菌體引起的完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)過程示意（1）當(dāng)P22在供體菌內(nèi)增值時(shí)，宿主的核染色體組發(fā)生斷裂，待噬菌體成熟與進(jìn)行包裝之際，有10-6~10-8個(gè)噬菌體的衣殼與噬菌體頭部DNA核心大小相仿的一小段供體菌DNA（P22約可包裝核染色體組的1%）誤包，形成了一個(gè)完全不含P22自身DNA的完全缺陷噬菌體，此即轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。（2）當(dāng)供體菌裂解時(shí)，若把少量裂解物與大量的受體菌接觸，務(wù)必使其感染復(fù)數(shù)小于1，這一完全缺陷噬菌體就可把外源DNA片段導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)。第13頁,共38頁，2024年2月25日，星期天由p22噬菌體引起的完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)第14頁,共38頁，2024年2月25日，星期天（3）導(dǎo)入的外源DNA片段可與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)，再通過雙交換而整合到染色體組上，從而使后者成為一個(gè)遺傳性狀穩(wěn)定的重組體，稱做普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)子。外源dsDNA片段經(jīng)雙交換形成一穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子示意圖第15頁,共38頁，2024年2月25日，星期天（2）流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）能在選擇性培養(yǎng)基平板上形成微小菌落就是流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點(diǎn)。概念：受體菌經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的供體DNA片段在受體菌中不發(fā)生配對(duì)、交換和整合，也不迅速消失，而只是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯（性狀表達(dá)），這種現(xiàn)象就稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。現(xiàn)象：發(fā)生流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在其進(jìn)行細(xì)胞分裂后，只能將這段外源DNA分配給一個(gè)子細(xì)胞，而另一子細(xì)胞僅獲得供體基因的產(chǎn)物——酶，在表型上表現(xiàn)出輕微的供體菌特征，每經(jīng)過一次分裂，就受到一次稀釋。

第16頁,共38頁，2024年2月25日，星期天定義：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。特點(diǎn)：只能轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌的個(gè)別特定基因（一般為噬菌體整合位點(diǎn)兩側(cè)的基因）該特定基因由部分缺陷的噬菌體攜帶缺陷噬菌體是由于其在形成過程中所發(fā)生的低頻率（約10–

5）“誤切”，或由于雙重溶源菌的裂解而形成（約形成50%缺陷噬菌體）局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的產(chǎn)生要通過UV等因素對(duì)溶原菌的誘導(dǎo)并引起裂解后才產(chǎn)生。分類：低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)與高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)2.局限轉(zhuǎn)導(dǎo)(specializedtransduction)第17頁,共38頁，2024年2月25日，星期天一般的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象中，從宿主染色體上切離時(shí)發(fā)生不正常切離的頻率極低，故這種裂解物中的部分缺陷噬菌體的比例是極低的（10–4~10–6）。把這種裂解物稱為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物。通過一般溶源釋放的噬菌體所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因其只能形成極少數(shù)（10–4~10–6）轉(zhuǎn)導(dǎo)子，故稱低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT，lowfrequencytransduction）第18頁,共38頁，2024年2月25日，星期天當(dāng)用LFT裂解物以高m.o.i感染E.coligal–（不發(fā)酵半乳糖的營養(yǎng)缺陷型）菌株時(shí)，凡是感染有λdgal噬菌體任一細(xì)胞，幾乎都同時(shí)感染有正常的λ噬菌體。這時(shí)λ與λdgal同時(shí)整合在一個(gè)受體菌的核染色體組上，從而使它成為一個(gè)雙重溶源菌（doublelysogen）。當(dāng)雙重溶源菌被紫外線等誘導(dǎo)時(shí)，其中的正常λ噬菌體的基因可補(bǔ)償λdgal缺失的部分基因功能，因而兩種噬菌體就同時(shí)獲得復(fù)制的機(jī)會(huì)。所以在雙重溶源菌中的正常λ噬菌體被稱為助體（或輔助）噬菌體（helperphage）。雙重溶源菌的裂解物中含有等量的λ和λdgal粒子，稱為HFT（高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)）裂解物。（2）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT，highfrequencytransduction）第19頁,共38頁，2024年2月25日，星期天3.溶源轉(zhuǎn)變概念：當(dāng)正常的溫和噬菌體感染宿主而使其發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體的基因整合到宿主的核基因組上，而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變。性質(zhì)：表面上與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似，而本質(zhì)上不同于轉(zhuǎn)導(dǎo)。原因：這是一種不攜帶任何外源基因的正常噬菌體是噬菌體的基因而不是供體菌的基因提供了宿主的新性狀新性狀是宿主細(xì)胞溶源化時(shí)的表型，而不是經(jīng)遺傳重組形成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子獲得的性狀可隨噬菌體的消失而同時(shí)消失第20頁,共38頁，2024年2月25日，星期天定義：供體菌（“雄”）通過其性菌毛與受體菌（“雌”）直接接觸，把F質(zhì)?；蚱鋽y帶的不同長度的核基因片段傳遞給后者，使后者獲得若干心遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞就是接合子（conjugant）（二）接合（conjugation）

J.Lederberg等采用E.L.Tautum（1946）建立用E、coli的兩株?duì)I養(yǎng)缺陷型突變株在基本培養(yǎng)基上是否生長來檢驗(yàn)重組子存在的方法后，奠定了方法學(xué)上的基礎(chǔ)；第21頁,共38頁，2024年2月25日，星期天研究細(xì)菌接合方法的基本原理

此法也是目前微生物遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)中最基本的核極為重要的研究方法之一。第22頁,共38頁，2024年2月25日，星期天存在范圍：細(xì)菌：G–較為多見如E.coli、Salmonella、Shigella、Klebsiella（克雷伯氏菌屬）、Serratia（沙雷氏菌屬）、Vibrio（弧菌屬）、Azotobacter（固氮菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）等放線菌：Streptomyces（鏈霉菌屬）、Nocardia（諾卡氏菌屬）接合還可發(fā)生在不同屬的菌種之間，如E.coli與Salmonellatyphimurium之間或S.typhimurium與Shigelladysenteriae（痢疾至賀氏菌）間E.coli的F因子：決定性別的質(zhì)粒，屬于附加體（episome），可以通過接合作用獲得，也可以通過吖啶類化合物、溴化乙錠或絲裂霉素等的處理而消除。第23頁,共38頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)F質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的存在方式，可將E.coli分為四種類型：

①F+（“雄性”）菌株：

細(xì)胞內(nèi)含有（1~4個(gè)）游離的F因子，細(xì)胞表面存在與F因子數(shù)目相當(dāng)?shù)男跃ＥcF–相接觸時(shí)，可通過性菌毛將F因子轉(zhuǎn)移到F–細(xì)胞中，使之也變成F+菌株。F因子以很高的頻率傳遞，但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞的染色體DNA一般并不被轉(zhuǎn)移。第24頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

細(xì)胞中不含有F因子，細(xì)胞表面不具有有性纖毛。可以通過與F+、F’或Hfr菌株接合而接受供體菌的F因子、F’因子或Hfr菌株的部分或全部遺傳信息，相應(yīng)地可以轉(zhuǎn)變成F+菌株、F’菌株或重組子。據(jù)估計(jì)，從自然界分離到的2000株E.coli中約有30%是F–菌株。②F–（“雌性”）菌株：第25頁,共38頁，2024年2月25日，星期天③Hfr（高頻重組，highfrequencyrecombination）菌株：含有與染色體特定位點(diǎn)整合的F因子。因該菌株與F–

接合后的重組頻率比F+菌株高幾百倍而得名。Hfr菌株與F–菌株接合時(shí)，Hfr染色體雙鏈中的一條單鏈在F因子處發(fā)生斷裂，F(xiàn)因子位于線狀單鏈DNA的兩端，整段單鏈線狀染色體從5’端開始等速進(jìn)入F–細(xì)胞，在沒有外界干擾的情況下，全部轉(zhuǎn)移過程的完成需要約120分鐘。第26頁,共38頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞中含有游離的、帶小段染色體基因的環(huán)狀F因子，可與F–

菌株接合，使其成為F′菌株。F′菌株的形成：由Hfr菌株中的F因子在不正常切離而脫離核染色體組時(shí)所形成，并因此造成細(xì)胞染色體發(fā)生缺失，F(xiàn)因子也缺失一段DNA.由Hfr異常釋放所生成的F’菌株，稱為初生F’菌株；由F–接受外來F′因子所產(chǎn)生的F′叫作次生F′細(xì)胞；④F’菌株：第27頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)F-mediatedtransduction:

利用F’菌株與F–接合可將供體染色體DNA傳入F–菌株，從而使F–既獲得供體菌的若干遺傳特性，又可獲得F因子。這種接合方式叫做F因子轉(zhuǎn)導(dǎo),又稱性導(dǎo)sexduction.初生F’菌株和次生F’菌株的由來第28頁,共38頁，2024年2月25日，星期天(四)原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合

通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，借以獲得具有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程，稱為原生質(zhì)體融合。所獲得的重組子叫融合子。原生質(zhì)體融合的操作示意圖第29頁,共38頁，2024年2月25日，星期天二、真核微生物的基因重組主要方式：有性雜交準(zhǔn)性雜交第30頁,共38頁，2024年2月25日，星期天（一）有性雜交

一般指不同遺傳型的兩性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生通過減數(shù)分裂，并產(chǎn)生高頻率基因重組并產(chǎn)生新遺傳型后代的過程。凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都能采用與高等動(dòng)、植物雜交育種相似的有性雜交方法進(jìn)行育種。第31頁,共38頁，2024年2月25日，星期天S.Cerevisiae的雙倍體和單倍體細(xì)胞的比較項(xiàng)目雙倍體單倍體細(xì)胞大，橢圓形小，球形菌落大，形態(tài)均一小，形態(tài)變化較多液體培養(yǎng)繁殖快，細(xì)胞較分散繁殖較慢，細(xì)胞常聚集成團(tuán)在產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上形成子囊及子囊孢子不形成子囊第32頁,共38頁，2024年2月25日，星期天定義：通過同一物種兩個(gè)不同菌株的體細(xì)胞發(fā)生融合，不經(jīng)過減數(shù)分裂而經(jīng)有絲分裂導(dǎo)致低頻率基因重組并產(chǎn)生重組子。存在范圍：常見于一些真菌尤其是在還未發(fā)現(xiàn)有性生殖的半知菌中。（二）準(zhǔn)性生殖第33頁,共38頁，2024年2月25日，星期天準(zhǔn)性生殖的過程：①菌絲聯(lián)結(jié)②異核體形成（質(zhì)配）③核配形成雜合二倍體④體細(xì)胞交換