進出口量谷中桔青霉、黃綠青霉、島青霉檢驗方法

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準進出口糧谷中桔青霉、黃綠青霉、島青霉檢驗方法InspectionofP.citrinum,P.citreovirideandP.islandicuminfoodstufff2005-02-17發(fā)布中、華人民共。和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局進出口糧谷中桔青霉、黃綠青霉、島青霉檢驗方法153.2.5產(chǎn)毒培養(yǎng)液；見附錄第A.2章。3.2.6產(chǎn)毒檢定培養(yǎng)基；見附錄第A.3章。3.2.7列希爾浮載劑；見附錄第A.4章。3.2.8培養(yǎng)基V;見附錄第A.5章。3.2.9培養(yǎng)基V;見附錄第A.6章。3.2.10標準菌株：桔青霉(PenicilliumcitrivumAS3.690);黃綠青霉(Penicilliumcitreo-virideAS3.226);島青霉(PenicilliamislandicumAS3.4025);巨大芽孢桿菌(BacillusmegateriumAS3.3儀器和設(shè)備3.3.1游標卡尺：測量范圍0mm～200mm,精度0.02mm或使用抑菌圈測量儀測量，3.3.2牛津杯：高10mm±0.1mm,內(nèi)徑6.8mm±0.1mm,外徑8.0mm±0.1mm(浙江海寧醫(yī)療器械廠生產(chǎn)或相當者)。3.3.3恒溫培養(yǎng)箱；28℃±1℃,30℃±1℃,擱板必須保持水平。3.3.4高壓滅菌器。3.3.5培養(yǎng)皿；內(nèi)徑90mm,底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，并應(yīng)配有陶瓦蓋；內(nèi)徑90mm的玻3.3.6載玻片和蓋玻片。3.3.7試管(直徑17mm,長170mm)。3.3.8離心機及帶刻度離心管。3.4.1試樣處理加100mL乙醇溶液，浸泡試樣5min,棄去乙醇溶液；再加入氯化汞(3.2.3)溶液100mL靜置1min,棄去氯化承溶液，最后在無菌條件下用無菌水反復(fù)清洗3次～5次，每次100mL,將水倒掉空凈，3.4.2平板制備于滅菌培養(yǎng)皿中加入20mL熔化的察氏培養(yǎng)基(3.2.4),保持水平，待其凝固備用。3.4.3分離培養(yǎng)每個樣品用10個平板，將處理空干后的大米無菌移植于察氏培養(yǎng)基平板上，每個平板中均勻放置10粒，置于培養(yǎng)箱中28℃±1℃培養(yǎng)，8d開始觀察，直到第8d。如果可疑，可觀察到15d,對照標準菌株，觀察大米樣品污染菌的鑿落形態(tài)(參見附錄B),如無特征菌落出現(xiàn)，可報告陰性結(jié)果；如特征近似可疑，應(yīng)做進一步鏡檢鑒定。3.4.4鏡檢鑒定3.4.4.1轉(zhuǎn)接培養(yǎng)將可疑菌落挑出，轉(zhuǎn)接到察氏培養(yǎng)基(3.2.4)平板中，每個菌落轉(zhuǎn)接網(wǎng)個平板，于28℃±1℃培養(yǎng)。3d開始肉眼觀察菌落形態(tài)，并且直接鏡檢觀察，直至15d,應(yīng)認真記錄鏡檢觀察情況，有條件的應(yīng)做菌落照相，備查。3.4.4.2小室培養(yǎng)對產(chǎn)生小而易碎的分生孢子梗的真菌，可用小室培養(yǎng)法對菌絲和子實體著生狀態(tài)進行觀察。用于小蜜培養(yǎng)(參見附錄C)的平皿上應(yīng)預(yù)先放置一張90mm的濾紙，再放置一只U型玻確棒，在玻璃棒上放一片潔凈的載玻片，連同兩片蓋玻片于121℃高壓滅菌15min,備用。以無菌操作將已熔化的約5mL察氏培養(yǎng)基(3.2.4)傾注到另一空白滅菌平皿中，使之剛剛鋪滿平皿，保持平衡，待其凝固，用手術(shù)刀無菌將瓊脂層切成兩塊蓋玻片大小的方塊，分別輕輕放到載玻片上，用接種針挑取可疑的菌落，接種到這兩塊培養(yǎng)基四周，然后蓋上蓋玻片，于濾紙上滴加3mL滅菌水或甘油，于28℃±1℃培養(yǎng)過夜。從第2天開始觀察，輕輕取出載玻片，對照標準菌株的顯微形態(tài)，在顯微鏡下直接觀察，仔細記錄觀察到的菌落的顯微形態(tài)。一定要觀察菌種的生長全過程，以便確定所檢出的菌種是否為該三種產(chǎn)毒真菌中的一種，必要時還應(yīng)接種標準菌種，與該可疑菌種同步培養(yǎng)，以便進行對比觀察。3.4.5產(chǎn)毒鑒定3.4.5.1菌液的制備將巨大芽孢桿菌(3,2.10)安瓿瓶的上部消毒后敲碎，加入少量培養(yǎng)基V(3.2.8),使其充分溶解并移至盛有培養(yǎng)基V(3,2.8)的試管中混勻，置37℃±1℃培養(yǎng)24h,將培養(yǎng)物劃線接種到培養(yǎng)基V(3.2.9)斜面上，37℃±1℃培養(yǎng)24h,鏡檢，芽孢數(shù)達到85%以上時可制備芽孢混懸液。用滅菌生理鹽水沖洗菌苔并轉(zhuǎn)入滅菌帶刻度離心管中，3000r/min離心30min,棄去上清液，再加同量滅菌生理鹽水，搖勻后65℃水浴30min,1000r/min離心5min,取上清液并轉(zhuǎn)入滅菌試管中，既為芽孢懸液，測定并稀釋濃度至10'/mL,置于4℃冰箱中保存，可使用一周。3.4.5.2產(chǎn)毒培養(yǎng)用滅菌接種針挑取轉(zhuǎn)接平板上符合形態(tài)的培養(yǎng)物，接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)液中(3.2.5),30℃±1℃培養(yǎng)9d~14d,仔細觀察接種培養(yǎng)液的顏色，如果培養(yǎng)液的顏色改變，就有產(chǎn)毒的可能，一般從第9天開始觀察，直到第14d。3.4.5.3產(chǎn)毒培養(yǎng)液的過濾取10mL培養(yǎng)后的產(chǎn)毒培養(yǎng)液用濾紙無菌過濾到帶磨口的三角瓶中，置于4℃冰箱待測。進行過產(chǎn)毒鑒定的培養(yǎng)液不要隨意傾倒，應(yīng)加入一定量的氫氧化鈉或次氯酸鈉，121℃高壓滅菌3.4.5.4用杯碟法測毒將產(chǎn)毒檢定培養(yǎng)基(3.2.6)熔化并冷卻至50℃±1℃,加入適量的巨大芽孢桿菌懸液(10/mL的巨大芽孢桿菌懸液按1%加入),充分混勻，每皿傾注8mL,保持水平，待其凝固后備用。在每個平板中均勻放置4個滅菌的牛津杯，其中三個用于檢測產(chǎn)毒培養(yǎng)液濾液，另一個滴加未接菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)液，作為陰性對照，每個樣品平行做兩套平板，于30℃±1℃培養(yǎng)16h~18h。3.4.5.5結(jié)果報告培養(yǎng)后，將培養(yǎng)皿倒置棄掉牛津杯，如果無清晰的抑菌圖產(chǎn)生，或抑菌圈的直徑小于12mm,應(yīng)將產(chǎn)毒培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)并每天按上述方法測毒直至14d,若結(jié)果同前，便可報告產(chǎn)毒陰性結(jié)果；如果出現(xiàn)清晰的抑菌圈，且抑菌圖直徑大于等于12mm,則報告產(chǎn)毒陽性結(jié)果。(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑A.1察氏培養(yǎng)基磷酸氯二鉀1.0g硝酸鈉3.0F硫酸鎂0.5g硫酸亞鐵0.01除蔗糖外，將其他各成分于水中加熱溶解，最后加人蔗糖，用1mol/L氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調(diào)節(jié)pH,使滅菌后pH為6.8±0.1,分裝于試管或三角瓶內(nèi)，于121℃高壓滅菌15min。A.2產(chǎn)毒培養(yǎng)液硝酸鈉2.08磷酸氫二鉀1.0g硫酸業(yè)鐵0.01F酵母浸膏2g除蔗糖外，將其他各成分于水中加熱溶解，最后加入蔗糖，用1mol/L.氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調(diào)節(jié)pH,使滅菌后pH為5.8±0.1,分裝500ml.于1000mL.三角瓶內(nèi)，于121℃高壓滅菌15min。A.3產(chǎn)毒檢定培養(yǎng)基胰蛋白胨牛肉浸音辭母浸音水將上述各成分于水中加熱溶解，用1mol/L5.8±0.1,分裝500mL于1000mL三角瓶內(nèi)，于121℃高壓滅菌15in。A.4列希爾浮載劑醋酸鉀(2%水溶性)0.5g酒精(無水)1000mL將上述成分充分混合均勻備用(鏡檢透明劑用)。水氫氧化銷溶液或10%鹽酸調(diào)節(jié)pH,使滅菌后pH為7.0±0.1,分裝于試管內(nèi)(10mL/管),于121℃高壓滅菌15min。水gg將上述各成分于水中加熱溶解，用1mol/L氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調(diào)節(jié)pH,使滅菌后pH為(資料性附錄)枯青看樣的顏色生和不對硬以下沒3.0pm~3～8或10梗上.(7.5~12.5)pm形，直輕1.5~3.3pm,表面光滑或近乎光滑。分生孩子鏈成細長的株狀：長60rm~300pm。黃綠青霉~1,5mm淡黃色或白色的達鮮亮的檸橡黃色；呈輕微霉味；培養(yǎng)基呈黃色。偶有延長從較低的節(jié)上生出成2分枝?；?30~μm,生于基部分(6.8~7.4)pm×(1.2~