輸入性蠓類(lèi)蟲(chóng)媒病毒檢測(cè)規(guī)程

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)輸入性矇類(lèi)蟲(chóng)媒病毒檢測(cè)規(guī)程Detectingcodesforimported2005-02-17發(fā)布輸入性蝶類(lèi)蟲(chóng)媒病毒檢測(cè)規(guī)程7檢驗(yàn)程序7.1病毒分離7.1.1標(biāo)本處理標(biāo)本處理參見(jiàn)第A.1章。7.1.2分離方法7.1.2.1動(dòng)物分離法選用3d~5d齡乳小白取分離病毒，進(jìn)行動(dòng)物病變觀察和病毒傳代。接種方法和病變觀察參見(jiàn)A.2,1。7.1.2.2組織培養(yǎng)分離法選擇合適的敏感細(xì)胞，如Vero,BHK-21或C6/36細(xì)胞分離病毒，接種方法和病變觀察參見(jiàn)A.2.2。7.2病毒的鑒定7.2.1鑒定原則7.2.1.1確定分離到病毒，通過(guò)理化與生物學(xué)特性試驗(yàn)，確定DNA或RNA病毒，有包膜或無(wú)包膜。7.2.1.2選擇血清學(xué)試驗(yàn)確定病毒的科，屬或組。7.2.1.3采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等分子生物學(xué)方法確定病毒種類(lèi)。7.2.2理化與生物學(xué)特性試驗(yàn)7.2.2.1濾過(guò)試驗(yàn)參見(jiàn)B.1.1。7.2.2.2病毒核酸型試驗(yàn)參見(jiàn)B.1.2。7.2.2.3酸敏感實(shí)驗(yàn)參見(jiàn)B.1.3。7.2.2.4乙醚敏感試驗(yàn)參見(jiàn)B.1.4。7.2.2.5細(xì)胞和乳小白鼠病變觀察參見(jiàn)A.2.1、A.2.2。7.2.2.6血凝特性參見(jiàn)B.2.1。7.2.2.7空斑試驗(yàn)參見(jiàn)B.2.2。7.2.3血清學(xué)試驗(yàn)7.2.3.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)參見(jiàn)C.1。7.2.3.2免疫熒光試驗(yàn)(IFT)參見(jiàn)C.2。7.2.3.3血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HAI)參見(jiàn)C.3。7.2.4分子生物學(xué)試驗(yàn)采用道轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)鑒定病毒主要包括以下步驟：—cDNA合成；——PCR擴(kuò)增目的基因；——PCR產(chǎn)物回收與純化；——PCR產(chǎn)物連接與轉(zhuǎn)化；——甘油菌制備與序列測(cè)定；—用BLAST—序列相似性搜索工具對(duì)測(cè)得的病毒核酸序列進(jìn)行比對(duì)鑒定病毒。所需試劑及詳細(xì)操作參見(jiàn)附錄D。7.3結(jié)果報(bào)告原則7.3.1根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，作出相應(yīng)的報(bào)告，注明檢驗(yàn)方法。7.3.2聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果，應(yīng)注明病毒核酸序列。(資料性附錄)病毒分離技術(shù)A.1標(biāo)本的處理從液氮罐或-80℃低溫冰箱中取出凍存管，將蝶類(lèi)標(biāo)本迅速例入研磨器內(nèi)，用滅菌生理鹽水清洗3次~5次，加入1mLEagle液(含1000IU/mL青霉素，1000IU/ml.鏈霉索)用力研磨成勻漿，4℃作用4h,12000r/min~15000r/min離心15min,用0.22μm的濾器濾過(guò)上清液，濾過(guò)液直接接種細(xì)胞或乳小白鼠。A.2病毒的分離A.2.1動(dòng)物分離法A.2.1.1接種方法和劑量一般采用顱內(nèi)和腹腔聯(lián)合接種。取3d齡乳小白鼠(6g~8g),用左手固定乳鼠，在眼和耳之間用碘酒、酒精消毒，右手持吸取標(biāo)本懸液的0.25mL注射器在消毒部位刺入，至硬膜下，每只乳鼠接種0.02mL;消毒腹部，腹腔接種0.03mL,每份標(biāo)本接種5只～6只乳鼠。設(shè)乳鼠對(duì)照2只，同法同劑量注射稻釋液。A.2.1.2病變觀察每天觀察2次～3次，連續(xù)觀察2周～3周。不同的蟲(chóng)媒病毒引起乳小白鼠發(fā)病的時(shí)間不同，凡接種后24h內(nèi)死亡的乳鼠均棄之，視為非特異性死亡。乳鼠發(fā)病可表現(xiàn)為離乳、離群、豎毛、肢體軟弱、麻痹、頸項(xiàng)強(qiáng)直等癥狀。對(duì)照乳鼠應(yīng)正常。接種乳鼠7d～14d無(wú)一發(fā)病時(shí)，則取出兩只，解剖取限腦組織，制成標(biāo)本盲傳一代，觀察兩周仍未發(fā)病，按未分離出病毒報(bào)告。A.2.1.3傳代與收集毒種當(dāng)發(fā)病乳鼠瀕死時(shí)處死，解剖，取其腦、肝、脾、肺，腎等臟器，按第A.1章處理后，再接種乳鼠，待其發(fā)病規(guī)律穩(wěn)定時(shí)收集毒種，保存并整定。A.2.2組織培養(yǎng)分離法A.2.2.1敏感細(xì)胞選用對(duì)多數(shù)蟲(chóng)媒病毒敏感的Vero細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞或C6/36細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒。A.2.2.2接種方法將處理好的標(biāo)本研磨濾過(guò)液接種于長(zhǎng)成單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)管，每份標(biāo)本接種4只細(xì)胞管，每管接種0.1mL~0.2mL。同時(shí)設(shè)不接種標(biāo)本對(duì)照2管。置37℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中吸附1h,加0.8ml～0.9mL的維持液，置37℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d~10d。A.2.2.4病變觀察每天觀察一次，常見(jiàn)的細(xì)胞病變有圓縮、融合、局灶性小顆粒狀破壞等。韶胞對(duì)照管應(yīng)正常。A.2.2.5傳代與保存顯微鏡下觀察到細(xì)胞病變時(shí)收獲，未出現(xiàn)病變的繼續(xù)觀察。不同的蟲(chóng)媒病毒，引起細(xì)胞病變的時(shí)間不同，對(duì)能在組織培養(yǎng)中增殖，不引起明顯細(xì)胞病變的病毒，若接種24h如出現(xiàn)類(lèi)似細(xì)胞病變的現(xiàn)象應(yīng)視為非特異變化。將有細(xì)胞病變的培養(yǎng)管反復(fù)凍融三次，4℃,12000r/min離心15min后，取上清液，-20℃保存。按照上述方法在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)傳代三次，保存有細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)管并鑒定，5(資料性附錄)病毒的理化和生物學(xué)特性試驗(yàn)B.1理化特性試驗(yàn)動(dòng)物或組織培養(yǎng)物通過(guò)G5級(jí)細(xì)菌濾器或0.22pm微孔濾膜過(guò)濾，濾過(guò)液在細(xì)菌培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)且仍能保持繁殖力和致病力，可認(rèn)為已分離到病毒。B.1.2病毒核酸型試驗(yàn)B.1.2.1用維持液10倍系列稀釋待測(cè)病毒。B.1.2.2將病毒懸液接種到細(xì)胞管或細(xì)胞板上解育。B.1.2.3將含5-碘脫氧尿苷(5-IUDR)的培養(yǎng)液(5-IUDR:將17mg5-IUD溶解在10mL去離子水中，加維持液至100mL,使用前用生長(zhǎng)液1110稀釋)加入試驗(yàn)組，正常培養(yǎng)液加入對(duì)照組。B.1.2.4解育，讀取結(jié)果并計(jì)算滴度。如系DNA型病毒，病毒的繁殖明顯受到抑制；RNA病毒則不受影響。B.1.3酸敏感試驗(yàn)B.1.3.1將1mL病毒懸液用0.1mol/L鹽酸調(diào)pH至3.0,37℃作用2h。B.1.3.2用5.6%碳酸氫鈉(NaHCO?)調(diào)pH7.2左右。B.1.3.3取1mL病毒不加酸，調(diào)pH同B.1.B.1.3.4將試驗(yàn)組與對(duì)照組同時(shí)滴定，對(duì)酸敏感病毒經(jīng)此處理抑制滴度大于2對(duì)數(shù)以上。B.1.4乙醚敏感試驗(yàn)B.1.4.1將15mL.乙醚加入0.5mL.待測(cè)病毒懸液中(使用玻璃試管),用力搖勻。B.1.4.2將試管20℃豎立置放1h~2h,并間歌搖動(dòng)，或4℃豎立置放18h～24h。B.1.4.3將混合物放玻璃平皿中，使溶劑揮發(fā)。B.1.4.4分別配置乙醚處理和未處理過(guò)的病毒10倍系列稀釋液。B.1.4.5分別滴定兩組病毒懸液，對(duì)比其感染滴毒。并設(shè)已知的對(duì)乙醚敏感病毒和不敏感病毒對(duì)照。B.2生物學(xué)特性試驗(yàn)B.2.1血凝特性及pH范圍許多蟲(chóng)媒病毒的外膜上有血凝素突起，有凝集哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)紅細(xì)胞的作用，不同的蟲(chóng)媒病毒對(duì)哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)紅細(xì)胞有選擇性，且其血凝活性需要一定的溫度和pH條件，可以為病毒的初步鑒定提供參考。方法參見(jiàn)附錄C.3。B.2.2空斑試驗(yàn)。B.2.2.1制備細(xì)胞用傳代細(xì)胞Vero,BHK-21或C8/36按常規(guī)胰酶消化法制備細(xì)胞，接種于2.2cm×5.5瓶，5d~6d后長(zhǎng)成致密的單層。B.2.2.2接種病毒吸出細(xì)胞瓶/孔的生長(zhǎng)液，接種10倍系列稻釋的不同稀釋度病毒懸液，每小瓶0.2mL,置37℃5%二氧化碳痹箱內(nèi)吸附1h～2h。每15min輕輕據(jù)動(dòng)一次。B.2.2.3加第一層覆蓋物制得的覆蓋物溫度下降到40℃時(shí)，每小瓶加4mL,待凝固后置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。B.2.2.4加第二層覆蓋物培養(yǎng)3d～4d或更長(zhǎng)的時(shí)間，在第一層覆蓋物上加含中性紅的瓊脂覆蓋物每瓶2mL,每孔PBS沖洗后保存于-20℃?zhèn)溆?。b)冰凍組織切片標(biāo)本；感染蟲(chóng)媒病毒的冰凍組織，在一20℃低溫下切片(厚度約4mm~6mm),直接貼于載玻片上，晾10min～30min,或用電吹風(fēng)機(jī)吹干。經(jīng)冷丙酮固定10min~60min備用。C.2.1.2洗濺(0,01mol/LpH7,4PBS)。C.2.1.3特異性熒光抗體(用于直接法)。使用時(shí)用含0.01%～0.02%的伊文思藍(lán)PBS稀釋至適當(dāng)濃度。C.2.1.4熒光素標(biāo)記的抗抗體。C.2.1.5封片液(50%PBS甘油)。C.2.2主要儀器a)熒光顯微鏡(落射式光源，全自動(dòng)照相裝量)。b)冰凍切片機(jī)。e)低溫冰箱。e)恒溫水溶箱。f)帶圈的潔凈載玻片等。g)微量加樣器：容量5yL~50μL。取制備好的抗原片，室溫干燥。滴加工作濃度的特異性熒光抗體或熒光素標(biāo)記的特異性單克隆抗體，使抗體鋪滿(mǎn)細(xì)胞面。設(shè)立陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照。置37℃溫箱解育30min~60min。PBS液源洗3次，每次5min,室溫干燥。用50%的甘油PBS封片。C.2.3.5結(jié)果判定在陽(yáng)性、陰性對(duì)胝成立的情況下，即陽(yáng)性對(duì)照有熒光反應(yīng)，陰性對(duì)照無(wú)熒光即可判定結(jié)果。待檢抗原標(biāo)本和正常細(xì)胞標(biāo)本與正常血清均無(wú)熒光反應(yīng)，判定陰性。待檢抗原標(biāo)本與特異性熒光抗體有熒光反應(yīng)，正常細(xì)胞標(biāo)本與特異性熒光抗體無(wú)熒光反應(yīng)，判為陽(yáng)性。根據(jù)熒光顆粒多少、亮度強(qiáng)弱可分以下4個(gè)等版：++++:陽(yáng)性細(xì)胞<90%,熒光強(qiáng)而亮，且范國(guó)廣；+++;陽(yáng)性細(xì)胞≤70%,熒光明亮；++;陽(yáng)性細(xì)胞≤50%,熒光較弱，但清晰可見(jiàn)；+;陽(yáng)性細(xì)胞≤25%,為極弱的可疑熒光；C.2.4.2滴加特異性抗體，置濕盒放37℃溫箱30min。設(shè)立陰性、陽(yáng)性標(biāo)本及中間層對(duì)照(即中間層加陰性血清)。C.2.4.3用PBS洗滌3次，吹干。C.2.4.4滴加工作濃度的英光素標(biāo)記的抗抗體，置濕盒37℃溫箱30min~60min。用PBS洗滌3次，吹干。50%PBS洗甘油封片。結(jié)果判定同C.2.3.5。C.3血凝(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HAI)C.3.1.1血凝素(病毒抗原)組織培養(yǎng)中的病毒及其抗原物質(zhì)，經(jīng)凍溶、離心除去沉淀，可用作血凝試驗(yàn)的抗原。(采用鼠腦—蔗糖一丙酮提取法制備)。C.3.1.2pH9.0硼酸緩沖液(BBS),C.3.1.3適宜pH的磷酸鹽緩沖液(PBS)。C.3.1.4紅細(xì)胞懸液根據(jù)不同病毒血凝所需敏感紅細(xì)胞制備懸液，一般將血液保存于阿氏液內(nèi)，使用前用PBS洗3次，用適宜pHPBS制備成0.5%的紅細(xì)胞懸液。C.3.2主要器材a)微量血凝反應(yīng)板96孔、U型。b)微量加樣器(容量5pL~25pL,50～100pL)。c)恒溫培養(yǎng)箱。d)恒溫水浴箱。e)微量震蕩器，C.3.3血凝試驗(yàn)將血凝素用PBS作連續(xù)倍比稀釋?zhuān)肯♂尪攘?5pL.于微量血凝板中。每孔內(nèi)加人25μLPBS與50pL紅細(xì)胞懸液，搖勻，同時(shí)設(shè)立紅細(xì)胞對(duì)照。置所需溫度作用30min~60min。C.3.3.4結(jié)果判定以出現(xiàn)血凝十十的最高稀釋度定為一個(gè)血凝單位(如1:640)。作血凝抑制試險(xiǎn)時(shí)用4個(gè)～8個(gè)血凝單位(即1:160-1:80)。各孔血凝結(jié)果以++++、+++、+++:紅細(xì)胞凝集同上，孔底有大圓；++:紅細(xì)胞于孔底形成一個(gè)中等大的圈，周?chē)?guó)有小凝塊；+:紅細(xì)胞于孔底