多肽和蛋白質(zhì)類藥物專家講座

Chapter3多肽與蛋白質(zhì)類藥品

多肽和蛋白質(zhì)類藥物第1頁1953年人工合成了第一個有生物活性多肽——催產(chǎn)素以后，20世紀(jì)50年代都集中于腦垂體所分泌各種多肽激素研究。60年代，研究重點轉(zhuǎn)移到控制腦垂體激素分泌各種多肽激素研究。70年代，神經(jīng)肽研究進入高潮。生物胚層發(fā)育淵源關(guān)系表明，很多腦活性肽也存在于腸胃組織中，從而推進了腸胃激素研究進展。

多肽和蛋白質(zhì)類藥物第2頁3.1多肽和蛋白質(zhì)藥品基本知識基本概念多肽類藥品是以多肽激素和多肽細胞生長因子為主一大類內(nèi)源性活性成份。蛋白質(zhì)藥品包含蛋白質(zhì)類激素、蛋白質(zhì)細胞生長調(diào)整因子、血漿蛋白質(zhì)類、黏蛋白、膠原蛋白、蛋白酶抑制劑等，其作用方式從對機體各系統(tǒng)和細胞生長調(diào)整，擴展到被動免疫、替換療法和抗凝血等。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第3頁細胞生長調(diào)整因子——在體內(nèi)和體外對效應(yīng)細胞生長、增殖和分化起調(diào)控作用一類物質(zhì)。許多生長因子在靶細胞上有特異性受體，僅微量就有較強生理活性。3.1多肽和蛋白質(zhì)藥品基本知識多肽和蛋白質(zhì)類藥物第4頁生物技術(shù)在該類中應(yīng)用基因工程技術(shù)制造------胰島素、干擾素、白介素、生長素、EPO等實現(xiàn)了工業(yè)化，發(fā)展方向為轉(zhuǎn)基因動植物許多活性蛋白質(zhì)、多肽都是由無活性蛋白質(zhì)前體，經(jīng)過酶加工剪切轉(zhuǎn)化而來有共同起源，相同結(jié)構(gòu)，保留著若干彼此所特有生物活性。研究活性多肽結(jié)構(gòu)與功效關(guān)系及活性多肽之間結(jié)構(gòu)異同與其活性關(guān)系，將有利于設(shè)計和研制新活性多肽藥品。對蛋白質(zhì)類藥品進行結(jié)構(gòu)修飾多肽和蛋白質(zhì)類藥物第5頁按起源分生化藥品——起源于動植物有機體基因工程藥品——起源于基因工程菌表示生產(chǎn)藥品習(xí)慣分法多肽生化藥品、細胞生長因子、抗體藥品、抗菌肽、酶類藥品多肽、蛋白質(zhì)類藥品分類多肽和蛋白質(zhì)類藥物第6頁多肽類激素、多肽抗生素：消化道多肽、下丘腦多肽、腦多肽、激肽等；動、植物蛋白。

酶類與輔酶類藥品：蛋白水解酶類、凝血酶及抗栓酶，輔酶Q10等。生化藥品多肽和蛋白質(zhì)類藥物第7頁激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥品：人生長激素釋放抑制因子，人胰島素，人生長激素

細胞因子類藥品：人干擾素，人白細胞介素，集落刺激因子，促紅細胞生成素

酶類及凝血因子類藥品：單克隆抗體、疫苗、基因治療藥品、白介素、生長因子、內(nèi)啡肽、反義藥品、人生長激素、促紅細胞生成素、腫瘤壞死因子等。基因工程藥品多肽和蛋白質(zhì)類藥物第8頁多肽和蛋白質(zhì)物化性質(zhì)1.酸堿性多肽是小分子，化學(xué)性質(zhì)與氨基酸類似，含有20個以上氨基酸殘基多肽與蛋白質(zhì)沒有顯著界限；蛋白質(zhì)是呈兩性解離電解質(zhì)，通常在等電點時，蛋白質(zhì)溶解度最小，不穩(wěn)定，易于從溶液中沉淀析出。各種蛋白質(zhì)分子都有自己等電點。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第9頁2.離子結(jié)合蛋白質(zhì)存在兩性，其表面帶有一定量電荷，可與陰離子或陽離子結(jié)合。很多離子與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽，可作為蛋白質(zhì)沉淀劑。多肽和蛋白質(zhì)物化性質(zhì)多肽和蛋白質(zhì)類藥物第10頁多肽和蛋白質(zhì)物化性質(zhì)3.膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子量大，分子大小到達膠粒1～100nm范圍。球狀蛋白質(zhì)表面多親水基團，含有強烈地吸引水分子作用，使蛋白質(zhì)分子表面常為多層水分子所包圍，稱水化膜，從而阻止蛋白質(zhì)顆粒相互聚集。蛋白質(zhì)分子擴散速度慢，不易透過半透膜，粘度大，在分離提純蛋白質(zhì)過程中，可利用蛋白質(zhì)這一性質(zhì)除去小分子雜質(zhì)——透析(dialysis)。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第11頁4.變性天然蛋白質(zhì)嚴(yán)密結(jié)構(gòu)在一些物理或化學(xué)原因作用下，其特定空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而造成理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性喪失，如酶失去催化活力，激素喪失活性，稱之為蛋白質(zhì)變性作用(denaturation)。變性蛋白質(zhì)和天然蛋白質(zhì)最顯著區(qū)分是溶解度降低變性并非是不可逆改變，當(dāng)變性程度較輕時，如去除變性原因，有蛋白質(zhì)仍能恢復(fù)或部分恢復(fù)其原來構(gòu)象及功效，變性可逆改變稱為復(fù)性。多肽和蛋白質(zhì)物化性質(zhì)多肽和蛋白質(zhì)類藥物第12頁多肽和蛋白質(zhì)類藥物第13頁3.2多肽和蛋白質(zhì)藥品生產(chǎn)方法利用傳統(tǒng)生化提取法生產(chǎn)

——從動植物、微生物等直接提取

——經(jīng)過培養(yǎng)動植物、微生物細胞得到利用基因工程技術(shù)構(gòu)建工程菌（細胞）進行生產(chǎn)利用原核生物或簡單真核生物如酵母菌作為工程菌（活細胞），經(jīng)過將含有編碼某蛋白或多肽堿基序列插入一段DNA載體（如質(zhì)粒）中，并在工程菌（或細胞）中表示，從而得到對應(yīng)多肽或蛋白質(zhì)。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第14頁加拿大SembioSys生物工程企業(yè)利用北美洲普遍栽培高產(chǎn)油料作物——紅花作為轉(zhuǎn)基因植物“平臺”，成功生產(chǎn)出“紅花子起源人胰島素”，該胰島素順利經(jīng)過動物試驗與Ⅰ～Ⅱ期臨床試驗，其藥代動力學(xué)與藥效學(xué)試驗結(jié)果與美國禮來利用大腸桿菌表述胰島素基因生產(chǎn)重組DNA人胰島素基本一樣。理論上，每公頃紅花田可生產(chǎn)出1千克人胰島素原料藥。3.2多肽和蛋白質(zhì)藥品生產(chǎn)方法多肽和蛋白質(zhì)類藥物第15頁加拿大渥太華大學(xué)生物技術(shù)研究中心科研人員也利用另兩種高產(chǎn)作物——煙草和水稻植株生產(chǎn)出了一個名為“胰島素樣生長因子”(ILGF)新型降血糖藥品。據(jù)稱，ILGF降糖效果甚至優(yōu)于常規(guī)口服降糖藥。假如ILGF能經(jīng)過臨床試驗并成功上市，或?qū)⒊蔀榍熬翱善趪H醫(yī)藥市場暢銷產(chǎn)品。3.2多肽和蛋白質(zhì)藥品生產(chǎn)方法多肽和蛋白質(zhì)類藥物第16頁蛋白質(zhì)、多肽提取分離慣用方法：沉淀法（鹽析、有機溶劑沉淀、等電點沉淀、結(jié)晶等）超濾法膜分離法離心分離法凝膠過濾法離子交換層析疏水相互作用色譜親和層析等3.3多肽和蛋白質(zhì)藥品分離多肽和蛋白質(zhì)類藥物第17頁基因工程藥品分離與純化流程多肽和蛋白質(zhì)類藥物第18頁3.3.1反相高效液相色譜多肽和蛋白質(zhì)類藥物第19頁3.3.1反相高效液相色譜多肽和蛋白質(zhì)類藥物第20頁3.3.1反相高效液相色譜分離機理：①用C4～C8烷基作配基，將配基鍵合在固定基質(zhì)上作為固定相，以水溶性有機溶劑（如甲醇、乙腈、異丙醇）加強酸作流動相（流動相極性大于固定相）。②蛋白質(zhì)分子中現(xiàn)有親水性基團（-OH，-NH、-COOH、SH等），也有疏水性基團（如苯環(huán)、-CH3、-CH2和-CH等）。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第21頁③在水溶液中，疏水性基團避開水而親合其它疏水性基團，即溶質(zhì)分子非極性部分在水中傾向于與水接觸面減小，促進了其與填料（疏水性配基）親合。④不一樣蛋白質(zhì)在相同流動相中因為疏水基團數(shù)量、種類以及表面分布情況不一樣，與填料親協(xié)力也不一樣，從而得到分離。結(jié)果：疏水性強蛋白質(zhì)親協(xié)力大，出峰遲；

疏水性小蛋白質(zhì)就容易被洗脫。3.3.1反相高效液相色譜多肽和蛋白質(zhì)類藥物第22頁色譜條件①固定相：慣用C4～C8鏈烴作為配基（鍵合在固體基質(zhì)上）為填料?？讖?5～50nm。②流動相：水溶性有機溶劑（B液）（甲醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃）＋水（A液）＋強酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸）洗脫能力增大加酸作用：∵－SiOH==－SiO-

＋H+

蛋白質(zhì)易與—SiO-結(jié)合極難洗脫，加酸抑制上述平衡向右離解。減小蛋白質(zhì)疏水性，使其保留減弱，易被洗脫。

多肽和蛋白質(zhì)類藥物第23頁③溫度：常溫色譜條件④檢測：用紫外檢測器，檢測波長280nm和220nm。280nm檢測中含有含苯環(huán)酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸蛋白質(zhì)，普通蛋白質(zhì)都含有苯環(huán)，所以280nm檢測是普遍使用波長。

220nm主要檢測肽鍵；所以全部蛋白質(zhì)普遍適用。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第24頁⑤洗脫方式：梯度洗脫——逐步增加洗脫強度。蛋白質(zhì)分離普通就需要用梯度洗脫，不然有些蛋白質(zhì)已到達突躍會很快被洗脫下來，有些蛋白質(zhì)還遠離突躍區(qū)，實際上無法被洗脫。而有機小分子反相色譜中未發(fā)覺此種突躍現(xiàn)象。實際工作中梯度洗脫時間約為20～60min，B液改變速度約為每分鐘5%～15%。色譜條件多肽和蛋白質(zhì)類藥物第25頁30μm15μm5μmInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffect多肽和蛋白質(zhì)類藥物第26頁應(yīng)用最大優(yōu)點：分離度最高；最大缺點：輕易使蛋白質(zhì)變性失活。例子：人膠原蛋白I型α1和α2鍵色譜分離多肽和蛋白質(zhì)類藥物第27頁3.3.2疏水相互作用色譜

概念：用適度疏水性配基作固定相，以鹽水體系作流動相，用疏水作用來分離生物大分子化合物液相色譜法，叫疏水相互作用色譜(HydrophobicInteractionChromatography,HIC)或疏水作用色譜。

多肽和蛋白質(zhì)類藥物第28頁在HIC中：固定相表面有疏水性基團，（如-CH2，-CH3

，-ph等）。蛋白質(zhì)分子是一個外部有親水層包圍，內(nèi)部有疏水核含有四級結(jié)構(gòu)復(fù)雜體系。蛋白質(zhì)表面親水性很強，但也有一些疏水性基團，同時團狀蛋白質(zhì)還存在疏水基團較多裂隙。分離原理多肽和蛋白質(zhì)類藥物第29頁分離原理在不一樣介質(zhì)中裂隙伸展和收縮程度不一樣，從而使疏水基團暴露多少也不一樣。疏水色譜是利用鹽水體系中樣品組分疏水基團和固定相疏水配基之間疏水作用力不一樣而到達分離目標(biāo)。

多肽和蛋白質(zhì)類藥物第30頁配基和蛋白質(zhì)分子之間吸附推進力和樣品組分洗脫機理（即：溶質(zhì)在色譜中保留行為）：“疏溶劑化理論”：蛋白質(zhì)與配基結(jié)合是因為溶質(zhì)分子有一個降低其與水接觸非極性表面傾向，它們在鹽水溶液中，兩個非極性表面趨向于避開水相而相互接觸。溶質(zhì)和疏水配基結(jié)合是伴伴隨它們非極性表面暴露在水中面積多少而進行。蛋白質(zhì)在鹽水體系中，有一傾向產(chǎn)生：避開水相而吸附在固定相上?！呱镂镔|(zhì)界面自由能比水低，與表面自由能低固定相產(chǎn)生親協(xié)力多肽和蛋白質(zhì)類藥物第31頁結(jié)論疏水作用色譜中，蛋白質(zhì)在固定相上保留性質(zhì)是四個可變原因綜合作用結(jié)果。這四個原因是：樣品分子、填料、流動相組成及性質(zhì)和溫度。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第32頁填料由基質(zhì)和鍵合在基質(zhì)上配基兩部分組成。（基質(zhì)＋配基）基質(zhì)：有“軟”、“硬”兩類，它們必須有25～100nm內(nèi)孔徑或有較大間隙網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（孔徑要大）。軟基質(zhì)：交聯(lián)瓊脂糖凝膠，交聯(lián)葡聚糖凝膠、高分子聚合物。硬基質(zhì)：主要是大孔徑硅膠。配基：是一些含氮和氧原子中等疏水性基團；

or是丁基、苯基這些疏水基團鍵合在一個親水性表面。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第33頁色譜條件主要有：a.含有中等疏水性表面填料；b.鹽析性鹽水溶液為流動相；c.紫外檢測器檢測，檢測波長220或280nm；d.流動相pH值靠近中性；e.由高鹽濃度到低鹽濃度梯度洗脫，梯度時間20～60min；f.常溫或4℃下操作。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第34頁1、流動相組成有A液和B液兩種。A液：疏水性濃鹽水溶液，并含有緩沖液作用鹽以穩(wěn)定pH值。慣用A液為1.0～3.0mol/L(NH4)2SO4加0.01～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液；B液：稀緩沖液，濃度與A液中緩沖作用鹽濃度相等。慣用B液為0.01～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液。鹽有兩類。鹽析性鹽：使蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定，會促進蛋白質(zhì)本身間疏水作用而析出，or促進蛋白質(zhì)與配基之間疏水作用而保留在柱上。不失活，溶解度減小。慣用：(NH4)2SO4鹽溶性鹽：提升蛋白質(zhì)水溶性，同時會使蛋白質(zhì)變性。如硫氰酸鹽、鹽酸胍等會。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第35頁2、流動相pH值：普通地pH4～8；常選pH7左右。

3、溫度

普通在常溫或低于常溫下操作。HIC中蛋白質(zhì)保留對溫度較敏感。①在HIC體系中蛋白質(zhì)處于活性狀態(tài)，

T↑使蛋白質(zhì)團狀結(jié)構(gòu)伸展，暴露出更多疏水基團，疏水作用增強，保留值增大。

（其它色譜，T↑保留增大）②T↑傳質(zhì)加緊，使保留減小。（對全部色譜均適用）

總之，在疏水色譜中，①比②大，∴T↑，保留增大。4、洗脫方式：梯度洗脫。（高濃度鹽→低濃度鹽）1、流動相組成多肽和蛋白質(zhì)類藥物第36頁疏水作用色譜應(yīng)用只用于生物大分子分離，不用于有機小分子分離。優(yōu)點：1、其色譜條件溫和，蛋白質(zhì)活性回收率高，普通都在85%以上。2、不用有毒和昂貴有機溶劑。3、分離性能好。4、高濃度鹽樣品能夠直接進疏水作用色譜柱進行分離。5、對生物工程產(chǎn)品粗品可直接上樣，一次完成蛋白質(zhì)初步分離、脫鹽和復(fù)性三個目標(biāo)。

多肽和蛋白質(zhì)類藥物第37頁比如：基因重組人干擾素r是一個基因工程產(chǎn)品，其粗品是7mol/L鹽酸胍溶液。干擾素在鹽酸胍溶液中處于可逆性失活狀態(tài)。因鹽濃度太高無法直接上其它柱，除去鹽酸胍后干擾素又輕易析出來。若使用疏水作用色譜柱，將此樣品直接進樣，既脫除了鹽酸胍，又到達了復(fù)性效果。而且一步分離后，干擾素純度可到達90%。IFN-r粗品HIC分離疏水作用色譜應(yīng)用多肽和蛋白質(zhì)類藥物第38頁疏水作用色譜與反相色譜區(qū)分相同：蛋白質(zhì)與填料之間保留是疏水力作用結(jié)果。區(qū)分：1）填料不一樣

HIC，表面中等疏水性作為配基；RPC，表面是烷基C4－8等疏水性強為配基。2）疏水力不一樣HIC，疏水作用較弱；RPC，強。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第39頁兩色譜中洗脫液主要成份不一樣（正是上面差異引發(fā)）∴在HIC中能夠加入少許有機溶劑以增強流動相洗脫能力；在RPC中加入鹽來改變蛋白質(zhì)保留值。疏水作用色譜與反相色譜區(qū)分多肽和蛋白質(zhì)類藥物第40頁3.3.3體積排阻色譜將分子按大小進行分離主要色譜技術(shù)；依據(jù)分離對象是水溶性化合物還是有機溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）凝膠過濾色譜普通用于分離水溶性大分子，如多糖類化合物。凝膠代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。凝膠滲透色譜法主要用于有機溶劑中可溶高聚物(聚苯乙烯等)相對分子質(zhì)量分布分析及分離，慣用凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機溶劑。

多肽和蛋白質(zhì)類藥物第41頁1、原理凝膠過濾色譜(GelFiltrationChromatographyGFC)又稱為分子排阻色譜(SizeExclusionChromatographySEC）原理見圖解。

凝膠過濾色譜多肽和蛋白質(zhì)類藥物第42頁凝膠過濾色譜多肽和蛋白質(zhì)類藥物第43頁2、凝膠過濾色譜優(yōu)點分離條件溫和，蛋白質(zhì)收率高，重現(xiàn)性好。分離分子量范圍廣。易于操作。3、凝膠過濾色譜缺點處理量小，時間長，效率低。凝膠過濾色譜多肽和蛋白質(zhì)類藥物第44頁凝膠過濾色譜填料傳統(tǒng)填料用是葡聚糖交聯(lián)凝膠，凝膠剛性不理想流速不快，尤其是前者壓力和鹽都會造成凝膠收縮，所以難提升流速，也不輕易制備成小顆粒高分辨率填料。新填料將葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠混合造粒，再經(jīng)過高度交聯(lián)制備出流速快、重復(fù)性好、分離效果更加好新型凝膠過濾填料，如superdex系列及瓊葡糖凝膠系列都是用這么。它比普通葡聚糖凝膠填料相比流速快，剛性好，顆粒均勻，沒有非特異吸附，裝填后體積不收縮，所以能夠在高流速下保持很好分離效果能夠制備成平均粒徑為34μm或13μm高效填料。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第45頁概念：利用離子交換樹脂作為吸附劑，將溶液中待分離組分，依據(jù)其電荷差異，依靠庫侖力吸附在樹脂上，然后利用適當(dāng)洗脫劑將吸附質(zhì)從樹脂上洗脫下來，到達分離目標(biāo)。3.3.4離子交換色譜多肽和蛋白質(zhì)類藥物第46頁離子交換樹脂結(jié)構(gòu)其結(jié)構(gòu)由三部分組成：不溶性三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成樹脂骨架，使樹脂含有化學(xué)穩(wěn)定性和機械強度；是與骨架相聯(lián)功效基團；是與功效基團帶相反電荷可移動離子，稱為活性離子，它在樹脂骨架中進進出出，就發(fā)生離子交換現(xiàn)象。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第47頁離子交換樹脂結(jié)構(gòu)-網(wǎng)絡(luò)骨架苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、環(huán)氧系多肽和蛋白質(zhì)類藥物第48頁離子交換樹脂結(jié)構(gòu)骨架：接有功效基團，本身是惰性功效基團：連接在骨架上，可與相反離子結(jié)合待交換分子：在吸附階段可與活性離子交換，與骨架上功效基團結(jié)合活性離子：與功效基團所帶電荷相反可移動離子多肽和蛋白質(zhì)類藥物第49頁活性離子為陽離子，稱陽離子交換樹脂，與陽離子發(fā)生交換活性離子為陰離子，稱陰離子交換樹脂，與陰離子發(fā)生交換多肽和蛋白質(zhì)類藥物第50頁離子交換法是經(jīng)過帶電溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換離子進行交換而到達分離純化方法。離子交換層析原理多肽和蛋白質(zhì)類藥物第51頁主要依賴電荷間相互作用，利用帶電分子中電荷微小差異而進行分離。選擇適當(dāng)條件可使一些溶質(zhì)分子變成離子態(tài)，經(jīng)過靜電作用結(jié)合到離子交換劑上，而另一些物質(zhì)不能被交換，這兩種物質(zhì)就可被分離。帶同種電荷不一樣離子雖都能夠結(jié)合到同一介質(zhì)上，但因為帶電量不一樣，與介質(zhì)結(jié)合牢度不一樣，改變洗脫條件可依次被洗脫而到達分離目標(biāo)。離子交換層析原理多肽和蛋白質(zhì)類藥物第52頁離子交換層析原理開始吸附解吸解吸結(jié)束再生①②④⑤③樣品解吸劑再生劑-----++-------多肽和蛋白質(zhì)類藥物第53頁離子交換色譜優(yōu)點1.處理量大，操作簡單。2.應(yīng)用廣泛。離子交換色譜缺點樣品要除鹽，分離效果不如親和和疏水色譜。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第54頁自學(xué)3.3.5膜蛋白色譜3.3.6高效置換色譜3.3.7貫流色譜多肽和蛋白質(zhì)類藥物第55頁1親合色譜原理AC是吸附色譜一個。但溶質(zhì)保留是一個特異有選擇性親協(xié)力。填料只是有選擇地對一個生物大分子或一類生物大分子有吸附，對其它物質(zhì)無吸附作用洗脫時先被分離，分段洗脫或梯度洗脫再將生物大分子從填料上洗脫下來，從而到達分離目標(biāo)。3.3.8親和色譜多肽和蛋白質(zhì)類藥物第56頁親合色譜原理親合色譜填料：是在基質(zhì)上鍵合一個特殊配基（配位體）制得。比如酶底物、產(chǎn)物、抑制劑、輔酶、變構(gòu)效應(yīng)物，抗物抗原，激素結(jié)合蛋白等都能夠作為配位體用于分離對應(yīng)酶，抗體和激素。有些配體能夠用于一類化合物吸附分離。如伴刀豆球蛋白能夠特異地吸附糖蛋白；三嗪染料作配基也會對一些蛋白質(zhì)有選擇性吸附。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第57頁配體與分離對象作用：是一個特異生物親協(xié)力，是配體與被吸物之間范德華力、疏水力、靜電力和其它力綜合作用結(jié)果。這種綜合作用力是有選擇性，只對一個或一類生物大分子起作用，對其它物質(zhì)不起作用。故AC選擇性很高。親合色譜原理多肽和蛋白質(zhì)類藥物第58頁填料（由基質(zhì)、間隔臂和配體三部分組成）多肽和蛋白質(zhì)類藥物第59頁AC填料基質(zhì)：分兩類。一類為有機聚合物，用得最多是多糖聚合物，如纖維素，交聯(lián)葡聚糖、交聯(lián)瓊脂糖等。還有聚丙烯酰胺也是一類慣用基質(zhì)。多糖基質(zhì)表面羥基密度大，易制得柱容大填料，而且其表面羥基對蛋白質(zhì)無非特異性吸附。但這類基質(zhì)機械強度低，不耐高壓。第二類是多孔玻璃和硅膠。這類基質(zhì)機械強度高，但柱容較小，表面硅羥基非特異性吸附難以完全克服。填料（由基質(zhì)、間隔臂和配體三部分組成）多肽和蛋白質(zhì)類藥物第60頁試驗技術(shù)1、裝柱柱子有玻璃柱和不銹鋼柱兩種。軟基質(zhì)填料裝在玻璃柱內(nèi)，用于常壓色譜。硅膠和多孔玻璃基質(zhì)填料可裝在不銹鋼柱內(nèi)用在高效液相色譜上。玻璃柱采取普通濕法裝柱，溶劑應(yīng)不損害配體活體，普通用緩沖溶液作分散劑來裝柱。不銹鋼柱普通采取勻漿法裝柱，但裝柱壓力要低一些。分散劑慣用親水醇類。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第61頁試驗技術(shù)2、洗脫方式AC最慣用洗脫方式是分段洗脫，還有脈沖洗脫和梯度洗脫。分段洗脫過程是：平衡柱子(平衡液)→上樣→平衡液洗滌→洗脫液洗下目標(biāo)蛋白→再生→平衡→第二次上樣脈沖洗脫是在平衡、上樣、洗滌后，用一段少許洗滌液讓其象一條密集脈沖帶流過柱子，以洗下某個特定蛋白。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第62頁3、流動相（有平衡液和洗脫液兩種）平衡液：起平衡柱子和上樣后洗去不吸附雜蛋白及其它雜質(zhì)作用。其成份是稀鹽緩沖溶液。洗脫液：是使吸附在柱子上蛋白質(zhì)解吸流動相。非特異性洗脫：利用洗脫液組成、濃度、pH值和溫度改變使蛋白質(zhì)與配體作用減弱而洗脫下來。特異性洗脫：利用一個對目標(biāo)蛋白質(zhì)也有親合作用游離配體使其與固定相上配體產(chǎn)生競爭作用把蛋白質(zhì)拉下來洗脫。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第63頁4、共價親合色譜是一個特殊AC。利用一個特殊配體，與待純化蛋白質(zhì)形成某種不太強共價健，將蛋白質(zhì)固定在柱子上。待洗去雜蛋白后，用適當(dāng)化學(xué)方法，將被固定蛋白質(zhì)重新釋放出來。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第64頁硫醇—二硫化物交換色譜

——能夠用來純化許多含硫醇蛋白質(zhì)

將谷胱甘肽[N2HCH(COOH)CH2CH2CONHCN(CH2SH)CONHCH2COOH]先鍵合到基質(zhì)上得到(結(jié)構(gòu)見右)。簡寫為：再與二吡啶基二硫化物反應(yīng)得到填料。含硫醇基蛋白質(zhì)可牢靠地固定在定固定相上，必須用含硫醇基洗脫液將其洗脫下來，柱子還得用二吡啶基二硫化物再生。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第65頁硫醇—二硫化物交換色譜多肽和蛋白質(zhì)類藥物第66頁5、其它色譜條件上樣體積流速溫度蛋白質(zhì)濃度影響6、柱子再生與保護再生：用洗脫液充分洗滌后即可再次進樣。不過重復(fù)使用幾次后對目標(biāo)蛋白吸附率常會降低。所以用2mol/LKCl加6mol/L尿素洗滌。保護：柱子平時應(yīng)保留在4℃。柱內(nèi)充滿稀緩沖溶液。為了預(yù)防細菌，液體可含萬分之二疊氮化鈉。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第67頁應(yīng)用親合色譜應(yīng)用于酶、蛋白質(zhì)等生物大分子分離純化。比如：α淀粉酶分離能夠使硅膠為基質(zhì)、淀粉為配體親合色譜柱來完成。以去離子水為平衡液，以0.15mol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH7.0作洗脫液，從工業(yè)粗酶中純化α淀粉酶，活性回收率為93.6%，純化后比活提升了20倍。柱子壽命為600次以上。吸附容量4.6mg/g填料。色譜圖見右圖。α淀粉酶親合色譜分離多肽和蛋白質(zhì)類藥物第68頁3.3.9電泳分離技術(shù)電泳：帶電粒子在電場作用下向著與其本身所帶電荷相反電極移動。電泳技術(shù)：樣品以一支持物為載體，在一定電解質(zhì)溶液中，各組分在電場作用下，以不一樣速度進行遷移，從而得到分離。電泳技術(shù)分類：按支持物不一樣，分為：凝膠電泳、紙上電泳和薄膜電泳等。按操作原理分為：普通電泳、等速電泳、等電聚焦電泳和免疫電泳等。對分離物要求：在介質(zhì)中必須帶電。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第69頁聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：不一樣帶電粒子在同一外加電場作用下泳動速度是不一樣，泳動度取決于帶電顆粒性質(zhì)，顆粒所帶凈電荷越多、直徑越小，越靠近球形、泳動速度越大。介質(zhì)pH值（蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，有一等電點，在不一樣pH值下所帶凈電荷符號及數(shù)量均不一樣，∴在電場中泳動速率也就不一樣了。）電場強度（電場強度越高，粒子泳動速度越快。）離子強度（介質(zhì)離子強度越大，粒子泳動越慢。普通在0.02～0.2之間。）電滲等試驗條件相關(guān)。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第70頁2、凝膠化學(xué)結(jié)構(gòu)由丙烯酰胺單體聚合成長鏈，長鏈之間用N,N-甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成多孔狀結(jié)構(gòu)?？状笮∧軌蛴秒p丙烯酰胺濃度來調(diào)整。濃度增大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)空隙（孔徑）減小。形

成

凝

膠

反

應(yīng)

式多肽和蛋白質(zhì)類藥物第71頁①含有很高分辨率。大小不一樣分子在經(jīng)過網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠空隙泳動時受到阻力不一樣，大分子物質(zhì)受到阻力比小分子大。這么就使聚丙烯酰胺凝膠電泳兼有分子篩和電泳雙重功效，提升了分辨力。②凝膠空隙大小可調(diào)整，以適應(yīng)不一樣分子量樣品。③聚丙烯酰胺凝膠電泳中電滲現(xiàn)象很小。④凝膠機械強度很好，彈性大，易保留。⑤丙烯酰胺純度高，不會污染樣品。3、丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)點多肽和蛋白質(zhì)類藥物第72頁4、連續(xù)與不連續(xù)平板凝膠電泳凝膠電泳分為：連續(xù)和不連續(xù)兩類。連續(xù)電泳：是指整個電泳系統(tǒng)所用緩沖液、pH值和凝膠組成都相同。不連續(xù)電泳：是指在電泳系統(tǒng)中采取了兩種或兩種以上緩沖液、pH值和凝膠。優(yōu)點：稀蛋白質(zhì)樣品在電泳過程中被濃縮，提升了分辨力。多肽和蛋白質(zhì)類藥物第73頁聚丙烯酰胺凝膠電泳慣用是平板電泳儀。裝置見下列圖連續(xù)(a)與不連續(xù)(b)平板凝膠電泳示意圖多肽和蛋白質(zhì)類藥物第74頁SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：是一個在緩沖液中加有SDS，而且樣品事先用含SDS溶液作解離處理電泳體系。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在過量SDS溶液中加熱時，天然蛋白質(zhì)球形狀態(tài)就變成線形。變性后蛋白質(zhì)，幾乎是定量地1克蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS，使蛋白質(zhì)亞基多肽帶上了大量負電荷。在電場中這種電荷密度相等粒子嚴(yán)格按照其分子大小含有不一樣流動度。樣品按多肽分子量大小分離，研究人員能夠用已知分子量樣品作對照測定未知物肽鏈大小。