第16周 第六章 分光光度法

2024/4/21Analyticalchemistry1分光光度法第六章2024/4/21Analyticalchemistry2教學(xué)指導(dǎo)：分光光度法簡介分光光度法基本原理可見分光光度法及其儀器分光光度法應(yīng)用2024/4/21Analyticalchemistry32024/4/21Analyticalchemistry4一、電磁輻射和電磁波譜1．電磁輻射（電磁波，光）：以巨大速度通過空間、不需要任何物質(zhì)作為傳播媒介的一種能量2．電磁輻射的性質(zhì)：具有波、粒二向性波動性：粒子性：光譜分析概論波動性：光以波的形式傳播，可用波長、頻率來表示。光速c=3×1010cm/s粒子性：光由光子組成，具有能量。h為普朗克常數(shù)6.63×10-34J.s2024/4/21Analyticalchemistry5

高能輻射區(qū)γ射線能量最高，來源于核能級躍遷

χ射線來自內(nèi)層電子能級的躍遷光學(xué)光譜區(qū)紫外光來自原子和分子外層電子能級的躍遷可見光紅外光來自分子振動和轉(zhuǎn)動能級的躍遷波譜區(qū)微波來自分子轉(zhuǎn)動能級及電子自旋能級躍遷無線電波來自原子核自旋能級的躍遷3．電磁波譜：電磁輻射按波長順序排列，稱電磁波譜。γ射線→X射線→紫外光→可見光→紅外光→微波→無線電波波長長

波長逐漸增大2024/4/21Analyticalchemistry6二、光譜分析法及其分類1．光譜法：利用物質(zhì)與電磁輻射作用時，物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化能級躍遷而產(chǎn)生的吸收、發(fā)射或散射輻射等電磁輻射的強度隨波長變化的定性、定量分析方法

按能量交換方向分吸收光譜法發(fā)射光譜法按作用結(jié)果不同分原子光譜→線狀光譜分子光譜→帶狀光譜2024/4/21Analyticalchemistry73發(fā)射光譜2吸收光譜例：γ-射線；x-射線；熒光例：原子吸收光譜，分子吸收光譜2024/4/21Analyticalchemistry8分光光度法（AbsorptionPhotometry）：基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立的分析方法。包括比色法、紫外可見分光光度法、紅外分光光度法。廣泛用于無機物和有機物的定性和定量分析。一分光光度法簡介2024/4/21Analyticalchemistry9分光光度法特點：靈敏度高：試樣中1%-0.001%微量成分，可測定的濃度下限為10-5到10-6mol/L

（化學(xué)分析可測定含量>1%的常量成分）準確度較高：相對誤差2%-5%（精密儀器可達1%-2%）。

（化學(xué)分析可達0.1%-0.2%）測量范圍寬:微量1%-10-3%;痕量10-4%-10-5%;常量1%-50%(示差分光光度法)應(yīng)用廣泛:幾乎所有的無機離子有許多有機化合物；操作簡便、快速、儀器價格適中、用途廣。2024/4/21Analyticalchemistry10光譜分區(qū)能量小200nm400nm780nm大波長光譜區(qū)域紫外光區(qū)可見光區(qū)紅外分析方法紫外分光光度法可見分光光度法50um紅外分光光度法紫、藍、青、綠、黃、橙、紅2024/4/21Analyticalchemistry11物質(zhì)對光的吸收1、物質(zhì)對光選擇性吸收的實質(zhì)一束光通過某物質(zhì)時，該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生碰撞，光子的能量轉(zhuǎn)移至分子、原子或離子上，使這些粒子發(fā)生能級變化，由基態(tài)躍遷至較高能態(tài)，這個過程即為吸收。光是否被物質(zhì)吸收，取決于光子的能量物質(zhì)的結(jié)構(gòu)只有當(dāng)能級差△E與光子能量h

相當(dāng)時物質(zhì)吸收光。2024/4/21Analyticalchemistry122、物質(zhì)的顏色與光吸收的關(guān)系復(fù)合光與單色光單色光：具有單一波長的光。復(fù)合光：由不同波長的單色光按一定比例組成的光如白光。2024/4/21Analyticalchemistry13溶液顏色與光吸收的關(guān)系溶液對光的吸收：若溶液透明、均勻，人眼看到的溶液顏色是由透射光的波長決定的。當(dāng)入射光為白光（復(fù)合光），溶液吸收的光與透射的光互補?；パa色：組成白光的兩種光。光的互補：藍

黃2024/4/21Analyticalchemistry14互補色示意圖

藍450-480

紫400-450

紅650-750青藍480-490

青490-500

綠500-580

黃580-600

橙600-650白光KMnO4溶液吸收綠色的光，透過紫紅的光，所以溶液呈現(xiàn)紫紅色2024/4/21Analyticalchemistry152024/4/21Analyticalchemistry16溶液對光的作用示意圖2024/4/21Analyticalchemistry17溶液顏色與吸收光顏色和波段的關(guān)系溶液的顏色

吸收光顏色波段（nm）黃綠黃橙紅紫紅紫藍青藍青紫藍青藍青綠黃綠黃橙紅400~450450~480480~490490~500500~560560~580580~600600~650650~760KMnO4溶液吸收綠色的光，透過紫紅的光，所以溶液呈現(xiàn)紫紅色，λmax＝525nm2024/4/21Analyticalchemistry183、吸收曲線（吸收光譜）吸收曲線：吸光度隨波長變化的曲線。吸收曲線的特點：不同的物質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)不同而具有不同的吸收曲線，定性分析的依據(jù)。同一物質(zhì)，濃度不同，其吸收曲線的形狀和λmax的位置不變，但在同一波長下吸光度隨濃度的增大而增大。吸收曲線是吸光度法選擇測量波長的依據(jù)。2024/4/21Analyticalchemistry19吸光度A吸收曲線圖4005006000.1000.2000.3000.400吸收曲線：吸光度隨波長變化的曲線。λ/nmA2024/4/21Analyticalchemistry20不同的物質(zhì)因其分析結(jié)構(gòu)不同而具有不同的吸收曲線；2024/4/21Analyticalchemistry21300400500600λ/nmCr2O72-380nm525nmMnO4-高錳酸鉀和重鉻酸鉀的吸收曲線A2024/4/21Analyticalchemistry222024/4/21Analyticalchemistry23KMnO4溶液λmax＝525nm同一物質(zhì)，濃度不同，其吸收曲線的形狀和λmax的位置不變，但在同一波長下吸光度隨濃度的增大而增大。通常選最大吸收波長的單色光進行定量分析。2024/4/21Analyticalchemistry24比色分析法Colorimetric基本原理：在一定濃度范圍內(nèi)，溶液中有色物質(zhì)的濃度與溶液顏色的深度成正比，根據(jù)溶液顏色深度，測定溶液中有色物質(zhì)含量的方法。2024/4/21Analyticalchemistry25

1.朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系。A∝c

二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律。二分光光度法基本原理(動畫M1-2-4.swf)(動畫M1-2-5.swf)2024/4/21Analyticalchemistry26朗伯—比耳定律

吸光度A：表征物質(zhì)對光吸收程度的量。

A=lgI0/I=-lgT=bcA--吸光度

--摩爾吸光系數(shù)c--被測物濃度b--液層厚度（光程長度）T--透過率T=I/I0

I0--入射光強

I--透射光強摩爾吸光系數(shù)ε（L.mol-1.cm-1）

：在一定λ下，c=1mol/L，b=1cm時的吸光度2024/4/21Analyticalchemistry27例：用1,10-二氮菲光度法測定鐵，已知Fe2+濃度為0.5mg/L，比色皿厚度2厘米，在

=508nm測得配合物吸光度A=0.19，求

。（1.1×104L.mol-1.cm-1

）A=lgI0/I=-lgT=bc朗伯—比耳定律的物理意義：當(dāng)一束平行的單色光，通過稀的、均勻的吸光物質(zhì)溶液時，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)的濃度以及光徑長度的乘積成正比。這是分光光度法定量測定的依據(jù)。課本p186習(xí)題4（2）、（5）2024/4/21Analyticalchemistry28朗伯—比耳定律適用條件：入射光為平行單色光，且垂直照射；吸光物質(zhì)為均勻非散射體系；稀溶液，吸光質(zhì)點之間無相互作用；輻射與物質(zhì)之間的作用僅限于光吸收過程，無熒光和光化學(xué)現(xiàn)象；吸光度具有加和性（A總=A1+A2+…）。2024/4/21Analyticalchemistry292、標準（工作）曲線

標準（工作）曲線繪制方法：在

、b固定的情況下，測定一系列不同濃度的標準溶液的吸光度，作A~c圖，在相同條件下測定樣品溶液的吸光度，從曲線上可查出被測樣品的濃度。2024/4/21Analyticalchemistry30工作曲線圖濃度（c）吸光度直線斜率為分光光度法靈敏度

越大，方法的靈敏度越高。2024/4/21Analyticalchemistry31濃度c正偏離負偏離吸光度工作偏離圖依據(jù)Beer定律，A與C關(guān)系應(yīng)為經(jīng)過原點的直線2024/4/21Analyticalchemistry32偏離原因：（1）與儀器有關(guān)的因素非單色光引起的偏離：L—B定律要求入射光為單色光，但目前儀器提供的入射光是由波長范圍較窄的光帶組成的復(fù)合光。非平行入射光引起的偏離（2）與測定樣品溶液有關(guān)的因素介質(zhì)不均勻引起的偏離化學(xué)因素引起的偏離：高濃度時引起溶液中吸光粒子之間相互作用上升，使吸光能力發(fā)生變化；化學(xué)反應(yīng)引起的偏離。

2024/4/21Analyticalchemistry33３、分光光度法靈敏度分光光度法靈敏度

由實驗測得。對于不同的吸光物質(zhì)，同一波長下，越大，表示該吸光物質(zhì)對于該波長的光吸收能力越大。用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。摩爾吸光系數(shù)ε（L.mol-1.cm-1）

：在一定λ下，c=1mol/L，b=1cm時的吸光度ε>105：超高靈敏；ε=(6～10）×104

：高靈敏；ε<2×104

：不靈敏。ε僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)?？勺鳛槎ㄐ澡b定的參數(shù)。2024/4/21Analyticalchemistry34三、分光光度法的測量方法１、單一組分的測定（１）目視比色法標準系列法：用一套比色管，配制一系列不同含量的標準色階，從管口垂直向下觀察，比較待測試液與色階中哪個溶液顏色相同，則認為兩者濃度相同，從而確定待測試樣的含量。（２）標準曲線法2024/4/21Analyticalchemistry35在一定條件下，工作曲線是一條直線，直線的斜率和截距可以用最小二乘法求得。工作曲線可以用一元線性方程表示：y=a+bx式中，x為標準溶液的濃度，y為相應(yīng)的吸光度。使用最小二乘法確定的直線稱為回歸線，a、b稱為回歸系數(shù)。b是直線的斜率,a為直線的截距．可以用相關(guān)系數(shù)r來表示線性關(guān)系的好壞。相關(guān)系數(shù)越接近于1線性關(guān)系越好。一般的光度分析方法r>0.999。2024/4/21Analyticalchemistry36示例0.710mg/25mL

蘆丁含量測定2024/4/21Analyticalchemistry37三、分光光度法的測量方法2、多組分的測定⑴各組分的吸收曲線互不重疊在各自最大吸收波長處分別進行測定。這本質(zhì)上與單組分測定沒有區(qū)別。⑵各組分的吸收曲線互有重疊，根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。Aλ1=εaλ1bCa

＋εbλ1bCb

Aλ2=εaλ2bCa

＋εbλ2bCb

2024/4/21Analyticalchemistry38三、分光光度法的測量方法3、雙波長分光光度法多組分測定，吸收曲線絕大部分重疊或完全重疊，背景吸收較大或為渾濁樣品時，用雙波長分光光度計測定．采用雙波長技術(shù)，作為參比的是試液本身對某一波長的吸光度，從分析波長信號減去來自參比的波長信號，消除組分干擾，進行準確測定．A=(1-2)bc2024/4/21Analyticalchemistry394、示差分光光度法（示差法）當(dāng)待測組分含量較高時，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法。示差法需要較大的入射光強度，并采用濃度稍低于待測溶液濃度的標準溶液作參比溶液。設(shè)：待測溶液濃度為cx，標準溶液濃度為cs(cs<cx)。則：Ax=εbcx

As=εbcs

A相對=ΔＡ＝Ａx－Ａs=εb(cx

－cs

）=εbΔc示差法測得的吸光度A相對與Δc呈直線關(guān)系。由標準曲線上查得相應(yīng)的Δc值，則待測溶液濃度cx

：

cx=cs+Δc2024/4/21Analyticalchemistry40四可見分光光度計光源吸收池檢測器

單色器數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)儀器結(jié)構(gòu)框圖2024/4/21Analyticalchemistry411、光源基本要求：在儀器工作的波長范圍內(nèi)，提供連續(xù)、有足夠發(fā)射強度和良好穩(wěn)定性的復(fù)合光，而且發(fā)射光的強度隨波長的變化應(yīng)盡可能小。光源：鎢燈或鹵鎢燈——可見光源350~1000nm氫燈或氘燈——紫外光源200~360nm紫外光源---氘燈可見光源---鎢燈2024/4/21Analyticalchemistry422、單色器單色器作用：從光源發(fā)出的復(fù)合光中分出所需要的單色光。單色器組成：由入射狹縫、準光器（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等組成。單色器的核心部分是色散元件（如玻璃棱鏡和光柵），起分光的作用。玻璃棱鏡——適用于可見光區(qū)石英棱鏡——適用于紫外光區(qū)2024/4/21Analyticalchemistry43

吸收池用于盛放分析試樣；

吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向；

吸收池要配對。因為吸收池材料本身吸光特征以及吸收池的光程長度的精度等對分析結(jié)果都有影響。3、吸收池玻璃吸收池——僅適用于可見光區(qū)石英吸收池——適用于紫外和可見光區(qū)2024/4/21Analyticalchemistry44

檢測器的功能：檢測信號、測量單色光透過溶液后光強度變化。

常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管等。

4、檢測器氧化銫光電管——適用于可見光區(qū)(625-1000nm)銻銫光電管——適用于紫外光區(qū)(200-625nm)

信號顯示器2024/4/21Analyticalchemistry45型號

價格（萬元）波長nm分光器件數(shù)據(jù)處理指示產(chǎn)地7210.18360~800棱鏡表頭上海三分7220.28330~800光柵微機數(shù)顯上海三分760CRT7.21190~900光柵PC打印掃描顯象管上海三分751G0.91200~1000棱鏡微機打印表頭上海分析GDZ12.3200~800全息凹面光柵微機數(shù)顯北京地質(zhì)WFZ-122-10.7340~600光柵微機數(shù)顯北京地質(zhì)WFJ-80-10.3360~800棱鏡PC打印掃描數(shù)顯北京二分國產(chǎn)常用紫外可見分光光度計2024/4/21Analyticalchemistry46721型分光光度計2024/4/21Analyticalchemistry47722型分光光度計2024/4/21Analyticalchemistry482024/4/21Analyticalchemistry49類型：1．單波長單光束分光光度計：特點：使用時來回拉動吸收池→移動誤差對光源要求高比色池配對721型分光光度計屬此類型2024/4/21Analyticalchemistry50續(xù)前2．單波長雙光束分光光度計：

特點：不用拉動吸收池，可以減小移動誤差對光源要求不高可以自動掃描吸收光譜2024/4/21Analyticalchemistry51續(xù)前3．雙波長雙光束分光光度計特點：利用吸光度差值定量消除干擾和吸收池不匹配引起的誤差2024/4/21Analyticalchemistry522024/4/21Analyticalchemistry53分光光度計的使用

預(yù)熱20min。調(diào)節(jié)T=0。調(diào)節(jié)T=100%（A=0）。測定樣品的吸光度A。2024/4/21Analyticalchemistry54722N型分光光度計使用

(1)先預(yù)熱儀器30分鐘;(2)當(dāng)參比在光路上時，按A/T/C/F鍵至顯示為T,打開樣品池蓋,按0%鍵至000.0。關(guān)上蓋，按100%鍵至顯示為100.0。

(3)再重復(fù)一次。

(4)然后按A/T/C/F鍵至顯示為Abs，放入待測樣品比色皿，就可以讀取吸光度了。2024/4/21Analyticalchemistry55分光光度計的保養(yǎng)與維護安置在干燥、無污染的地方；儀器內(nèi)的防潮硅膠應(yīng)定期更換或再生；儀器停止工作時，必須切斷電源，應(yīng)按開關(guān)機順序關(guān)閉主機和穩(wěn)流穩(wěn)壓電源開關(guān)；比色皿使用完畢后，立即用蒸餾水或有機溶劑沖洗干凈，并用柔軟清潔的紗布把水漬擦凈；儀器經(jīng)過搬動，請及時檢查并糾正波長精度。2024/4/21Analyticalchemistry56１方法誤差（１）顯色反應(yīng)的選擇：顯色反應(yīng)的靈敏度＞104,對比度＞60nm（２）顯色條件的選擇：介質(zhì)的酸度（３）顯色體系對光吸收定律的偏離：使顯色體系滿足單色光、稀溶液、均勻介質(zhì)。２儀器誤差３操作者誤差五分光光度法誤差2024/4/21Analyticalchemistry57１儀器測量條件的選擇２顯色條件的控制３參比溶液的選擇4

干擾及消除方法五提高分析結(jié)果準確度的方法

（分析條件的選擇）2024/4/21Analyticalchemistry58

一般來說，當(dāng)透射比為15%～65%（吸光度0.2～0.8）時，濃度測量的相對誤差較小，這就是適宜的吸光度范圍。１儀器測量條件的選擇

可以通過調(diào)節(jié)待測溶液的濃度，選用適當(dāng)厚度的吸收池等方式使吸光度落在此區(qū)間內(nèi)。

通常選擇最大吸收波長為入射光波長，以增大測量的靈敏度。2024/4/21Analyticalchemistry59

顯色反應(yīng)：用適當(dāng)?shù)脑噭@色劑）與待測離子反應(yīng)生成對紫外或可見光有較大吸收的物質(zhì)，然后再進行測定的反應(yīng)。2顯色條件的控制

顯色反應(yīng)具備的條件：1）顯色的物質(zhì)具有較大的摩爾吸光系數(shù)2)顯色的物質(zhì)要穩(wěn)定、顯色條件易于控制3）顯色的物質(zhì)與顯色劑的最大吸收波長的差別在60nm以上

顯色劑的用量和酸度條件要通過實驗確定。

見課本p174圖7-11和圖7-122024/4/21Analyticalchemistry60

參比溶液（空白溶液）用于調(diào)節(jié)