基因工程原理

基因工程原理基因工程原理第1頁(yè)一．DNA限制酶反應(yīng)

1.酶單位定義:

使1μg某種DNA在最適反應(yīng)條件下和1小時(shí)內(nèi)完全酶切所需限制酶活性。

2.酶切反應(yīng)類型

1)完全酶切SV40(5243bp)pBR322(4363bp)

2)個(gè)別酶切

3.酶切反應(yīng)最適條件

1)DNA分子組成

i.堿基組成與排列方式

ii.識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)堿基組成與排列方式，同一DNA分子中不一樣識(shí)別位點(diǎn)酶切速度可相差10倍（如λ中EcoRI位點(diǎn)）

2)反應(yīng)條件

i.DNA溶液純度和濃度（反應(yīng)濃度）依試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)而定HpaI(CCGG)126ThaI(CGCG)023基因工程原理第2頁(yè)

ii.限制酶純度和穩(wěn)定性

i)純度：盡可能保持廠家推薦反應(yīng)條件

ii)穩(wěn)定性：保留和反應(yīng)

iii.反應(yīng)緩沖液：常見(jiàn)三種關(guān)鍵緩沖液，即高（H），中（M），低（L）鹽緩沖液，不一樣溫度下pH值

iv.反應(yīng)溫度：大多數(shù)為37℃

v.

雙酶切和多酶切反應(yīng)同時(shí)酶切和分別酶切。前者要求兩種酶使用緩沖液和反應(yīng)溫度必須相同，即使相同時(shí)，一旦發(fā)生個(gè)別酶切反應(yīng)，便無(wú)法判斷是何種酶造成，所以最好采取后者--分別酶切。

i)第一個(gè)酶切電泳檢驗(yàn)酚/氯仿純化第二種酶切。可不考慮酶切先后次序，但操作步驟多。

ii)采取低濃度鹽緩沖液限制酶切電泳檢驗(yàn)采取高濃度鹽緩沖液限制酶切。操作簡(jiǎn)單，但要分先后。假如兩酶切位點(diǎn)相距很近（如多克隆位點(diǎn)區(qū)），首先考慮則是相互間酶切是否有影響，兩種酶切次序不一樣時(shí)，其結(jié)果大不相同。

如SmaI-BamH(c),BamHI-SmaI(p)基因工程原理第3頁(yè)二、限制酶圖譜繪制

1.完全酶切作圖法

1）單酶切作圖法一長(zhǎng)度為5Kb線狀DNA分子用兩種限制酶完全酶切凝膠電泳結(jié)果和各位點(diǎn)可能性排列。要確定其位置，可采取下述輔助方法之一。

i.單酶?jìng)€(gè)別酶切：個(gè)別酶切時(shí)，各種可能性均存在，但只有相鄰兩個(gè)DNA片段才有可能出現(xiàn)在凝膠上。基因工程原理第4頁(yè)ii.末端標(biāo)識(shí)完全酶切

DNA片段末端標(biāo)識(shí)完全酶切凝膠電泳EtBr染色觀察放射自顯影

2)

雙酶切作圖法單酶切結(jié)果只能確定一個(gè)酶位點(diǎn)，要將兩種單酶切結(jié)果畫在一張圖上時(shí)則不行基因工程原理第5頁(yè)分別作圖時(shí)，同一個(gè)酶兩種作圖法都是正確，但看成在一張圖上時(shí)，上述兩種可能性中只有一個(gè)是正確，所以必須進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，其結(jié)果見(jiàn)圖依據(jù)上述原理和步驟，前述5Kb片段酶I與酶II定位結(jié)果可用兩種方法之一：

i)單酶切分離DNA片段第二種酶切凝膠電泳

ii)單酶切第二種酶切凝膠電泳*假如要同時(shí)將兩種限制酶定位在一條DNA上時(shí)，單酶完全酶切作圖就沒(méi)必要了。

基因工程原理第6頁(yè)

2.末端標(biāo)識(shí)-個(gè)別酶切作圖法（Smith-Brinstiel法）

DNA片段末端標(biāo)識(shí)酶1切分離帶標(biāo)識(shí)DNA片段酶2個(gè)別酶切電泳EtBr染色攝影放射自顯影結(jié)果單端標(biāo)識(shí)方法:

人工合成單端標(biāo)識(shí)法

限制酶切單端標(biāo)識(shí)法基因工程原理第7頁(yè)單端標(biāo)識(shí)方法1

人工合成單端標(biāo)識(shí)法基因工程原理第8頁(yè)單端標(biāo)識(shí)方法2

限制酶切單端標(biāo)識(shí)法基因工程原理第9頁(yè)

3.末端標(biāo)識(shí)雙相作圖法方法2仍存在兩個(gè)不足之處：①酶1選擇不能靠近DNA中央；②需先分離DNA片段，該法可克服上述缺點(diǎn)。現(xiàn)假設(shè)有一片段長(zhǎng)10Kb，其中RE1有三個(gè)切點(diǎn)，RE2有一個(gè)切點(diǎn)，其圖譜可能是:基因工程原理第10頁(yè)4.Bal31次序酶解作圖法

DNA片段Bal31處理不一樣時(shí)間取樣終止反應(yīng)限制酶切凝膠電泳染色觀察結(jié)果5.切口移位作圖法(可檢測(cè)出100bp片段)

雙鏈DNA切口移位限制酶切電泳放射自顯影基因工程原理第11頁(yè)6.大尺度限制酶作圖

1)

條件

i.

電泳方法脈沖場(chǎng)凝膠電泳

ii.

樣品制備原位DNA制備和酶解

iii.

人工染色體構(gòu)建pYAC載體構(gòu)建

iv.

脊椎動(dòng)物基因組中CpG和植物基因組中CpXpG序列存在

2)

普通作圖程序原位DNA樣品制備原位DNA限制酶切脈沖場(chǎng)凝膠電泳染色觀察

3)

大尺度作圖用酶

i.

稀有識(shí)別序列內(nèi)切酶I型內(nèi)含子內(nèi)切酶(真菌細(xì)胞核和線粒體基因組,T4噬菌體,衣藻葉綠體和線粒體)；酵母HO內(nèi)切酶；大腸桿菌recA

即使這些內(nèi)切酶識(shí)別序列都很長(zhǎng)：10-19bp，但高等動(dòng)植物基因組中含有這類位點(diǎn)卻極少，因而極少使用基因工程原理第12頁(yè)

ii.

II型限制酶人基因組有45,000個(gè)CpG島,一個(gè)長(zhǎng)度約為1.5kb富含GCDNA片段,其中只有25%CpG島未被甲基化,這些CpG島常位于基因5’-端,未被甲基化CpG島平均長(zhǎng)約270kb

可用于大尺度限制酶作圖限制酶含有以下特征：識(shí)別8或6bp序列；富含或只含GC序列；含有CpG序列

i)

AscI-GGCGCGCC和NotI-GCGGCCGCii)

FseI-GGCCGGCC和SrFI-GCCCGGGCiii)

SfiI-GGCCNNNNNGGCCiv)

CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCGv)

BssHI-GCGCGC,EagI-CGGCCG和SacII-CCGCGGvi)

NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGGC,SmaI-CCCGGGvii)

MluI-ACGCGT,NruI-TCGCGA,PvuI-CGATCG,

SplI-CGTACGCH3CH3CH3CH3CH3CH3基因工程原理第13頁(yè)三.

限制酶圖譜用途

1.

基因工程中應(yīng)用

1)

克隆載體圖譜,便于DNA重組;2)

克隆片段圖譜可用于次克隆,體外突變,基因定位,核酸定序.

2.

突變體檢測(cè)遺傳學(xué)圖譜必須依賴各種突變體存在,所以必定發(fā)生了基因型和表型改變.

限制酶圖譜無(wú)須依賴表型改變,酶譜改變一定是基因型發(fā)生了改變,但不一定發(fā)生了表型改變,即表型改變不一定會(huì)造成酶譜改變.1)

缺失突變體檢測(cè):某DNA片段消失,代之以一較小DNA片段.2)

插入突變體檢測(cè):某DNA片段消失,代之以一較大DNA片段.基因工程原理第14頁(yè)缺失和插入突變體檢測(cè)（I）III點(diǎn)突變檢測(cè)（II）基因工程原理第15頁(yè)3）點(diǎn)突變檢測(cè):某DNA片段消失,代之以兩較小DNA片段.前者長(zhǎng)度等于后二者長(zhǎng)度之和(位點(diǎn)增加)；某兩DNA片段消失,代之以一較大DNA片段，前者長(zhǎng)度之和等于后者長(zhǎng)度(位點(diǎn)消失).

3.

重組頻率測(cè)定同一染色體座位上等位基因可能含有不一樣表型,從而組成遺傳多型性.等位基因限制酶譜也可能含有多型性,這就是限制酶片段長(zhǎng)度多型性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)不一樣個(gè)體總DNA限制酶完全酶切Southern印跡雜交結(jié)果分析基因工程原理第16頁(yè)

當(dāng)不一樣個(gè)體交配時(shí),除自由組合外,也可發(fā)生重組,如不一樣果蠅交配時(shí),其后代表型和限制酶譜可為:表型紅:白=1:1,限制酶譜30%個(gè)體已發(fā)生了重組.4.

遺傳疾病診療分析正常人與遺傳病患者一些DNA片段限制酶譜,便可發(fā)覺(jué)其差異,并總結(jié)出各種遺傳疾病限制酶長(zhǎng)度多態(tài)性圖。臨床診療時(shí)，將遺傳病可疑患者限制酶譜與之比較,便可判斷其是否患有此病.基因工程原理第17頁(yè)第五節(jié)DNA連接

基因工程原理第18頁(yè)一.DNA連接方法兩種不一樣DNA分子能夠經(jīng)過(guò)下述方法之一進(jìn)行連接,而方法選取則是依據(jù)其二者末端DNA結(jié)構(gòu).1.直接連結(jié)法該法適合用于:1)

同種限制酶作用不一樣DNA片段產(chǎn)生相同粘性末端

重組DNA可用同種酶再切開(kāi),但識(shí)別簡(jiǎn)并序列限制酶除外(如AraI)2)不一樣種限制酶作用不一樣DNA片段產(chǎn)生相容性末端

i.重組DNA分子不能再為這兩種酶所作用,如:BamHI/BglIIii.重組DNA分子可為其中一個(gè)酶所作用,但為另一個(gè)酶作用可能性較小,如MboI/BamHI3)PCR產(chǎn)物與特定載體連接

4)限制酶和其它方式產(chǎn)生平整末端.基因工程原理第19頁(yè)2.人工接頭連接法1)人工接頭（linker）結(jié)構(gòu)

i.中軸對(duì)稱互補(bǔ),可自行退火形成雙鏈.如:5'-CCGGAATTCCGG-3'3'-GGCCTTAAGGCC-5'ii.最少有一特定限制酶識(shí)別位點(diǎn)

iii.某種限制酶一套人工接頭可使插入片段與表示載體保持同相.如:

八聚體d(GGAATTCC)

十聚體d(CGGAATTCCG)

十二聚體d(CCGGAATTCCGG)2)用途

i.平整末端連接(各種結(jié)構(gòu)DNA末端均可經(jīng)過(guò)修飾變成平整末端)2X5'-CCGGAATTCCGG-3'退火基因工程原理第20頁(yè)ii.產(chǎn)生新克隆位點(diǎn)

iii.合成匹配接頭3)連接方法

人工接頭磷酸化退火形成雙鏈與目標(biāo)DNA相連限制酶切兩DNA分子相連4)適用范圍

人工接頭連接法適合于那些只有一個(gè)DNA片段需加人工接頭就能夠與另一DNA分子相連DNA分子.利用人工接頭也可使任意兩個(gè)平端DNA分子相連.這種直接相連方法簡(jiǎn)便,快速,但最終連接起來(lái)DNA可能含有不一樣結(jié)構(gòu).為防止這些結(jié)構(gòu)產(chǎn)生,可先使一個(gè)DNA先加上人工接頭后,再與另一個(gè)DNA分子相連.基因工程原理第21頁(yè)3.匹配接頭連接法人工接頭即使可連接兩個(gè)具不一樣末端DNA分子,但這些末端在加入人工接頭前必須變?yōu)槠秸┒?然而,有時(shí)試驗(yàn)不允許使用人工接頭或使用人工接頭不方便,此時(shí),便可使用匹配接頭,它可用于直接連接各種具不一樣末端DNA分子:i.平端+突起末端(5’-突起,3’-突起)ii.粘性末端(5’-突起+5’-突起:EcoRI+HindIII5’-突起+3’-突起:EcoRI+PstI3’-突起+3’-突起:PstI+SacI)1)

匹配接頭結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

i.

由兩個(gè)低聚核苷酸組成

ii.個(gè)別區(qū)域能夠互補(bǔ)

iii.退火后雙鏈低聚核苷酸能夠形成兩個(gè)不一樣末端2)

匹配接頭種類基因工程原理第22頁(yè)i.

預(yù)制匹配接頭(連接平端和粘性末端)

人工接頭+匹配接頭預(yù)制匹配接頭

ii.轉(zhuǎn)換匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)

二匹配接頭退火轉(zhuǎn)換匹配接頭二人工接頭連接酶雙酶切轉(zhuǎn)換匹配接頭

iii.單鏈匹配接頭(連接5’-突起和3’-突起末端)4.同聚物加尾連接法在兩個(gè)不一樣DNA分子末端各加上一個(gè)可互補(bǔ)同聚物,即AT或GC.5.連接方法選擇方法選擇依據(jù):1)兩DNA分子末端結(jié)構(gòu)

2)DNA分子限制酶譜

3)是否需要回收DNA片段基因工程原理第23頁(yè)連接方式選擇載體末端外源DNA末端常規(guī)連接脫磷酸化同聚物平端連接補(bǔ)齊,人工接頭

結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)載體加尾外切酶

5’-突起相容5’-突起第二選擇第一選擇不能不能不能

5’-突起非相容5’-突起不能結(jié)合使用接頭不能不能第一選擇

3’-突起相容3’-突起唯一選擇不能不能不能不能

3’-突起非相容3’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇或平端

3’-突起5’-端突起不能不能第一選擇不能第二選擇

(補(bǔ)齊后)

平端平端不能可能可能第一選擇可能平端3’-或5’-突起不能不能第一選擇不能第二選擇基因工程原理第24頁(yè)二.DNA連接反應(yīng)

1.

連接反應(yīng)理論當(dāng)兩種DNA分子相連時(shí),它們可能產(chǎn)生不一樣結(jié)果,這些結(jié)果與以下原因相關(guān):1)

連接反應(yīng)系統(tǒng)中總DNA濃度i2)

一個(gè)DNA分子靠近同一分子另一端有效濃度j,該值與DNA長(zhǎng)度成反比,即DNA分子越大,該分子兩末端越不易相互作用(即本身環(huán)化)3)

兩種不一樣DNA分子克分子濃度之比值.2.

連接反應(yīng)條件

1)

評(píng)定連接反應(yīng)結(jié)果方法

i.

瓊脂糖凝膠電泳

ii.大腸桿菌轉(zhuǎn)化

2)

反應(yīng)條件基因工程原理第25頁(yè)i.

溫度

ii.ATP濃度

iii.時(shí)間

iv.連接酶濃度

v.克分子比率基因工程原理第26頁(yè)

第六節(jié)

PCR技術(shù)基因工程原理第27頁(yè)一．DNA體外擴(kuò)增技術(shù)

1.

PCR反應(yīng)體系

1)基礎(chǔ)原理(PCR—PolymeraseChainReaction聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))

一個(gè)DNA經(jīng)n次擴(kuò)增后,一個(gè)DNA分子可變?yōu)?n個(gè)分子DNA擴(kuò)增需要對(duì)待擴(kuò)增DNA序列有所了解，最少要對(duì)其兩側(cè)核苷酸序列為已知，方便合成寡核苷酸引物

2)基礎(chǔ)操作待擴(kuò)增DNA片段+dNTP+Tris·HCl緩沖液+兩引物90℃變性30″50℃退火30″加入TaqDNA聚合酶75℃1′進(jìn)入第二次循環(huán)25-30次循環(huán)基因工程原理第28頁(yè)P(yáng)CR原理示意圖基因工程原理第29頁(yè)2.PCR產(chǎn)物判定

1)PCR產(chǎn)物大小和限制酶譜分析2)寡聚核苷酸限制性內(nèi)切酶片段分析（OR分析，OligomerRestrictionanalysis）

OR分析對(duì)于PCR產(chǎn)物限制酶位點(diǎn)上發(fā)生了點(diǎn)突變檢測(cè)極其有用基因工程原理第30頁(yè)P(yáng)CR產(chǎn)物OR判定基因工程原理第31頁(yè)3)分子雜交適合于檢測(cè)PCR產(chǎn)物非限制酶位點(diǎn)上堿基突變。它是利用兩條引物鏈間特異性DNA片段作探針(常為人工合成一段低聚核苷酸，約20n.t.).當(dāng)這種探針核苷酸序列與待測(cè)DNA核苷酸序列完全互補(bǔ)時(shí)才能雜交。假如利用各種等位基因特異性寡核苷酸探針（allele-specificOligonucleotide,ASO）與PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，可檢測(cè)出PCR產(chǎn)物堿基突變?？芍苯永冒唿c(diǎn)雜交方法用于基因型分析基因工程原理第32頁(yè)4)核苷酸序列分析

DNA擴(kuò)增產(chǎn)物變性與末端標(biāo)識(shí)擴(kuò)增引物或定序引物退火雙脫氧核苷酸鏈終止反應(yīng)，測(cè)定DNA序列基因工程原理第33頁(yè)二．TaqDNA聚合酶特點(diǎn)

TaqDNA聚合酶是從一個(gè)極度嗜熱水生棲熱菌YT-1中分離純化而得。該酶分子量為63-68kD

1.無(wú)磷酸單酯酶、磷酸二酯酶以及單鏈外切酶活性，無(wú)內(nèi)切酶活性，但含有依賴于聚合酶活性5’3’外切酶活性

2.最適反應(yīng)溫度為80℃

3.最適pH8.0和最正確反緩沖液Tris·HCl

4.最正確二價(jià)陽(yáng)離子Mg2+

（10mM）

5.具良好熱穩(wěn)定性：在90℃下連續(xù)反應(yīng)30分鐘仍有70%酶活基因工程原理第34頁(yè)TaqDNA聚合酶特征基因工程原理第35頁(yè)當(dāng)采取TaqDNA聚合酶進(jìn)行DNA體外擴(kuò)增時(shí)，必須考慮到以下五個(gè)參數(shù)：

1）熱穩(wěn)定性：在PCR循環(huán)中DNA變性時(shí)間常為30-60″，若循環(huán)30次，其累計(jì)加熱變性時(shí)間為15-30′。TaqDNA聚合酶在90℃下保溫30′仍含有70%酶活性，可大大降低操作步驟，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化*2）模板與引物特異性：當(dāng)退火溫度和DNA鏈延伸時(shí)溫度偏低時(shí)，引物與模板配正確特異性大大降低，從而造成一些不需要DNA片段被擴(kuò)增。顯然，其產(chǎn)物專一性大大降低，使結(jié)果無(wú)法分析。因?yàn)門aqDNA聚合酶最適反應(yīng)溫度為80℃，退火溫度可提升到55℃以上，由此大大降低了引物與模板非專一性結(jié)合，使產(chǎn)物均一性大大增加**3）合成產(chǎn)率：反應(yīng)底物和產(chǎn)物在DNA擴(kuò)增中不停發(fā)生改變，最終將會(huì)造成聚合反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期，平臺(tái)期出現(xiàn)時(shí)間與聚合酶特征相關(guān)。研究表明，利用Klenow片段進(jìn)行20次擴(kuò)增后進(jìn)入平臺(tái)期，累積產(chǎn)物拷貝數(shù)為2×105，當(dāng)采取TaqDNA聚合酶時(shí)，擴(kuò)增25次后才進(jìn)入平臺(tái)期，拷貝數(shù)可大4×106***4）延伸長(zhǎng)度：有時(shí)為了獲取較長(zhǎng)DNA片段擴(kuò)增，這就要求DNA聚合酶含有較強(qiáng)延伸能力。當(dāng)擴(kuò)增片段大于250bp時(shí)，Klenow片段和T4聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)率大大降低。利用T7DNA聚合酶，可使擴(kuò)增片段達(dá)2Kb。當(dāng)利用TaqDNA聚合酶時(shí)，最長(zhǎng)延伸長(zhǎng)度為4.4Kb.基因工程原理第36頁(yè)

經(jīng)改造TaqDNA聚合酶可擴(kuò)增出40kbDNA片段.5）擴(kuò)增產(chǎn)物可靠性：評(píng)定DNA聚合酶一個(gè)主要指標(biāo)是它復(fù)制DNA可靠性，即摻入錯(cuò)誤堿基頻率。這對(duì)于PCR技術(shù)可靠性是至關(guān)主要。Klenow片段錯(cuò)誤摻入率為10-4，TaqDNA聚合酶錯(cuò)誤摻入率為5×10-3

，而T4聚合酶錯(cuò)誤摻入率為10-7。

*注：1）退火溫度常與引物長(zhǎng)度和堿基組成有直接相關(guān)關(guān)系，引物越長(zhǎng)或GC含量較高，退火溫度能夠高些，反之則低些。退火溫度越高，引物與模板（即擴(kuò)增DNA）結(jié)合特異性越高，這可大大降低非特異性DNA片段擴(kuò)增。引物長(zhǎng)度常為20-28聚體，其中有50%以上GC含量，無(wú)本身互補(bǔ)序列，尤其是3'末端不應(yīng)有內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)，引物加量為每100μll20pmol.**2)出現(xiàn)平臺(tái)期原因可能有：①后期循環(huán)酶濃度或聚合時(shí)間不足；②引物耗盡；③dNTP耗盡；④產(chǎn)物濃度過(guò)高，以致ds-DNA解鏈后又快速退火，不能與引物結(jié)合。***3）鏈延伸長(zhǎng)度與延伸時(shí)間相關(guān)，對(duì)于TaqDNA聚合酶，每分鐘可形成n.t.或更多。假如要擴(kuò)增3-4KbDNA，在72℃下需將酶延伸時(shí)間增至3-4分鐘?；蚬こ淘淼?7頁(yè)三．PCR方法

1.

強(qiáng)化PCR（BoostedPCR）將PCR分為兩個(gè)階段：

1）引物與模板之比為107，擴(kuò)增20個(gè)周期

2）引物與模板之比為1012–1013，再擴(kuò)增10個(gè)周期該法適合于待擴(kuò)增DNA濃度較低時(shí)。

2.混合寡核苷酸引物PCR（mixedoligonucleotideprimedamplificationofcDNA,MOPAC）依據(jù)各氨基酸最常見(jiàn)密碼子合成一系列引物，對(duì)某一特定cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。

3.錨定PCR(AnchoredPCR，A-PCR)基因工程原理第38頁(yè)4.連結(jié)PCR(ligationmediatedPCR)

該法可用于核苷酸序列測(cè)定,DNA足跡分析技術(shù)和測(cè)定甲基化作用基因工程原理第39頁(yè)5.不對(duì)稱PCR(AsymmetricalPCR)采取不一樣引物濃度比率，如50：1，100：1，可得大量拷貝ssDNA用于測(cè)序6.GC串PCR(GCclampPCR)應(yīng)用變性劑梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)可檢測(cè)出DNA片段中一對(duì)堿基改變，在DNA分子一端加上一GC串（約40n.t.）利用它高解鏈溫度特征，在梯度變性膠上可檢測(cè)出原DNA鏈中最高解鏈區(qū)內(nèi)點(diǎn)突變基因工程原理第40頁(yè)

7.競(jìng)爭(zhēng)引物PCR(competitiveoligonucieotideprimerPCR,COP-PCR)

有一個(gè)堿基改變兩種引物在較寬松復(fù)性條件下競(jìng)爭(zhēng)DNA模板，其中只有完全互補(bǔ)引物才能大量配對(duì)。該法可用于測(cè)定某一DNA片段上是否帶有某一已知堿基置換?；蚬こ淘淼?1頁(yè)8.等位基因?qū)Ｒ籔CR(AllelespecificPCR,ASPCR)

該法可用于檢測(cè)點(diǎn)突變。如用于檢測(cè)鐮刀形貧血癥。9.反轉(zhuǎn)PCR(inverserarinvertedPCR)

該法可用于擴(kuò)增已知序列兩側(cè)未知序列基因工程原理第42頁(yè)10.反向PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)

主要用于mRNAPCR擴(kuò)增

基因工程原理第43頁(yè)

11.加端PCR(Add-onPCR)

在合