臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第1頁(yè)一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室規(guī)范化設(shè)置及其各室功效二、各階段操作要求三、PCR污染與對(duì)策四、因操作欠規(guī)范造成問(wèn)題分析臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第2頁(yè)一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室

規(guī)范化設(shè)置及其各室功效規(guī)范化設(shè)置：要求參考《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室管理暫行方法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[]10號(hào)文）附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第3頁(yè)

1.四個(gè)隔開工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有

專用儀器設(shè)備。2.明確標(biāo)識(shí)，如加樣器或試劑等。3.單一方向次序，從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)（簡(jiǎn)稱擴(kuò)增區(qū)）至產(chǎn)物分析區(qū)。4.使用不一樣顏色或有顯著區(qū)分標(biāo)志工作服。5.試驗(yàn)室清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向進(jìn)行。6.各自清潔用具。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第4頁(yè)

各室功效：臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第5頁(yè)（一）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

功效：貯存試劑制備、試劑分裝和主反應(yīng)混合液制備。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第6頁(yè)

含反應(yīng)混合液離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。戴手套。工作結(jié)束后必須馬上對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。試驗(yàn)臺(tái)表面，使用可移動(dòng)紫外燈（254nm波長(zhǎng)）照射，普通照射過(guò)夜。試驗(yàn)室及其設(shè)備使用必須有日常統(tǒng)計(jì)。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第7頁(yè)（二）標(biāo)本制備區(qū)

功效：臨床標(biāo)本保留，核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA合成。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第8頁(yè)

要正確使用加樣器。正壓條件防止從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)氣溶膠污染。為防止樣本間交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液反應(yīng)管。對(duì)含有潛在傳染危險(xiǎn)性材料，必須有明確樣本處理和滅活程序。用過(guò)加樣器吸頭必須放入專門消毒容器內(nèi)。用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)樣本制備好以后，應(yīng)馬上進(jìn)行cDNA合成。

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第9頁(yè)（三）擴(kuò)增區(qū)

功效：DNA或cDNA擴(kuò)增。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第10頁(yè)

已制備DNA模板和合成cDNA加入和主反應(yīng)混合液制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行?？山档捅緟^(qū)氣壓以防止氣溶膠從本區(qū)漏出。如有加樣則應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第11頁(yè)（四）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

功效：擴(kuò)增片段測(cè)定。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第12頁(yè)

膜上微孔板上探針雜交方法、Southern轉(zhuǎn)移、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、核酸測(cè)序方法等。本區(qū)是最主要擴(kuò)增產(chǎn)物污染起源。溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物質(zhì)，注意試驗(yàn)人員安全防護(hù)。

負(fù)壓條件。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第13頁(yè)二、各階段操作要求

測(cè)定分析前標(biāo)本采集處理、測(cè)定中核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測(cè)定后結(jié)果匯報(bào)等。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第14頁(yè)（一）標(biāo)本采集

臨床標(biāo)本包含EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。

EDTA和枸櫞酸鹽是首選抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶強(qiáng)抑制劑。

玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，250°烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。

臨床用于RNA（如HCVRNA）擴(kuò)增檢測(cè)血標(biāo)本應(yīng)盡快（3小時(shí)以內(nèi)）分離血漿，以防止RNA降解。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第15頁(yè)（二）標(biāo)本穩(wěn)定化處理DNA：不需特殊穩(wěn)定化處理。RNA：異硫氰酸胍鹽（GITC）可使DNA酶和RNA酶失活。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第16頁(yè)（三）標(biāo)本運(yùn)輸

可在常溫下經(jīng)過(guò)郵寄運(yùn)輸，如用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)EDTA抗凝全血及用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)GITC穩(wěn)定化處理標(biāo)本。未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)輸。

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第17頁(yè)（四）標(biāo)本貯存1.血清/血漿等—-70℃2.用于DNA測(cè)定已純化核酸樣本—4℃3.用于RNA測(cè)定已純化核酸樣本—-80℃4.用乙醇沉淀核酸樣本—-20℃5.GITC處理RNA標(biāo)本在室溫可保留7天

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第18頁(yè)（五）標(biāo)本處理（核酸提取）

抑制物可能起源于：標(biāo)本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）。核酸提取過(guò)程中殘留有機(jī)溶劑（如酚、氯仿等）。

痰須液化處理。

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第19頁(yè)操作時(shí)（加裂解液后充分混勻，沸水浴）注意：①離心管不能插得過(guò)低，以防進(jìn)水；②水浴時(shí)不能加蓋，防管蓋爆開；③水浴時(shí)間須準(zhǔn)確，10±1min；④水浴時(shí)不能走開；⑤左右手分開，左手只接觸樣本，右手只接觸加樣器及操作儀器。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第20頁(yè)（六）靶核酸逆轉(zhuǎn)錄（RT）和擴(kuò)增

有各種原因可引發(fā)核酸擴(kuò)增檢測(cè)假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對(duì)、Mg++濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)均一性極為主要。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第21頁(yè)RT-PCR操作注意：①標(biāo)本必須新鮮；②做RNA標(biāo)本槍頭離心管必須無(wú)菌；③冰上操作；④處理完后須馬上上機(jī)，不能放置；⑤注意左右手分開。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第22頁(yè)（七）擴(kuò)增產(chǎn)物分析擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測(cè)序、分光光度法定量等。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第23頁(yè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR在熒光定量PCR基礎(chǔ)上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR全過(guò)程，最終經(jīng)過(guò)曲線進(jìn)行定量分析。與普通熒光定量PCR使用熒光強(qiáng)度定量不一樣，實(shí)時(shí)熒光PCR普通使用Ct（每個(gè)反應(yīng)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值所經(jīng)循環(huán)數(shù)）定量，Ct與模板初始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。實(shí)時(shí)熒光PCR優(yōu)點(diǎn)：精密度高，重復(fù)性能好。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第24頁(yè)TaqMan熒光定量PCR原理

探針兩端分別用熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)標(biāo)識(shí)，因?yàn)榫嚯x相近，基團(tuán)相互作用，不產(chǎn)生熒光；探針與模板雜交在引物區(qū)間內(nèi)，當(dāng)擴(kuò)促進(jìn)行時(shí)，TaqDNA聚合酶5’-3’外切酶活性降解探針，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開，受激產(chǎn)生熒光信號(hào)；熒光信號(hào)強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比；臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第25頁(yè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第26頁(yè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第27頁(yè)三、PCR污染與對(duì)策PCR污染分環(huán)境污染與反應(yīng)液污染二種。常見PCR污染源有三個(gè)：第一、標(biāo)本間交叉污染；第二、試驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒污染；第三、PCR產(chǎn)物污染（Carryover）。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第28頁(yè)要預(yù)防PCR污染，必須做好以下3個(gè)步驟工作：（一）污染預(yù)防（二）污染源追蹤（三）污染源處理臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第29頁(yè)（一）污染預(yù)防操作PCR時(shí)，按照下述規(guī)則可有效地預(yù)防PCR污染。1、PCR前處理及后處理要在不一樣隔離工作臺(tái)上或房間內(nèi)進(jìn)行。2、分裝試劑，標(biāo)識(shí)批號(hào)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第30頁(yè)3、改進(jìn)試驗(yàn)操作：

(1)帶一次性手套；(2)防止反應(yīng)液飛濺；(3)用一次性移液器或吸頭，吸頭不要暴露于空氣，以免產(chǎn)物氣溶膠污染；(4)操作多份樣品時(shí)，要先將可混勻成份(dNTPs，緩沖液，引物等)一起制備標(biāo)準(zhǔn)混合液(Mastermix)；(5)制備反應(yīng)混合液時(shí)，最終加入樣品DNA，加入DNA后，在進(jìn)行下一步操作前要蓋緊反應(yīng)管。4、檢驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第31頁(yè)（二）污染源追蹤臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第32頁(yè)1、陽(yáng)、陰性對(duì)照

選擇陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好樣品。

陰性對(duì)照選擇一定要小心。

不含模板DNAPCR試劑對(duì)照。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第33頁(yè)2、常見環(huán)境污染源有(1)點(diǎn)雜交點(diǎn)樣器；(2)切片機(jī)；(3)離心機(jī)；(4)切膠用刀或微解剖刀；(5)濃縮用具，真空瓶；(6)電泳裝置和紫外燈箱；(7)干冰/乙醇或水溶鍋；(8)冰箱門把手、冷凍架和門把手。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第34頁(yè)追蹤可疑環(huán)境污染源①用去離子浸濕滅菌棉簽擦試可疑個(gè)別②在0.1ml去離子水中浸泡；③取5μl作PCR反應(yīng)；④電泳檢驗(yàn)結(jié)果。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第35頁(yè)（三）污染源處理臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第36頁(yè)1.環(huán)境污染處理法（1）稀酸處理法。對(duì)擦試試驗(yàn)陽(yáng)性部位或器件可用1mol/LHCl擦洗或浸泡殘留DNA。（2）紫外法：UV照射波長(zhǎng)普通選擇254/300nm，需考慮PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基分布。UV對(duì)長(zhǎng)片段（500bp以上）有效，而對(duì)短片段效果不大。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第37頁(yè)2.反應(yīng)液污染處理法(1)DNaseI法：PCR混合液（不加模板和Taq酶）中加入0.5UDNaseI，室溫下作用30min后，加熱滅活，加入模板和Taq酶后即可進(jìn)行正常PCR。

優(yōu)點(diǎn)：廉價(jià)，不需知道擴(kuò)增DNA序列。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第38頁(yè)(2)內(nèi)切酶法：選擇識(shí)別四個(gè)堿基內(nèi)切酶（如MspI等），最好幾個(gè)適用，可克服其識(shí)別序列特異缺點(diǎn)。方法同上，只是DnaseI由內(nèi)切酶（MspI10U）代替，作用時(shí)間延長(zhǎng)到1.0～1.5h。(3)紫外照射法：反應(yīng)中不加模板與Taq酶。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第39頁(yè)(4)尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法：dUTP代替反應(yīng)中dTTP，使產(chǎn)物中含大量dU，UNG可去除dU，使失去dU位置，阻止Taq酶延伸。PCR正常循環(huán)前，用UNG處理PCR反應(yīng)混合液可消除PCR產(chǎn)物污染，而UNG在正常PCR循環(huán)變性一步就會(huì)失活，所以，對(duì)含dU新合成PCR產(chǎn)物沒(méi)有影響。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第40頁(yè)

TATATATATA

PCRAUAUAU

UNGAAA

加熱

AAA

×

PCR臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第41頁(yè)該法優(yōu)點(diǎn)：①去除任河起源（包含引物在內(nèi)）污染；②因?yàn)槲廴井a(chǎn)物有大量dU存在，所以，UNG處理會(huì)徹底消除污染。③UNG處理與PCR擴(kuò)增可在同一試管內(nèi)進(jìn)行。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第42頁(yè)四、因操作欠規(guī)范造成問(wèn)題分析臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第43頁(yè)（一）試驗(yàn)室儀器設(shè)備1、設(shè)備不齊全、不配套，使得試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，引發(fā)假性結(jié)果。

旋渦混合器，微量加樣器，正規(guī)紫外透射儀。RNAPCR樣品處理時(shí)，血清（或血漿）中加入強(qiáng)烈變性劑后，血樣中蛋白變性、結(jié)塊。吸頭與微量加樣器不配套。2、PCR熱循環(huán)儀差異或質(zhì)量問(wèn)題。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第44頁(yè)移液器：①禁止大力往返擰動(dòng)；②禁止調(diào)至容量之外使用；③第二檔為排空檔，不得作吸收之用；④吸頭應(yīng)浸入液面2—3mm處吸收；⑤禁止將有液體移液器平放或倒置；⑥混勻沉淀時(shí)，將吸頭緊貼于沉淀上方管壁，重復(fù)吸收液體，將沉淀重復(fù)混勻，溶解；⑦每七天用75%乙醇清洗一次，若有污染隨時(shí)清洗。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第45頁(yè)離心機(jī)：①離心前，離心管須配平；②將調(diào)速檔打至0檔位，才能打開電源開關(guān)，逐步升高轉(zhuǎn)速，直至即定轉(zhuǎn)速；③定時(shí)旋鈕不能強(qiáng)行歸零；④轉(zhuǎn)頭未停頓時(shí)，禁止打開蓋板。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第46頁(yè)（二）試驗(yàn)室布局不合理引發(fā)污染問(wèn)題1、樣品處理不進(jìn)行隔離，樣品中各種核酸片段均會(huì)經(jīng)過(guò)空氣進(jìn)行傳輸。2、PCR結(jié)果檢測(cè)試驗(yàn)室和其它試驗(yàn)室在一起，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重?cái)U(kuò)增子污染。3、儀器設(shè)備及工作服等（尤其是加樣器）公用，也會(huì)造成嚴(yán)重污染。4、試驗(yàn)室操作垃圾（吸頭、離心管、樣品杯等）亂放，飄散在空氣中核酸片段、病原微生物可造成試驗(yàn)室污染。

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第47頁(yè)（三）PCR操作中存在問(wèn)題分析1.陽(yáng)性變陰性2.陰性變陽(yáng)性3.PCR結(jié)果不穩(wěn)定臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第48頁(yè)1.陽(yáng)性變陰性

(1)有些陽(yáng)性病人，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)后為陰性，可能有兩種情況：一是采集標(biāo)本方法或部位不正確，二是假如病人取樣部位病原體消失，需依據(jù)病人病理情況采樣。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第49頁(yè)(2)標(biāo)本保留不妥，可引發(fā)PCR失敗。搜集標(biāo)本亂放（未放冰箱），病原體破裂，檢測(cè)核酸降解，失去了PCR檢測(cè)模板或造成標(biāo)本污染。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第50頁(yè)2.陰性變陽(yáng)性

常見原因有以下6點(diǎn)：

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第51頁(yè)①加入試劑或樣品時(shí)引發(fā)交叉污染

（最好在加完全部其它反應(yīng)成份，包含預(yù)防蒸發(fā)用礦物油后才吸加模板DNA，將模板加入微量離心管后，蓋好離心管并用戴有手套手指輕輕單擊管側(cè)壁，以搖勻液體，再作瞬時(shí)離心[10秒]，使水相和有機(jī)相分開）。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第52頁(yè)②加樣器通道易形成氣溶膠，造成加樣器通道污染，可經(jīng)過(guò)使用有濾篩吸頭防止污染

（將模板DNA加入PCR系統(tǒng)時(shí)，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別反應(yīng)，全部并非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)）。

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第53頁(yè)③打開標(biāo)本管蓋引發(fā)樣品飛濺

（打開前須瞬間離心）④操作時(shí)手套引發(fā)交叉污染

（拿過(guò)模板DNA管后應(yīng)更換手套）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第54頁(yè)⑤不明原因引發(fā)公用試劑如液體石蠟等污染

（必須設(shè)置一個(gè)不含模板DNA但含PCR系統(tǒng)中全部其它成份對(duì)照反應(yīng)。這一對(duì)照管須在準(zhǔn)備好全部其它PCR以后才進(jìn)行吸加）。⑥試驗(yàn)室污染

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第55頁(yè)3.PCR檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定（1）樣品處理方法不妥，標(biāo)本中雜質(zhì)很多，血清標(biāo)本有蛋白質(zhì)、血紅素、代謝產(chǎn)物等。蛋白質(zhì)——DNA電泳帶拖尾血紅素中卟啉化合物——抑制Taq酶活性代謝產(chǎn)物——干擾引物配對(duì)

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第56頁(yè)（2）操作不妥帶來(lái)后果

主要指不能嚴(yán)格按照說(shuō)明進(jìn)行操作造成PCR檢測(cè)失敗。如HCVRNAPCR樣品處理試劑A、B、C和75%乙醇操作過(guò)程。

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第57頁(yè)50μl血清標(biāo)本

(標(biāo)本可用血清或血漿，盡可能防止使用肝素做抗凝劑，防止重復(fù)凍融)

加200μl試劑A后馬上混勻

(試劑A是強(qiáng)烈變性劑，不但要將病毒外殼變性裂解，釋放