食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座

概述生殖毒性是指外源化學(xué)物對雄性和雌性生殖功效或能力以及對后代產(chǎn)生不良效應(yīng)。生殖毒性既能夠發(fā)生于生殖細(xì)胞、受精卵、胚胎形成期，也可發(fā)生于妊娠、分娩和哺乳期。表現(xiàn)為外源化學(xué)物對生殖過程影響。影響人類生殖功效環(huán)境原因還包含各種化學(xué)物、電離和非電離輻射、物理原因、感染原因、生活方式以及藥品應(yīng)用等。第七章化學(xué)毒物生殖毒性食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第1頁一、雄性生殖細(xì)胞發(fā)生過程精子發(fā)生過程是指精原細(xì)胞發(fā)育成為成熟精子過程。精子發(fā)生過程始于胎兒期原始生殖細(xì)胞。出生后，原始生殖細(xì)胞分化成精原細(xì)胞，后者直至青春期以前再曲細(xì)精管中處于休止?fàn)顟B(tài)。在青春期，在腦垂體促性腺激素作用下，開始增殖，進行有絲分裂，形成兩個單倍體次級精母細(xì)胞，再經(jīng)第二次成熟分裂，形成四個單倍體精子細(xì)胞，精子細(xì)胞再經(jīng)過一系列形態(tài)學(xué)改變成為含有特殊形態(tài)成熟精子。隨即由間質(zhì)細(xì)胞包裹釋放入輸精管內(nèi)，移入附睪后深入成熟，成為含有受精能力和活動力精子，進入精囊并在此貯存。精子發(fā)生過程是在神經(jīng)內(nèi)分泌精密調(diào)控下進行。第一節(jié)雄性生殖毒性食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第2頁一、雄性生殖細(xì)胞發(fā)生過程表7-1外源化學(xué)物作用時間與精子發(fā)育階段受作用時精子發(fā)育階段從給藥到精子成熟經(jīng)歷時間/周小鼠大鼠輸精管和附睪內(nèi)精子11～2后期精細(xì)胞23次級精細(xì)胞34～5次級精母細(xì)胞46～8初級精母細(xì)胞56～8精原細(xì)胞69食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第3頁（一）對睪丸生精細(xì)胞影響1.棉酚長久食用粗制棉子油－睪丸生精上皮丟失－睪丸內(nèi)精子、精細(xì)胞和精母細(xì)胞受損－精子細(xì)胞頂體腫脹、分離與碎裂－精子中段線粒體螺旋鞘排列紊亂、嵴目降低－經(jīng)過葡萄糖和果糖代謝障礙抑制精子活力－精子降低、不育2.工業(yè)污染物二硫化碳－睪丸損害、精子生產(chǎn)障礙3.鉛、鎘、汞、錳等重金屬－精子降低4.各種農(nóng)藥－精子降低、畸形、性功效減退二、外源化學(xué)物雄性生殖毒性食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第4頁（二）對內(nèi)分泌功效影響睪丸功效受垂體前葉分泌促性腺激素調(diào)整，而垂體分泌促性腺激素又受下丘腦產(chǎn)生促性腺釋放激素調(diào)整。精子生成是在神經(jīng)分泌精密調(diào)整和控制下進行。重金屬鉛可干擾下丘腦－垂體－睪丸軸正常功能，主要是影響促性腺釋放激素（GnRH）釋放，表現(xiàn)為卵泡刺激素（FSH）、黃體生成激素（LH）、睪酮含量降低。最終造成精子降低，活力減弱，性欲減退等。二硫化碳亦可造成睪酮降低、精子生成障礙等。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第5頁（三）對性功效和生殖功效影響外源化學(xué)物（化學(xué)毒物）假如造成生殖系統(tǒng)任何一個步驟異常，則表現(xiàn)出雄性不育，即雄性性功效障礙。如鉛、鎘、汞、錳等重金屬。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第6頁（一）精子生成份析（1）精子計數(shù)－數(shù)目降低許－確定有沒有毒害作用發(fā)生（2）精子形態(tài)觀察－頭尾部形態(tài)改變（3）精子狀態(tài)分析試驗－靜夜pH、液化時間，精子運動能力，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和微量元素含量等－是否與外源化學(xué)物相關(guān)三、雄性生殖毒性檢測方法（二）精子穿透試驗即精子體外受精試驗，是檢測精子在體外能否成功穿透去透明帶金黃地鼠卵子而受精試驗，為綜合評價外源化學(xué)物對人類精子受精能力影響、探明雄性不育提供科學(xué)依據(jù)。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第7頁（三）睪丸中標(biāo)志酶活性測定臨床和動物試驗中常檢測乳酸脫氫酶同工酶x、山梨醇脫氫酶、6－磷酸葡萄糖脫氫酶改變，并結(jié)合精子生成過程中各階段細(xì)胞功效和形態(tài)學(xué)改變，即可評價外源化學(xué)物生殖毒性，并有可能探明毒性作用部位和機理。（四）體外試驗體外試驗主要是將哺乳動物生殖細(xì)胞在體外條件下進行培養(yǎng)，并與受試外源化學(xué)物接觸，觀察生殖細(xì)胞改變。經(jīng)過支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等體外分離培養(yǎng)，測定支持細(xì)胞乳酸含量和乳酸脫氫酶活性改變以及測定間質(zhì)細(xì)胞分泌雄激素含量來判斷外源化學(xué)物是否對所培養(yǎng)細(xì)胞功效有影響。亦可分離上述細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞計數(shù)和形態(tài)學(xué)檢驗方法來判斷。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第8頁（五）雄性激素檢測雄性生殖系統(tǒng)不論生精過程、精子成熟過程，還是從屬性腺分泌活動，都需要有足夠睪酮，經(jīng)過檢測FSH、LH和睪酮含量改變來判斷外源化學(xué)物是否對雄性生殖產(chǎn)生影響。檢測上述三種性激素含量有利于生殖毒性評價以及生殖毒作用機制探討。（六）顯性致死試驗顯性致死試驗是經(jīng)過給予雄性動物受試化學(xué)物，將其與未經(jīng)受試物處理雌性動物交配，觀察雌性動物早期胚胎死亡情況，以評價受試物是否對雄性動物生殖有損害作用試驗。本方法系采取哺乳動物進行試驗，較靠近人體實際情況，主要觀察指標(biāo)為胚胎早期死亡，即觀察子宮中活胎、死胎及吸收胎等書目，易于觀察，試驗技術(shù)輕易掌握，不需要復(fù)雜試驗條件。缺點是不夠靈敏。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第9頁（七）雄性生殖細(xì)胞遺傳毒性檢測傳統(tǒng)檢測方法：小鼠睪丸染色體畸變分析試驗、小鼠精子畸變分析試驗、黑腹果蠅染色體性陰性分析試驗新方法：單細(xì)胞凝膠電泳試驗（彗星試驗）原理：細(xì)胞在體內(nèi)和體外試驗中受化學(xué)物作用后，DNA鏈發(fā)生斷裂。將細(xì)胞制成單細(xì)胞混懸液，在載玻片上制備加有受檢細(xì)胞混懸液凝膠，載堿性條件下使細(xì)胞裂解，解旋DNA后進行電泳。帶負(fù)電荷DNA斷裂端由陰極向陽極遷移。DNA經(jīng)EB染色后在熒光顯微鏡下可觀察到DNA受損細(xì)胞核拖一條尾巴，呈彗星狀，如DNA無損傷則見圓形核。（八）雄性生殖毒性病理檢驗睪丸、附睪、前列腺已經(jīng)精囊重量和大小改變常是接觸有害化學(xué)物顯著特征。睪丸組織易受外來化學(xué)毒物侵害，所以在亞慢性或慢性動物毒性試驗中，睪丸組織形態(tài)檢驗是一項主要觀察指標(biāo)。解剖觀察是生殖病理檢驗主要步驟，是雄性生殖毒理學(xué)研究中不可缺乏較為敏感指標(biāo)和主要伎倆。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第10頁一、雌性生殖細(xì)胞發(fā)生過程雌性生殖系統(tǒng)由卵巢、輸卵管、子宮和外生殖器等組成。卵泡（包含卵細(xì)胞、包裹顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞）發(fā)育是一個連續(xù)改變過程，普通可分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡四個階段。卵巢周期性改變育動情周期親密相關(guān)。初級卵母細(xì)胞深入成熟并發(fā)育至次級卵母細(xì)胞，需垂體下葉分泌FSH和LH作用。第二節(jié)雌性生殖毒性食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第11頁（一）對卵細(xì)胞影響研究表明，卵細(xì)胞發(fā)育到排卵前階段即第一次減數(shù)分裂終變期和中期對化學(xué)毒物最敏感。如鎘，NIH雌性小鼠皮下一次注射氯化鎘1、3、6mg/kg后，排卵能力顯著受抑制，排卵數(shù)目隨劑量增加而降低，呈顯著劑量－反應(yīng)關(guān)系。鎘可能直接進入到卵細(xì)胞內(nèi)并損傷其遺傳物質(zhì)。鎘－－金屬硫蛋白中Zn2+二硫化碳不但對各種動物睪丸有毒性作用，而且對雌性動物性腺、胚胎也有損害作用，可影響卵巢，使動物動情周期發(fā)生改變，受孕能力降低，影響受精卵和胚胎正常發(fā)育。……二、外源化學(xué)物雌性生殖毒性食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第12頁（二）對內(nèi)分泌功效影響卵巢功效和生殖周期受體內(nèi)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)整，即經(jīng)過下丘腦－垂體－性腺軸。外源化學(xué)物可影響上述任何一個步驟而對雌性生殖產(chǎn)生損害作用。苯及其同系物在一定劑量下會造成雌性生殖功效損害，該類化學(xué)物直接干擾下丘腦，作用于垂體－卵巢系統(tǒng)，使內(nèi)分泌調(diào)整系統(tǒng)異常，而造成月經(jīng)異常，同時抑制卵巢功效使絕經(jīng)期改變。林丹、開蓬等有機氯農(nóng)藥，可使雌性動物陰道開啟和排卵周期延遲，甚至停頓排卵，以及死胎和自然流產(chǎn)等。（三）其它毒性作用亦可表現(xiàn)在子代，造成畸形、死胎、功效發(fā)育不全等。各種生殖功效毒性作用在整個生命過程不一樣階段都可出現(xiàn)，這充分說明雌性生殖毒性復(fù)雜性。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第13頁三、雌性生殖毒性檢測方法（一）體外試驗（書上表7-2）體外試驗對于說明化學(xué)毒物毒性作用機理含有重要意義。但當(dāng)前尚不能完全替換整體動物試驗。（二）動物試驗整體動物試驗仍為主要評價方法，慣用方法有兩類：一類為一代繁殖試驗或多代繁殖試驗和致畸試驗；另一類為三階段生殖試驗。（三）其它輔助試驗雌性動物動情周期觀察、排卵觀察、雌激素水平測定、病理組織學(xué)測定等。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第14頁第三節(jié)致畸試驗?zāi)芤l(fā)妊娠人或試驗動物產(chǎn)生畸胎外源化學(xué)物稱為致畸物。它經(jīng)過胎盤直接作用于發(fā)育胚胎和胎兒而產(chǎn)生后果。經(jīng)過動物試驗和體外致畸試驗方法，可檢測外源化學(xué)物能否引發(fā)胚胎毒性或后代畸形。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第15頁一、動物致畸試驗（1）（一）基本原理致畸試驗是檢驗受試外源化學(xué)物能否經(jīng)過妊娠母體引發(fā)毒性或后代畸形動物試驗。經(jīng)過致畸試驗?zāi)軌虼_定一個受試物是否含有致畸作用。胚胎在器官形成期，可因受到化學(xué)物或放射性物質(zhì)作用，使細(xì)胞分化、器官形成和正常發(fā)育收到阻滯，以致出現(xiàn)胎仔器官器質(zhì)性缺點而展現(xiàn)畸形。所以，能夠經(jīng)過觀察妊娠母體在敏感期接觸受試物后胚胎及胎仔發(fā)育情況來評價某種外源化學(xué)物有沒有致畸作用。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第16頁一、動物致畸試驗（2）（二）基本方法（1）動物選擇－參考毒性試驗中選擇動物普通標(biāo)準(zhǔn)及妊娠期較短而一致、產(chǎn)仔數(shù)多、胎盤結(jié)構(gòu)與人類靠近、自發(fā)畸形率較低－－大鼠＋小鼠/家兔（2）動物交配處理（3）劑量分組（關(guān)鍵）－要求出最大無作用劑量以及引發(fā)致畸閾劑量、且要保持母體生育能力（4）動物剖檢－預(yù)期分娩前1～2d處死母體（防自食）（5）胎仔檢驗（三）結(jié)果判定方法在致畸試驗結(jié)果評定時，主要計算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)。在計算畸胎總數(shù)時，每一活胎仔出現(xiàn)一個或一個以上畸形均作為一個畸胎。在計算畸形總數(shù)時，同一胎仔出現(xiàn)一個畸形作為一個畸形計算，出現(xiàn)兩種或兩個畸形，則作為兩個畸形計算，依這類推。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第17頁二、體外致畸作用試驗體外致畸試驗方法很多，主要有體外全胚培養(yǎng)、器官培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)三個層次試驗。體外致畸試驗優(yōu)點是：1）能夠節(jié)約大量人類和時間，方法快速；2）可利用人類血清、尿液進行試驗，便于直接觀察受試物對接觸人群作用；3）可利用單加氧酶或線粒體等酶觀察外源化學(xué)物在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化過程對其致畸作用以及發(fā)育毒性影響；4）輕易嚴(yán)格控制試驗條件，有可能排除母體中一些其它干擾因子和母體對致畸原影響，有利于致畸作用劑量探討。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第18頁第四節(jié)繁殖試驗繁殖試驗?zāi)繕?biāo)在于了解外源化學(xué)物對機體整個生殖過程以及對子代是否產(chǎn)生毒性作用。經(jīng)過繁殖試驗即可了解外源化學(xué)物對動物性功效、交配行為、受精能力、分娩、授乳等過程影響。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第19頁一、試驗方法（1）（一）試驗動物多項選擇取健康剛斷乳大鼠。每組用20只雌鼠，10只雄鼠。（二）染毒劑量及分組設(shè)對照組、高劑量組（為90d或長久毒性試驗最大無作用劑量）、低劑量組（能夠采取最大無作用劑量1/30或人類可能攝入量100倍）。必要時增設(shè)中間劑量組。接觸路徑與人類實際接觸路徑相同。（三）試驗步驟試驗動物按設(shè)計劑量先給予受試物90d，性成熟后即可按常規(guī)方式交配，所生仔鼠為第一代（F1）。每代交配兩次，第一次生仔（F1a）斷乳后10d再使親代進行第二次交配，生仔為（F1b）。即第一代為F1a和F1b。其余各代依這類推。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第20頁二、觀察指標(biāo)（1）交配指數(shù)（2）受精指數(shù)（3）受孕率（4）正常分娩率（5）活產(chǎn)率（6）妊娠率（7）出生存活率（8）哺乳存活率三、結(jié)果判定將試驗組動物各項觀察指標(biāo)統(tǒng)計結(jié)果與對照組動物進行比較，乳試驗動物在交配、妊娠、幼仔存活、幼仔發(fā)育（培育）等方面收到影響，則說明受試物對動物繁殖功效有損害作用。食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第21頁第五節(jié)胚胎毒性－胎兒動脈管畸形研究方法（1）胚胎毒性作用指外源化學(xué)物對母體子宮內(nèi)發(fā)育胚胎或胎兒產(chǎn)生毒性作用。由外源化學(xué)物引發(fā)胚胎毒性詳細(xì)表現(xiàn)在以下幾個方面：（1）胚胎死亡（危害最大）（2）生長發(fā)育遲緩（3）胎兒先天缺點和畸形（危害大，研究重點）（4）功效發(fā)育不全食品毒理學(xué)化學(xué)毒物的生殖毒性專家講座第22頁第五節(jié)胚胎毒性－胎兒動脈管畸形研究方法（2）胎兒動脈管是直接把胎兒肺動脈連接到大動脈輔助通路。是在母體內(nèi)見不到獨特血管。在胎生期內(nèi)動脈管負(fù)擔(dān)著主要循環(huán)作用。動脈管伴隨妊娠末期靠近，漸漸增大其內(nèi)徑，胎兒出生后，伴隨肺呼吸開始，動脈管又引發(fā)收縮閉鎖，以索狀組織殘余在體內(nèi)。