大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座

大腸桿菌基因工程—人胰島素生產(chǎn)講述人599小組組員.11.7大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第1頁(yè)目錄1.利用重組大腸桿菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白或多肽2.胰島素生產(chǎn)方法3.產(chǎn)人胰島素大腸桿菌工程菌構(gòu)建策略大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第2頁(yè)利用重組大腸桿菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白或多肽因?yàn)榇竽c桿菌繁殖快速價(jià)格低廉，培養(yǎng)代謝易于控制，所以重組大腸桿菌在醫(yī)用蛋白大規(guī)模生產(chǎn)中含有主要經(jīng)濟(jì)意義。盡管有些生物活性嚴(yán)格依賴于糖基化作用真核生物功效蛋白無(wú)法用重組大腸桿菌進(jìn)行生產(chǎn)，蛋白質(zhì)生物合成后加工系統(tǒng)缺乏使得一些人體蛋白難以折整天然構(gòu)象，但仍有100各種異源蛋白經(jīng)過(guò)大腸桿菌基因工程菌實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包含一些結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜人體蛋白，如富含半胱氨酸血清清蛋白（HSA）、尿激酶原（pro-UK）、金屬硫蛋白（MT）、二硫鍵共價(jià)交聯(lián)二聚體蛋白巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）以及四聚體血紅蛋白(Hb）等。此次以重組人胰島素為例，敘述利用大腸桿菌生產(chǎn)外源基因表示產(chǎn)物基本過(guò)程。大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第3頁(yè)胰島素生產(chǎn)方法

人胰島素是一個(gè)由兩條多肽鏈(A鏈和B鏈)組成蛋白質(zhì)。胰島素合成時(shí)，最初在胰島B細(xì)胞內(nèi)附著核糖體上形成是一條單鏈多肽———前胰島素原，其進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后，信號(hào)肽酶切除信號(hào)肽形成胰島素原，后者被運(yùn)輸至高爾基體，在高爾基體中切除連接序列(C鏈)形成A鏈和B鏈，然后經(jīng)過(guò)二硫鍵將二者結(jié)合形成有生物活性胰島素。

工業(yè)上可采取以下四種方法大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素：（1）從人胰中直接提取胰島素；（2）由單個(gè)氨基酸直接化學(xué)合成；（3）由豬胰島素化學(xué)轉(zhuǎn)型為人胰島素；（4）利用基因工程菌大規(guī)模大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)重組人胰島素。大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第4頁(yè)產(chǎn)人胰島素大腸桿菌工程菌構(gòu)建策略大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第5頁(yè)1

A鏈和B鏈編碼區(qū)由化學(xué)合成，兩個(gè)雙鏈DNA片段分別克隆在含有Ptac開啟子和β-半乳糖苷酶基因表示型質(zhì)粒上，后者與胰島素編碼序列形成雜合基因，其連接位點(diǎn)處為甲硫氨酸密碼子。重組分子分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細(xì)胞，兩種克隆菌分別合成β-半乳糖苷酶-人胰島素A鏈以及β-半乳糖苷酶-人胰島素B鏈兩種融合蛋白。經(jīng)大規(guī)模發(fā)酵后，從菌體中分離純化融合蛋白，再用溴化氫在甲硫氨酸殘基C端化學(xué)切斷融合蛋白，釋放出人胰島素A鏈和B鏈。胰島素AB鏈分別表示法基本原理AB鏈分別表示法大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第6頁(yè)2人胰島素原表示法即使上述工藝路線并不比AB鏈分別表示更為簡(jiǎn)捷，而且需要額外使用兩種高純度酶制劑，但因?yàn)槠潴w外折疊成功率相當(dāng)高，在一定程度上填補(bǔ)了工藝繁瑣缺點(diǎn)，使得產(chǎn)品生產(chǎn)成本僅為50美元/g。

將人胰島素原cDNA編碼序列克隆在β-半乳糖苷酶基因下游，兩個(gè)DNA片段連接處仍為甲硫氨酸密碼子。該雜合基因在大腸桿菌中高效表示后，分離純化融合蛋白，并一樣采取溴化氫化學(xué)裂解法回收人胰島素原片段，然后將之進(jìn)行體外折疊。因?yàn)镃肽存在，胰島素原在復(fù)性條件下能形整天然空間構(gòu)象，為3對(duì)二硫鍵正確配對(duì)提供了良好條件，使得體外折疊率高達(dá)80%以上。為了取得含有生物活性胰島素，經(jīng)折疊后人胰島素原分子必須用胰蛋白酶特異性切除C肽，可取得完整A鏈以及C端帶有精氨酸ArgB鏈。大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第7頁(yè)AB鏈同時(shí)表示法

這種方法基本思緒是將人胰島素A鏈和B鏈編碼序列拼接在一起，然后組裝在大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因下游。重組子表示出融合蛋白經(jīng)溴化氫CNBr處理后，分離傳話A-B鏈多肽，然后再依據(jù)兩條鏈連接處氨基酸性質(zhì)，采取對(duì)應(yīng)裂解方法取得A鏈和B鏈肽段，最終經(jīng)過(guò)體外折疊制備含有活性重組人胰島素。與第一個(gè)方法相同，其最大缺點(diǎn)仍是體外折疊正確率較低，所以當(dāng)前還未進(jìn)入應(yīng)用階段。3大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第8頁(yè)

上述三種工程菌構(gòu)建路線均采取胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因拼接方法，所生產(chǎn)融合型重組蛋白表示率高，且穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，主要以包含體形式存在與細(xì)胞內(nèi)。一個(gè)能促進(jìn)融合蛋白分泌工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列插入到表示型質(zhì)粒β-內(nèi)酰胺酶基因下游，后者所編碼是降解青霉素酶蛋白，通常能被大腸