微生物的分離和純培養(yǎng)

關(guān)于微生物的分離和純培養(yǎng)微生物:

結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單，個(gè)體多數(shù)十分微小，通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)。2、類群1、特點(diǎn)第2頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天病毒（無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、寄生生活）第3頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)菌

電子顯微鏡下的結(jié)核桿菌第4頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天放線菌第5頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天真菌青霉菌酵母菌第6頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天原生生物第7頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動(dòng)物2、類群無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞真核細(xì)胞第8頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)是微生物最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它包括培養(yǎng)基的制備、滅菌和消毒、接種、培養(yǎng)等步驟第9頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天內(nèi)容提要：微生物及其分類培養(yǎng)基與各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)菌技術(shù)菌落大腸桿菌的純化培養(yǎng)微生物數(shù)量的測(cè)定第10頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、概念二、培養(yǎng)基

人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。第11頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天按成分不同劃分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基。用于工業(yè)生產(chǎn)化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基高氏1號(hào)培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基。用于分類和鑒定2、分類第12頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%，固體培養(yǎng)基常用來(lái)進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏

瓊脂含量一般為0.2%-0.7%，觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類鑒定及噬菌體效價(jià)滴定不加任何凝固劑，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究半固體培養(yǎng)基第13頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天按用途不同劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）用來(lái)將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，有利于所需微生物的生長(zhǎng)用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基，微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化選擇培養(yǎng)基第14頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、基本營(yíng)養(yǎng)碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、水、無(wú)機(jī)鹽⑴碳源無(wú)機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物⑵氮源無(wú)機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等含CHON的有機(jī)物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源(3)能源第15頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）生長(zhǎng)因子：

微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物，如：維生素、氨基酸、堿基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）。

第16頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基

培養(yǎng)基組分作用瓊脂20g牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5gH2O定容至1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方凝固劑提供碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子碳源、氮源、生長(zhǎng)因子無(wú)機(jī)鹽水、溶劑第17頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天選擇培養(yǎng)基應(yīng)用加入青霉素加入高濃度食鹽不加氮源不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基加入青霉素等抗生素延伸：分離酵母菌、霉菌等真菌分離金黃色葡萄球菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞第18頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天鑒別培養(yǎng)基:加入伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMS培養(yǎng)基）鑒別大腸桿菌現(xiàn)象：藍(lán)紫色金屬光澤第19頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.培養(yǎng)基要滿足微生物對(duì)環(huán)境條件的需求

：真菌微酸性（5.0-6.0）細(xì)菌中性（6.5-7.5）放線菌微堿性（7.5-8.5）大多數(shù)微生物適宜生長(zhǎng)的溫度在25-40℃之間厭氧菌需提供無(wú)氧條件pH：溫度：氧氣：第20頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.滅菌：

使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。三.無(wú)菌技術(shù)：

泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，防止外來(lái)雜菌的污染的方法第21頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天灼燒滅菌干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋第22頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

2、消毒

使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。煮沸消毒法：100℃5-6min巴氏消毒法：70-75℃30min或80℃15min化學(xué)藥劑消毒法：酒精、氯氣紫外線消毒：實(shí)驗(yàn)前30min超凈臺(tái)第23頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑（70%酒精等）紫外線針對(duì)不耐高溫的液體接種室、超凈工作臺(tái)能耐高溫的，需要保持干燥的物品灼燒法干熱滅菌高壓蒸汽滅菌接種工具（接種環(huán)等）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手培養(yǎng)皿等玻璃器皿培養(yǎng)基消毒方法滅菌方法實(shí)驗(yàn)操作者的衣服第24頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天單個(gè)或少數(shù)菌體2.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。3.功能：1.定義：四、菌落鑒定菌種的重要依據(jù)固體培養(yǎng)基上大量繁殖子細(xì)胞群體第25頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、微生物的分離和純培養(yǎng)分散成單個(gè)細(xì)胞,形成單個(gè)菌落1、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（大腸桿菌分離和純培養(yǎng)）計(jì)算、稱量（配制固體培養(yǎng)基要加入瓊脂）溶化調(diào)pH(注意：滅菌前調(diào)PH)分裝、包扎滅菌（高壓蒸汽滅菌）倒平板第26頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天倒平板技術(shù)1234使瓶口迅速通過(guò)火焰在火焰旁打開(kāi)錐形瓶打開(kāi)一條稍大于瓶口的縫隙，向培養(yǎng)皿中倒入約10-20ml倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋。等待平板冷卻凝固后倒置第27頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？

可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。問(wèn)題討論第28頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？

通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第29頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。第30頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

4.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。第31頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、接種⑴平板劃線法交叉劃線法連續(xù)劃線法第32頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_______2、在_______旁冷卻接種環(huán)，并打開(kāi)棉塞3、將試管口通過(guò)火焰4、將已______的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液6、左手將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。5、將試管通過(guò)火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五7、灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開(kāi)始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。末端燒紅8、將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置第33頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天問(wèn)題討論

為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物。殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時(shí)，菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第34頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天6支試管，分別加入9ml無(wú)菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法a.梯度稀釋菌液：菌液第35頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天b.涂布平板：滴灼試涂取0.1ml菌懸液微量移液器第36頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天Pourplate(3)稀釋混合平板法（課本P14)第37頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基，放入37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)12h-24h,直到長(zhǎng)出菌落為止。3、培養(yǎng)第38頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察第39頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、菌株的保存方法（1）臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保存。（2）長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法擱置斜面第40頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、微生物數(shù)量的計(jì)算直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法第41頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）直接計(jì)數(shù)法

——顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

將待測(cè)樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)計(jì)算出體積內(nèi)的微生物總數(shù)。一般適用于純培養(yǎng)液懸浮液中單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：直觀、快速、操作簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)，結(jié)果往往偏高不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察第42頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、血球計(jì)數(shù)板

計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚玻璃片，玻片上有四個(gè)槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)，中央平臺(tái)又由一短槽隔成兩半，其上各刻有一小方格網(wǎng)。

每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大格，中央的一大格作為計(jì)數(shù)用，稱為計(jì)數(shù)室。第43頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天****#####血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室有兩種刻度1大格=16中格25×16=400小格1大格=25中格16×25=400小格第44頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

計(jì)數(shù)室邊長(zhǎng)為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為l×1＝1mm2，蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室高度為0.1mm，所以一個(gè)計(jì)數(shù)室的體積為l×0.1＝0.1mm3。(注意：1ml＝1000mm3)計(jì)數(shù)室容積第45頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、稀釋用無(wú)菌生理鹽水將待測(cè)菌稀釋成適當(dāng)濃度的菌懸液。2、鏡檢計(jì)數(shù)室加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢，若有污物，則用自來(lái)水沖洗，95%乙醇棉球輕輕擦洗，然后用吸水紙吸干或電吹風(fēng)吹干。3、加樣取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，蓋上蓋玻片。將菌懸液搖勻，用無(wú)菌滴管吸取少許，沿蓋玻片邊緣滴入一小滴，讓菌液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，靜置5min。注：取樣時(shí)先要搖勻菌液，加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生2、操作步驟第46頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、顯微鏡計(jì)數(shù)（以16小格×25中格的規(guī)格為例）在高倍下(40X)計(jì)數(shù)對(duì)兩個(gè)計(jì)數(shù)室記數(shù)，方法：每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(4個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上25即為大方格中的總菌數(shù)，最后換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。注：依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右“的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)不時(shí)調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5—10個(gè)菌體為宜計(jì)數(shù)的結(jié)果是兩個(gè)計(jì)數(shù)室所記菌數(shù)的平均值5、清洗血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)完畢，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后電吹風(fēng)吹干，鏡檢確認(rèn)計(jì)數(shù)區(qū)無(wú)殘留菌體或其它沉淀。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。第47頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、計(jì)數(shù)方法所統(tǒng)計(jì)的中格的總菌數(shù)A，菌液的稀釋倍數(shù)為B，則1ml菌液中：

(1)25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式(2)16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板計(jì)算公式第48頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）間接計(jì)數(shù)法

——稀釋平板計(jì)數(shù)法

將待測(cè)樣品按比例做一系列稀釋后，將其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定稀釋度、一定量的稀釋樣液接種到平板上，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)；或是將一定量的稀釋液，與溶化后冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，搖勻、靜置待凝。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由單個(gè)微生物生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)菌落代表樣品中的一個(gè)微生物個(gè)體。統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基中的出現(xiàn)的菌落，即可推算出樣品中的活菌數(shù)。第49頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天能檢測(cè)活菌數(shù)和雜菌數(shù)時(shí)間長(zhǎng)，繁瑣，測(cè)定值時(shí)常受各種因素影響由于待測(cè)樣品往往不宜完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長(zhǎng)成一個(gè)單菌落也可能來(lái)自樣品中的2-3或更多個(gè)細(xì)胞。因此，平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低優(yōu)缺點(diǎn)：第50頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天編號(hào)稀釋菌樣吸取菌樣傾注平板恒溫培養(yǎng)計(jì)數(shù)1、操作步驟第51頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天104105106原樣10110210310