細胞分子生物學(xué)研究方法

一、原位分子雜交技術(shù)DNA變性:當溶液中DNA分子處于高溫或高pH值(13)條件下,維持雙螺旋在一起堿基互補對就被破壞,DNA雙鏈解離成兩條單鏈,這一過程叫DNA變性。DNA復(fù)性:當溫度降低至適當溫度或恢復(fù)pH值至中性，兩條裂解單鏈按堿基互補配對標準重新形成雙鏈結(jié)構(gòu),這一過程叫DNA復(fù)性,又叫DNA雜交。細胞分子生物學(xué)研究方法第1頁細胞分子生物學(xué)研究方法第2頁細胞分子生物學(xué)研究方法第3頁

核酸分子雜交：按照堿基互補配對標準，將不一樣起源序列互補單鏈DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互補配對成雙鏈雜交分子，這一過程叫核酸分子雜交。細胞分子生物學(xué)研究方法第4頁

原位雜交：用核苷酸探針對特殊核苷酸次序在其原位進行雜交,叫原位雜交。可用于DNA、RNA定位研究。細胞分子生物學(xué)研究方法第5頁熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）細胞分子生物學(xué)研究方法第6頁二、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerasechainreaction，PCR）又叫體外基因擴增技術(shù)。利用人工合成一對引物，在被擴增DNA模板鏈兩端形成雙鏈，由DNA聚合酶催化一對引物之間聚合反應(yīng)。細胞分子生物學(xué)研究方法第7頁詳細過程：①變性：將雙鏈DNA加熱（95℃）使之變性，DNA雙鏈變成單鏈②退火：降低溫度至56℃使引物與模板DNA單鏈結(jié)合③延伸：將溫度升至72℃，在DNA聚合酶作用下，在引物3’端進行延伸，使原模板DNA一條鏈變成兩條鏈。細胞分子生物學(xué)研究方法第8頁三、反義技術(shù)反義核酸技術(shù)主要是引入目標基因mRNA反義序列或與目標基因互補配正確反義基因，經(jīng)過它們雜交而阻遏或降低目標基因表示一個方法。當引入反義核酸與對應(yīng)序列互補配對后，用于表示目標基因mRNA量大大降低，使細胞中靶基因編碼蛋白合成量也大為降低細胞分子生物學(xué)研究方法第9頁反義技術(shù)應(yīng)用：①基因功效研究②病毒基因組功效研究③作為藥品④抗腫瘤作用細胞分子生物學(xué)研究方法第10頁四、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)移到受體菌或細胞內(nèi)使之在細胞內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)入基因擴增或表示技術(shù)。它是重組DNA、基因功效研究、基因治療關(guān)鍵技術(shù)之一。方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染細胞分子生物學(xué)研究方法第11頁轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細胞技術(shù)，它是研究基因表示調(diào)控，突變分析等常規(guī)工具。伴隨功效研究興起，其應(yīng)用越來越廣泛。細胞分子生物學(xué)研究方法第12頁常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，所以一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平表示，但通常只連續(xù)幾天，多用于開啟子和其它調(diào)控元件分析。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既能夠整合到宿主染色體中，也可能作為一個游離體（episome）存在。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細胞能整合，通常需要經(jīng)過一些選擇性標識，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等重復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染同源細胞系。細胞分子生物學(xué)研究方法第13頁影響轉(zhuǎn)染效率主要原因有：

1、細胞培養(yǎng)物

健康細胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)。不一樣細胞有不一樣培養(yǎng)基，血清和添加物。高轉(zhuǎn)染效率需要一定細胞密度，普通推薦在轉(zhuǎn)染前24小時將細胞傳代，這么可提供正常細胞代謝，增加對外源DNA攝入可能。另外一定要防止細菌、支原體或真菌污染。細胞分子生物學(xué)研究方法第14頁2、血清

大多數(shù)培養(yǎng)基在使用前需要加血清。通常血清是一個包含生長因子及其它輔助因子不確切成份添加物，對不一樣細胞生長作用有很大差異。血清質(zhì)量改變直接影響轉(zhuǎn)染效率。所以在轉(zhuǎn)染前提議先測試出對細胞生長良好血清批號，轉(zhuǎn)染時用同一批號血清，并同時做負對照（不加轉(zhuǎn)染試劑及外源DNA）以測試細胞生長是否正常。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低，所以在轉(zhuǎn)染前要除血清。但有些對此敏感細胞如原代細胞會受到損傷，甚至死亡造成轉(zhuǎn)染效率極低。細胞分子生物學(xué)研究方法第15頁3、載體構(gòu)建

轉(zhuǎn)染載體構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA、RNA、PCR產(chǎn)物、寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不一樣病毒載體有其特定宿主，有還要求特定細胞周期，另外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。除載體構(gòu)建外，載體形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不一樣影響，假如基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也極難進行，所以選擇組成及適當開啟子也很主要，同時做空載體及其它基因相同載體構(gòu)建正對照可排除毒性影響干擾。細胞分子生物學(xué)研究方法第16頁4、DNA質(zhì)量

DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。普通轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，假如DNA不純，帶少許鹽離子、蛋白、代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物有效形成及轉(zhuǎn)染進行。核酸純化世界第一品牌德國QIAGEN企業(yè)提供超純質(zhì)粒抽提試劑盒使您無須為DNA質(zhì)量操心。另外，對一些內(nèi)毒素敏感細胞（如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞），QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，確保理想轉(zhuǎn)染效果。細胞分子生物學(xué)研究方法第17頁5、轉(zhuǎn)染技術(shù)

轉(zhuǎn)染技術(shù)選擇對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑百分比，細胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測時間等。細胞分子生物學(xué)研究方法第18頁細胞分子生物學(xué)研究方法第19頁五、基因敲除與敲進

基因敲除（knockoutofgene）：利用基因打靶技術(shù)，用無功效外源基因轉(zhuǎn)入細胞與基因組中同源序列進行同源重組，把含有功效同源序列置換出來，造成功效基因缺失或失活，這一技術(shù)叫基因敲除。