天然藥物提取方法

關(guān)于天然藥物提取方法基本操作技術(shù)與應(yīng)用天然藥物活性成分的研究（了解內(nèi)容）天然產(chǎn)物的提取方法（掌握內(nèi)容）天然產(chǎn)物的分離方法（掌握內(nèi)容）色譜分離法（掌握內(nèi)容）天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)測定（熟悉內(nèi)容）第2頁,共86頁，2024年2月25日，星期天研究途徑臨床調(diào)查收集原料成分提取分離成分預(yù)試驗活性篩選文獻(xiàn)資料調(diào)研結(jié)構(gòu)確定動物試驗臨床試驗第3頁,共86頁，2024年2月25日，星期天提取的基本知識什么是提取？提取的思路（已知成分、未知成分）提取前預(yù)處理（一般過2號篩為宜，同時注意酶的影響）基本原理—相似相溶影響因素（溶劑的選擇、方法選擇、時間、溫度、粉碎度等）極性第4頁,共86頁，2024年2月25日，星期天極性常用溶劑極性排列順序：石油醚<苯<無水乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水官能團(tuán)的極性排列順序：烷烴<鹵代烴<醚<酯<酮<醛<酰胺<胺<醇<水<酚<羧酸第5頁,共86頁，2024年2月25日，星期天溶劑分類與特點（一）水：價廉，安全，對細(xì)胞的穿透能力強。適用于無機鹽、糖類、鞣質(zhì)、氨基酸與蛋白質(zhì)、有機酸鹽、生物堿鹽、苷類化合物的提取。親水性有機溶劑：甲醇、乙醇、丙酮等。特點：可與水任意比混溶，毒性低、價廉、回收方便，對細(xì)胞的穿透能力強。適用于多種成分的提取，其中，乙醇又稱為“萬能溶劑”。第6頁,共86頁，2024年2月25日，星期天溶劑分類與特點（二）親脂性有機溶劑：石油醚、乙醚、苯、氯仿、乙酸乙酯等。特點：選擇性強、回收方便、但易燃、有毒、價貴。適用于揮發(fā)油、油脂、葉綠素、樹脂、游離生物堿、苷元等成分的提取。第7頁,共86頁，2024年2月25日，星期天提取技術(shù)與方法（一）溶劑法：僅限于低分子量、含量高的成分的提取。根據(jù)“相似相溶”的原則進(jìn)行提取。（二）其他方法根據(jù)化合物的特殊性質(zhì)選擇特殊的提取方法。水蒸氣蒸餾法升華法共9種方法第8頁,共86頁，2024年2月25日，星期天溶劑提取法浸漬法滲漉法煎煮法回流法連續(xù)回流法超聲提取法超臨界流體萃取法第9頁,共86頁，2024年2月25日，星期天浸漬法分為冷浸法（室溫）和溫浸法（40~60℃）。常用溶劑：水、酸水、堿水、稀醇等。適用于遇熱易被破壞的成分或含大量淀粉、粘液質(zhì)、果膠、樹膠等多糖類成分的提取。缺點：提取時間長、溶劑用量大、提取效率低、用水作溶劑時易發(fā)霉。第10頁,共86頁，2024年2月25日，星期天滲漉法適用范圍與提取溶劑同浸漬法。步驟：浸潤、裝筒、排氣、浸漬、滲漉。優(yōu)點：提取效率較高。缺點：提取時間長、溶劑用量大。第11頁,共86頁，2024年2月25日，星期天煎煮法藥房及家庭中最為常用的中藥提取方法。常用溶劑：水適用于對熱穩(wěn)定的成分的提取。含多糖類成分量大的藥材因煎煮后呈糊狀，不宜用本法。第12頁,共86頁，2024年2月25日，星期天回流法最常用的提取方法。對熱不穩(wěn)定的成分不適用。提取效率較高。選擇什么試劑？適用于什么成分？第13頁,共86頁，2024年2月25日，星期天連續(xù)回流法浸漬法和回流法的特點兼有。對熱不穩(wěn)定的成分慎用。提取時間長。第14頁,共86頁，2024年2月25日，星期天超聲提取法利用超聲波振動產(chǎn)生的能量在提取液中產(chǎn)生“空化現(xiàn)象”提取有效成分。優(yōu)點：操作簡便，幾乎適用于各種溶劑的提取，提取時間短，效率高。第15頁,共86頁，2024年2月25日，星期天超臨界流體萃取法超臨界流體（supercriticalfluid，SF）：當(dāng)某物質(zhì)處于臨界溫度和臨界壓力以上時可形成一種既非液體又非氣體的單一相態(tài)，將這一狀態(tài)的物質(zhì)稱為超臨界流體。目前最常用的是CO2-SFE技術(shù)。第16頁,共86頁，2024年2月25日，星期天水蒸氣蒸餾法適用于具有揮發(fā)性，可與水蒸氣一起蒸餾出來，與水不反應(yīng)，又難溶于水的化合物的提取。第17頁,共86頁，2024年2月25日，星期天升華法適用于有升華性，升華溫度適當(dāng)，遇熱較穩(wěn)定的化合物的提取?？煞譃槌荷A和減壓升華兩種。第18頁,共86頁，2024年2月25日，星期天關(guān)于提取問題小結(jié)極性（溶劑的極性、化合物的極性）提取溶劑的分類與特點提取的原理提取的方法與適用范圍第19頁,共86頁，2024年2月25日，星期天分離方法（一）分離前處理（二）結(jié)晶與重結(jié)晶（三）分離方法系統(tǒng)溶劑分離法兩相溶劑萃取法沉淀法6.透析法9.色譜法吸附法（補充）7.分餾法鹽析法（補充）8.升華法第20頁,共86頁，2024年2月25日，星期天分離前處理提取液一般體積較大，目標(biāo)成份濃度低，需要先濃縮提高濃度，然后再進(jìn)行分離工作。濃縮的方法常壓蒸餾減壓蒸餾薄膜蒸發(fā)第21頁,共86頁，2024年2月25日，星期天常壓蒸餾適用于有效成分受熱不易分解，低沸點有機溶劑（氯仿、乙醚、石油醚等）的提取液的濃縮。第22頁,共86頁，2024年2月25日，星期天減壓蒸餾適用于溶劑沸點高，有效成分受熱易分解的提取液的濃縮。第23頁,共86頁，2024年2月25日，星期天薄膜蒸發(fā)濃縮效率高，受熱時間短，特別適用于濃縮水或稀醇為溶劑的提取液。第24頁,共86頁，2024年2月25日，星期天結(jié)晶與重結(jié)晶（一）結(jié)晶的條件（掌握)（二）結(jié)晶溶劑的選擇(熟悉）（三）制備結(jié)晶的方法

1.晶核的形成

2.晶鏈的延長（四）結(jié)晶純度的判斷(重點掌握）第25頁,共86頁，2024年2月25日，星期天結(jié)晶的條件被分離化合物純度高；呈過飽和狀態(tài)；最適結(jié)晶溫度：5~10℃；充分放置。第26頁,共86頁，2024年2月25日，星期天結(jié)晶溶劑的選擇（理想溶劑）一不與結(jié)晶物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)；雜質(zhì)與結(jié)晶物質(zhì)在溶劑中的溶解度相差大；目的物在溶劑中的溶解度隨溫度不同有顯著差別；溶劑沸點不宜太高或太低（可在60℃）；溶劑沸點低于化合物的熔點；溶劑沸點低于結(jié)晶溫度；能給出較好的晶形，無劇毒。第27頁,共86頁，2024年2月25日，星期天結(jié)晶溶劑的選擇二常用溶劑：甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等。其他不常用溶劑：二甲基亞砜、乙腈、甲酰胺、二甲基甲酰胺、冰醋酸等?；旌先軇咳绾芜x擇與使用水--乙醇；乙醇—乙醚；石油醚—苯；水—丙酮；乙醚—乙酸乙酯—乙醇等。第28頁,共86頁，2024年2月25日，星期天結(jié)晶純度的判斷一定的晶形、均勻的色澤；有固定的熔點，熔距較??；TLC：經(jīng)過三種以上展開劑展開得均一圓形的斑點。第29頁,共86頁，2024年2月25日，星期天系統(tǒng)溶劑分離法目前是研究成分不明的天然產(chǎn)物的最常用方法。選擇3~4種不同極性的溶劑，由低極性到高極性分步對粗提物進(jìn)行分離。手續(xù)復(fù)雜、對化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易引起分解、異構(gòu)化的產(chǎn)物應(yīng)特別注意。第30頁,共86頁，2024年2月25日，星期天兩相溶劑萃取法（一）基礎(chǔ)知識原理分配系數(shù)與分離因子（二）萃取方法第31頁,共86頁，2024年2月25日，星期天基礎(chǔ)知識一、原理利用混合物中各成分在兩種互不混溶的溶劑中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的目的。二、分配系數(shù)與分離因子分配系數(shù)（K）K=C有機相/C水相分離因子（β）β=KA/KB第32頁,共86頁，2024年2月25日，星期天假設(shè)KA=10，KB=0.1，則β=100當(dāng)β≥100時，一次簡單的萃取就可以完成分離；當(dāng)10<β≤100，需萃取10~12次；當(dāng)β≤2時，需要完成100次以上的萃??；當(dāng)β≈1時，理論上無法完成萃取分離的目的。第33頁,共86頁，2024年2月25日，星期天萃取方法簡單萃取法（掌握）pH梯度萃取法（重點掌握）（補充）逆流連續(xù)萃取法（了解）逆流分溶法（countercurrentdistributionCCD)（了解）液滴逆流分配法（dropletcountercurrentchromatogrophyDCCC）（了解）第34頁,共86頁，2024年2月25日，星期天簡單萃取法適用于分離因子較大的情況的分離。提取液的密度最好在1.1~1.2?！暗攘慷啻巍痹瓌t（掌握）乳化現(xiàn)象（熟悉）第35頁,共86頁，2024年2月25日，星期天等量多次原則證明設(shè)Vml水中含有Wg溶質(zhì)，用Sml有機溶劑萃取后，在水中尚有W1g溶質(zhì)沒有被萃取出來，則分配系數(shù)KD為：整理得第36頁,共86頁，2024年2月25日，星期天第2次再用Sml有機溶劑萃取水中的溶質(zhì)后仍有W2g沒有被萃取出來，則因此，若每次用Sml有機溶劑萃取，最后剩在Vml水中的溶質(zhì)Wn為若一次用nSml有機溶劑萃取，剩余在水中的溶質(zhì)第37頁,共86頁，2024年2月25日，星期天結(jié)論用總量相同的溶劑，分多次萃取的效率要比1次萃取的效率高。第38頁,共86頁，2024年2月25日，星期天乳化現(xiàn)象產(chǎn)生原因天然產(chǎn)物中含有皂苷、蛋白質(zhì)、植物膠質(zhì)、鞣質(zhì)等表面活性物質(zhì)；兩相互不相溶的溶劑；振搖；少量輕質(zhì)的沉淀等。第39頁,共86頁，2024年2月25日，星期天解決方案較長時間靜置；2.將乳狀液分出，再換新溶劑萃??；3.將乳狀液加溫或冷凍；4.將乳狀液抽濾；5.加入少量電解質(zhì)（如NaCl等）；6.加入少量低級醇（如乙醇、戊醇等）。第40頁,共86頁，2024年2月25日，星期天pH梯度萃取法是分離酸性、堿性、兩性有機化合物常用的手段。原理：由于溶劑系統(tǒng)PH的改變，改變了化合物的存在狀態(tài)（游離型或解離型），從而改變了化合物在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)。酸性化合物：pH=pka-2游離；

pH=pka+2

解離。堿性化合物相反。第41頁,共86頁，2024年2月25日，星期天以酸性化合物HA為例酸性化合物在水中電離：電離常數(shù)取負(fù)對數(shù)第42頁,共86頁，2024年2月25日，星期天逆流連續(xù)萃取法操作簡便；萃取完全，不易乳化；適合于兩相互不混溶的溶劑的密度相差較大的系統(tǒng)的分離。第43頁,共86頁，2024年2月25日，星期天逆流分溶法（CCD)適用于性質(zhì)相似的異構(gòu)體或同系物的分離。特點：條件溫和，樣品易于回收。注意：溶質(zhì)濃度越低分離效果越好。第44頁,共86頁，2024年2月25日，星期天液滴逆流分配法（DCCC）CCD的改進(jìn)方法，不易乳化。特別適用于皂苷類化合物的分離。需要動力泵。第45頁,共86頁，2024年2月25日，星期天沉淀法可以分為酸堿沉淀、試劑沉淀、鉛鹽沉淀。酸堿沉淀：適用于酸性、堿性物質(zhì)的分離。試劑沉淀沉淀試劑沉淀有機溶劑沉淀3.鉛鹽沉淀中性醋酸鉛堿性醋酸鉛第46頁,共86頁，2024年2月25日，星期天吸附法（補充）選擇適宜吸附劑（如硅膠、Al2O3、活性炭）去除雜質(zhì)或選擇性篩選目標(biāo)成分。如用活性炭去除在提取液中的葉綠素等脂溶性成分。第47頁,共86頁，2024年2月25日，星期天鹽析法（補充）在水提液中加入NaCl、MgCl2等無機鹽促進(jìn)極性稍大組分析出的方法。如鹽酸小檗堿易溶于熱水，在冷水中溶解度小，但在結(jié)晶冷卻過程中不易析出結(jié)晶，可通過加入NaCl固體的方法促進(jìn)析晶。第48頁,共86頁，2024年2月25日，星期天透析法第49頁,共86頁，2024年2月25日，星期天色譜法吸附色譜(adsorptionchromatography)分配色譜/液相色譜(patitionchr.)離子交換色譜(ionexchangechr.)大孔吸附樹脂法(macro-reticularresinemethod)凝膠色譜法(gelfiltrationchr.)氣相色譜法(gaschromatography)高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography)第50頁,共86頁，2024年2月25日，星期天吸附色譜基本原理：利用混合物中不同組分分子、溶劑分子與吸附劑表面分子間的作用力不同，引起不同的吸附性能而進(jìn)行分離。吸附劑色譜結(jié)果操作方式第51頁,共86頁，2024年2月25日，星期天

極性吸附劑：硅膠、氧化鋁吸附劑非極性吸附劑：活性炭聚酰胺硅膠：微酸性，不宜直接用于堿性物質(zhì)的分離。顆粒表面的硅醇基起吸附作用，需在105~110℃活化。氧化鋁：微堿性，不宜直接用于含醛基、羰基、酯基化合物的分離?；钚蕴浚憾嘤糜谒嵋褐兄苄噪s質(zhì)的分離。第52頁,共86頁，2024年2月25日，星期天4、聚酰胺：酰胺基可以與羥基、羧基、硝基等形成氫鍵。分離規(guī)律（P67）

：氫鍵越多，吸附越牢，Rf越小。如易形成分子內(nèi)氫鍵，Rf增大。芳香化程度越高，吸附越牢。各種溶劑的洗脫能力：水<甲醇<丙酮<NaOH水溶液<甲酰胺<二甲基甲酰胺<尿素水溶液第53頁,共86頁，2024年2月25日，星期天操作方式薄層色譜（thinlayerchromatography,TLC)

操作步驟：制板點樣展開定位柱色譜操作步驟：吸附劑與洗脫劑選擇裝柱上樣洗脫分離注意活化第54頁,共86頁，2024年2月25日，星期天分配色譜（一）基本原理：根據(jù)被分離物質(zhì)在兩相中的溶解性不同而進(jìn)行分離（CCD）。（二）正相色譜與反相色譜（掌握）（三）支持劑：硅藻土、纖維素粉、濾紙、含水17%的硅膠等。（四）操作方式

1.紙層析(PC)2.TLC3.柱層析第55頁,共86頁，2024年2月25日，星期天正相色譜：固定相的極性大于流動相的極性。固定相多為強極性溶劑，如水、緩沖液等。反相色譜：固定相的極性小于流動相的極性。固定相多為親脂性溶劑。第56頁,共86頁，2024年2月25日，星期天支持劑的要求無吸附作用；不溶于兩相溶劑中；不與被分離物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；并能吸著一定的固定相；可以使流動相自由通過而不改變其組成。第57頁,共86頁，2024年2月25日，星期天離子交換色譜（IEC）（一）分離原理：利用離子交換樹脂在水溶液中可以解離，并與溶液中其它離子產(chǎn)生可逆性的交換，達(dá)到分離離子型化合物的目的。（二）離子交換樹脂（熟悉）（三）分離結(jié)果（重點掌握）（四）離子交換樹脂的選擇（了解）（五）操作（了解）第58頁,共86頁，2024年2月25日，星期天離子交換樹脂陽離子交換樹脂：能與溶液中陽離子進(jìn)行交換，按交換活性分為強酸型陽離子交換樹脂和弱酸型陽離子交換樹脂兩類。如：RSO3H+NaClRSO3Na+HCl陰離子交換樹脂：能與溶液中陰離子進(jìn)行交換，按交換活性分為強堿型陰離子交換樹脂和弱堿型陰離子交換樹脂兩類。如：RNOH+NaClRNCl+NaOH第59頁,共86頁，2024年2月25日，星期天樣品強酸型陽離子交換樹脂酸性及中性物質(zhì)強堿型陰離子交換樹脂稀NH4OH洗脫洗脫液（堿性及兩性）

中性物質(zhì)稀堿洗脫洗脫液（酸性物質(zhì)）強堿型陰離子交換樹脂堿性物質(zhì)稀酸洗脫洗脫液（兩性物質(zhì)）流出液流出液流出液第60頁,共86頁，2024年2月25日，星期天離子交換樹脂的選擇根據(jù)被分離物質(zhì)選擇樹脂，如分離生物堿選擇陽離子交換樹脂。根據(jù)被分離物質(zhì)的解離常數(shù)選擇，如堿性強選擇弱酸型陽離子交換樹脂。根據(jù)化合物大小選擇，如分離大分子化合物可選擇交聯(lián)度3~6%的樹脂。第61頁,共86頁，2024年2月25日，星期天操作預(yù)處理：水浸泡（溶脹）酸堿處理（洗去雜質(zhì)）水洗至中性裝柱上樣與洗脫再生第62頁,共86頁，2024年2月25日，星期天大孔吸附樹脂法

主要用于水溶性化合物的提取分離。大孔吸附樹脂（吸附性與范德華力、氫鍵有關(guān)）大孔吸附樹脂類型影響因素：1.分子極性大??；2.分子體積大??；3.pH值的影響。預(yù)處理與再生第63頁,共86頁，2024年2月25日，星期天大孔吸附樹脂的特點吸附性和篩選性相結(jié)合的分離材料選擇性好吸附容量大機械強度高再生處理方便吸附速度快解吸容易不易受到無機鹽等離子或小分子化合物的影響第64頁,共86頁，2024年2月25日，星期天大孔吸附樹脂類型非極性吸附樹脂（芳香族吸附劑）：以苯乙烯為單體，二乙基苯為交聯(lián)劑。中極性吸附樹脂（脂肪族吸附劑）：以甲基丙烯酸酯作為單體和交聯(lián)劑。極性吸附樹脂：結(jié)構(gòu)中含有硫氧、酰胺、氮氧等極性基團(tuán)。第65頁,共86頁，2024年2月25日，星期天預(yù)處理與再生預(yù)處理：水洗、溶脹后用甲醇或95%的乙醇浸泡24小時，至洗滌液加水后不呈白色渾濁，最后用蒸餾水洗掉有機溶劑。再生：蒸餾水、甲醇、乙醇反復(fù)洗滌，必要時可用3%的鹽酸水溶液或3%的氫氧化鈉溶液再生。第66頁,共86頁，2024年2月25日，星期天凝膠色譜法（GFC）原理：“分子篩”凝膠的種類1.葡聚糖凝膠（SephadexG）2.羥丙基葡聚糖凝膠（LH-20）第67頁,共86頁，2024年2月25日，星期天氣相色譜法：適用于沸點低，易揮發(fā)，對熱穩(wěn)定的化合物的分離。HPLC電泳技術(shù)第68頁,共86頁，2024年2月25日，星期天結(jié)構(gòu)測定(一)鑒定天然產(chǎn)物化學(xué)成分的一般步驟1.化合物純度測定2.初步推測化合物類型3.測定分子式、計算不飽和度4.確定官能團(tuán)或結(jié)構(gòu)片斷5.確定分子的平面結(jié)構(gòu)6.確定分子的立體結(jié)構(gòu)(二)結(jié)構(gòu)測定中波譜知識回顧第69頁,共86頁，2024年2月25日，星期天純度測定方法1.結(jié)晶的性質(zhì)2.層析行為（PC、TLC）3.GC4.HPLC5.電泳……第70頁,共86頁，2024年2月25日，星期天分子式測定方法、不飽和度的計算分子式測定方法（MS）：1.元素定性分析2.高分辨質(zhì)譜法（HR-MS)不飽和度的計算

U=(2+2n4+n3-n1)/2第71頁,共86頁，2024年2月25日，星期天例1：元素定性分析定量分析結(jié)果：C：79.35%，H：10.21%所以，O=100-79.35-10.21=10.44%三元素在結(jié)構(gòu)中所占比例為：C=79.35/12.01=6.6110.16H=10.21/1.008=10.1315.58O=10.44/16.00=0.651分子式為（C10H16O1）n如MS的分子離子峰為456，則n=3第72頁,共86頁，2024年2月25日，星期天例2：高分辨質(zhì)譜法以12C=12.000000為基準(zhǔn)，1H=1.00782514N=14.00307，16O=15.99491故：C8H12N4164.1063C9H12N2O164.0950C10H12O2164.0837C10H16N2164.1315分子量均為164，但精確質(zhì)量不一樣，可用于區(qū)別化合物。第73頁,共86頁，2024年2月25日，星期天常用波譜知識回顧紫外光譜(UV)紅外光譜(IR)核磁共振(NMR)質(zhì)譜(MS)練習(xí)第74頁,共86頁，2024年2月25日，星期天紫外光譜用不同波長的紫外光為光源（200~400nm），依次照射一定濃度的樣品溶液，分別測定其吸光度（A），并用波長對吸光度（或摩爾吸光系數(shù)）作圖，得紫外吸收光譜圖。應(yīng)用：定性鑒別、純度檢查、單組分的定量分析以及結(jié)構(gòu)解析（輔助手段）。只能顯示分子中部分結(jié)構(gòu)的特征。第75頁,共86頁，2024年2月25日，星期天可鑒定的結(jié)構(gòu)片斷某種發(fā)色團(tuán)的存在；順反異構(gòu)體的鑒定；吸收帶R帶：雜原子的不飽和基團(tuán)，波長>270nm,弱吸收；可隨溶劑極性的不同而移動。K帶：共軛結(jié)構(gòu)，強吸收。B帶：芳香化合物，似掌狀，256nm左右，弱吸收。E帶：芳香化合物，強吸收，可分為E1（180nm)和E2(200nm)兩個峰。第76頁,共86頁，2024年2月25日，星期天紅外光譜廣泛用來鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，簡單迅速，可靠。用波長2.5-15um（4000-667cm-1）的光波為光源依次照射樣品，以波數(shù)（或波長）為橫坐標(biāo)，百分透光度為縱坐標(biāo)繪制的譜圖。與紫外光譜的區(qū)別：IR為振動-轉(zhuǎn)動光譜適用范圍廣特征性強第77頁,共8