實驗三蛋白質的等電點測定和沉淀反應

關于實驗三蛋白質的等電點測定和沉淀反應實驗目的

1、了解蛋白質的兩性解離性質。

2、學習測定蛋白質等電點的一種方法。

3、加深對蛋白質膠體溶液穩(wěn)定因素的認識。

4、了解沉淀蛋白質的幾種方法及其實用意義。

5、了解蛋白質變性與沉淀的關系。第2頁,共15頁，2024年2月25日，星期天實驗原理（一）蛋白質是兩性電解質。在蛋白質溶液中存在下列平衡：電場中移向陰極不移動移向陽極第3頁,共15頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的等電點:蛋白質分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當溶液的pH達到一定數(shù)值時，蛋白質顆粒上正負電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質的等電點。不同蛋白質各有特異的等電點。在等電點時，蛋白質的理化性質都有變化，可利用此種性質的變化測定各種蛋白質的等電點。最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值。第4頁,共15頁，2024年2月25日，星期天

本實驗通過觀察不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點。

第5頁,共15頁，2024年2月25日，星期天（二）蛋白質的沉淀

在水溶液中的蛋白質分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋?。蛋白質的沉淀反應可分為兩類。（1）可逆的沉淀反應此時蛋白質分子的結構尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質的沉淀仍能溶解于原來溶劑中，并保持其天然性質而不變性。第6頁,共15頁，2024年2月25日，星期天

（2）不可逆沉淀反應此時蛋白質分子內部結構發(fā)生重大改變，蛋白質常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質沉淀與凝固。蛋白質與重金屬離子或某些有機酸的反應都屬于此類。蛋白質變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質也未必都已變性。

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操作步驟（一）酪蛋白等電點的測定

1取同樣規(guī)格的試管4支，按下表順序分別精確地加入各試劑，然后混勻;2向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL，加一管，搖勻一管。此時1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.5、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁的一管pH即為酪蛋白的等電點。

第8頁,共15頁，2024年2月25日，星期天管號

蒸餾水（mL）

0.01mol/L醋酸(mL）0.1mol/L醋酸(mL)

1.0mol/L醋酸(mL)18.40.628.70.338.01.047.41.6第9頁,共15頁，2024年2月25日，星期天（二）蛋白質的鹽析

無機鹽(硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等)的濃溶液能析出蛋白質。鹽的濃度不同，析出的蛋白質也不同。如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。由鹽析獲得的蛋白質沉淀，當降低其鹽類濃度時，又能再溶解，故蛋白質的鹽析作用是可逆過程。第10頁,共15頁，2024年2月25日，星期天

加蛋白質溶液5mL于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管內容物過濾，向濾液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止。此時析出沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。第11頁,共15頁，2024年2月25日，星期天（三）重金屬離子沉淀蛋白質重金屬離子與蛋白質結合成不溶于水的復合物。取1支試管，加入蛋白質溶液2mL，再加3%硝酸銀溶液1—2滴，振蕩試管，有沉淀產生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？

第12頁,共15頁，2024年2月25日，星期天（四）某些有機酸沉淀蛋白質取1支試管，加入蛋白質溶液2mL，再加入1ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻傾出清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。

第13頁,共15頁，2024年2月25日，星期天（五）有機溶劑沉淀蛋白質取1支試管，加入2mL蛋白質溶液,再加入2mL9