微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

關(guān)于微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用第2頁,共44頁，2024年2月25日，星期天一、微生物的實驗室培養(yǎng)（一）培養(yǎng)基

人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)稱培養(yǎng)基

一般的培養(yǎng)基均需要碳源、氮源、無機鹽和水等（具體見教材15頁“100mL牛肉蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成”）。培養(yǎng)基的基本成分第3頁,共44頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的種類（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等。（2）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。第4頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（二）無菌技術(shù)

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法技術(shù)。

獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵，無菌技術(shù)就是防止雜菌污染的操作技術(shù)。第5頁,共44頁，2024年2月25日，星期天消毒無菌技術(shù)的種類滅菌使用較為溫和的方法（酒精、紫外線）來殺死部分對人體有害的微生物。

對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔消毒；將培養(yǎng)皿、接種用具進(jìn)行滅菌；接種的過程要在酒精燈附近進(jìn)行。使用較為強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。第6頁,共44頁，2024年2月25日，星期天1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒的方法：第7頁,共44頁，2024年2月25日，星期天1.灼燒滅菌：接種用具和接種過程中的試管口或瓶口放在酒精燈火焰的充分燃燒層中進(jìn)行灼燒滅菌（如教材16頁圖2-2所示）。（2）常用的滅菌方法2.干熱滅菌：將玻璃器皿、金屬用具等能耐高溫并需要保持干燥的物品放到干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170OC中加熱1～2h即可。3.高壓蒸汽滅菌：將需滅菌的物品放到盛有水的高壓滅菌鍋內(nèi)（見教材16頁圖2-4）煮沸，待冷空氣排盡后，密閉繼續(xù)加熱至鍋內(nèi)壓力到100kPa，溫度到121OC后，維持15～30min即可。第8頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

二、實驗操作（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方物質(zhì)牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂水重量5g10g5g20g定容至1000mL2.稱量

按比例稱取各種物質(zhì)，注意事項：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。第9頁,共44頁，2024年2月25日，星期天3.溶化：先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加蒸餾水定溶至100mL。4.滅菌(先調(diào)PH)將配制好的培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮紙），放到高壓鍋內(nèi)滅菌；培養(yǎng)皿（用幾層報紙包好）放入干熱滅菌箱內(nèi)滅菌。5.倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50OC左右時倒平板（如教材17圖示）。第10頁,共44頁，2024年2月25日，星期天倒平板操作的討論1.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50OC時倒平板。用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時即可開始倒平板。

通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第11頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。第12頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（二）純化大腸桿菌

微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。1.平板劃線法

通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面（操作如教材18頁圖示）。在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體稱菌落。第13頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。

1、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)？第14頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。第15頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.稀釋涂布平板法

將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。稀釋涂布平板法操作過程分兩個步驟，即系列稀釋操作和涂布平板操作。第16頁,共44頁，2024年2月25日，星期天系列稀釋操作101102103104105106(1)將分別盛有9mL水的試管滅菌并編號。(2)用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。(3)從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入第三支試管中，重復(fù)步驟2，直至到第六支試管。第17頁,共44頁，2024年2月25日，星期天涂布平板操作(1)將涂布器浸在盛有70％的酒精的燒杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表面。(3)將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷卻8～10s。(4)用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。第18頁,共44頁，2024年2月25日，星期天涂布平板操作討論

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。第19頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

三、結(jié)果分析與評價

1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？

2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似？

未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。第20頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

3.培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實驗結(jié)果相同嗎？如果不同，請分析產(chǎn)生差異的原因？

4.如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請分析其可能的原因。

培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同。隨著時間的延長、菌落的不斷生長，使菌落不斷增大。

無菌操作未達(dá)到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時發(fā)生了污染；也可能是在培養(yǎng)的過程中受到了污染。第21頁,共44頁，2024年2月25日，星期天四、課題延伸—菌種的保存

1.試管低溫臨時保存

將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔3～6個月要重新接種培養(yǎng)后再保存）。

2.甘油管長期保存

在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高壓滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的冷凍箱中保存。第22頁,共44頁，2024年2月25日，星期天土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)（一）篩選菌株原理

人為提供有利于目的菌株的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。第23頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

1.在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是是什么物質(zhì)？

碳源是葡萄糖，氮源是尿素。

2.分析該配方的培養(yǎng)基對微生物是否具有篩選作用？如果有，又是如何進(jìn)行篩選的？能分解尿素的細(xì)菌的篩選

有篩選作用，它的氮源只含有尿素，只有能合成分解尿素的脲酶的細(xì)菌才能生長。第24頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目原理

運用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中的活菌數(shù)。統(tǒng)計菌落數(shù)目的理論依據(jù)是：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)。顯微鏡直接計數(shù)濾膜法第25頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（三）設(shè)置對照

A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或培養(yǎng)基混有其它氮源。究竟是哪個原因，可以通過實驗來證明。實驗方案有兩種。一種方案是可以接種其它菌種，看是否有菌落的出現(xiàn)，驗證培養(yǎng)基是否混有其它氮源。另一種方案是將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。所以，在實驗中一般都應(yīng)設(shè)置對照組，使實驗更有說服力。

閱讀教材22～23頁“（三）設(shè)置對照”一段，并討論教材中提出的問題。第26頁,共44頁，2024年2月25日，星期天1.實驗名稱土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計數(shù)2.實驗?zāi)康模裕?.材料用具（略）4.操作步驟

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去（鏟已經(jīng)過消毒處理）表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先滅菌過的信封中。（1）土壤取樣一、實驗設(shè)計

第27頁,共44頁，2024年2月25日，星期天將菌液稀釋（見教材23頁“樣品稀釋流程示意圖”）。稀釋倍數(shù)為101～106。每個稀釋度均用3個選擇培養(yǎng)基。（2）樣品稀釋涂布

第28頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（3）微生物的培養(yǎng)與觀察

將涂布好的培養(yǎng)皿放在30℃溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延長，會有不同的菌落產(chǎn)生，做好記錄。第29頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（4）細(xì)菌的計數(shù)

選取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)。在同一稀釋度下，至少對3個平板進(jìn)行重復(fù)計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。第30頁,共44頁，2024年2月25日，星期天二、結(jié)果分析與評價

1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。第31頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.樣品的稀釋操作是否成功

如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)。3.重復(fù)組的結(jié)果是否一致

如果各位同學(xué)選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，則需要從各項操作過程中去分析、尋找可能的原因。第32頁,共44頁，2024年2月25日，星期天三、課題延伸

能分解尿素的細(xì)菌的鑒定鑒定的原理：細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨，會使培養(yǎng)基的pH升高。鑒定方法：在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，利用此培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。第33頁,共44頁，2024年2月25日，星期天分解纖維素的微生物的分離（一）纖維素與纖維素酶纖維素：一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，廣泛地存在于植物的根、莖、葉等器官中。纖維素酶：由微生物分泌的一種復(fù)合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它們的協(xié)同作用，最終將纖維素分解成葡萄糖。纖維素C1酶Cx酶纖維二糖葡萄糖苷酶葡萄糖第34頁,共44頁，2024年2月25日，星期天剛果紅染色法

剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。（二）纖維素分解菌的篩選

用加入剛果紅的纖維素培養(yǎng)基去培養(yǎng)微生物時，如果培養(yǎng)基中出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈時，可說明該菌落是纖維素分解菌，因為它已將被剛果紅染成紅色的纖維素分解了。第35頁,共44頁，2024年2月25日，星期天一、實驗設(shè)計

請你根據(jù)實驗流程圖和提供的三個資料以及“操作提示”，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計出一個詳細(xì)的實驗方案。土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋

將樣品涂布在鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上

篩選產(chǎn)生透明圈的菌落第36頁,共44頁，2024年2月25日，星期天土壤中纖維素分解菌的分離

1.土樣采集

：土樣采集的方法與本專題課題2類似。土樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因為在纖維素含量豐富的環(huán)境，通常會聚集較多的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，過一個月左右也會有能分解纖維素的微生物生長。二、實驗案例第37頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

2.選擇培養(yǎng)

：選擇培養(yǎng)的操作：稱取土樣20g，在無菌條件下加入裝有30mL培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30℃下振蕩培養(yǎng)1～2d，至培養(yǎng)基變混濁，重復(fù)上述方法再培養(yǎng)一次，然后再進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板。目的：增加纖維素分解菌的濃度？第38頁,共44頁，2024年2月25日，星期天閱讀與思考閱讀教材28～29頁“資料一”～“資料三”，并思考相關(guān)問題。問題一：是液體培養(yǎng)基，因為沒有添加瓊脂。問題二：具有篩選作用，因為培養(yǎng)