瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)

瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第1頁(yè)血涂片檢驗(yàn)瘧原蟲是診療和判定瘧原蟲種別主要方法，也是瘧疾流行病學(xué)調(diào)查主要個(gè)別，血涂片制作和染色好壞足以影響檢驗(yàn)結(jié)果，必須把握好“三關(guān)”。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第2頁(yè)

玻片清潔。清潔玻片無油脂，無劃痕，無灰塵，玻片上有油跡，使厚血膜輕易脫落，薄血膜涂布不均勻。在用手指持玻片時(shí)，只能夾持玻片兩側(cè)邊緣，不要接觸玻片表面，以防止手指上油污染玻片。一、玻片清潔瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第3頁(yè)

新載玻片先用熱肥皂水洗滌，再用清水沖洗，然后用軟而潔凈毛巾擦干待用。(一)新載玻片洗滌瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第4頁(yè)①5%肥皂水煮沸法：

將洗衣肥皂削成小片，加水配成約5%肥皂水，煮沸后將玻片一張一張地平放進(jìn)肥皂水內(nèi)，微火煮約一刻鐘，然后滅火待肥皂水稍冷后，將潔干毛巾擦凈后待用。(二)使用過載玻片清潔方法有兩種：瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第5頁(yè)②清潔液浸泡法：清潔液配制以下：重鉻酸鉀80g濃硫酸100ml水(清凈水)1000ml瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第6頁(yè)

配制時(shí)須先將重鉻酸鉀研細(xì)放入水中，慢慢加溫到全部溶解為止，然后緩緩加入濃硫酸，待溶液冷卻后倒入有蓋大口玻璃缸內(nèi)。清潔玻片時(shí)，將待洗玻片逐張放入清潔中浸泡一兩天后，取出清水沖洗至完全沒有黃色為止。浸泡前最好用二甲笨除去鏡油，清潔液顏色變?yōu)槟G色后即失去清潔作用，不能再用。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第7頁(yè)二、制片1.薄血膜涂制2.厚血膜涂制薄血膜厚血膜標(biāo)識(shí)處瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第8頁(yè)1.薄血膜涂制：1.薄血膜涂制(1)先用75%酒精棉球?qū)⒍瓜?，待酒精干后用采血針快速刺入耳垂近下端邊緣處?2)用左手拇指與食指以及右手中指向相正確方向?qū)⒍馆p輕擠壓出血。(3)取一張潔凈載玻片，將它左1/3表面接觸耳垂上血滴（不要將玻片接觸耳垂上皮膚），使一小滴血在玻片上。血量1-1.5mm3.1/4火柴頭大小。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第9頁(yè)(4)將推片置于血溶之前與血液相接觸，待血液沿推片邊緣展開后，將推片與載玻片保持30角度，用力均勻快速將推片由右向左推出而制成薄血膜。涂制得很好薄血膜只有一層血球，血球分布排列比較均勻，血膜末端突出如舌狀。若取血滴太大，則涂制血膜太寬太厚；若推時(shí)用力不均勻，則易成梯田狀.

若用力太大，則血膜兩端過厚，若涂片上有油污，則血膜成多孔狀。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第10頁(yè)

薄血膜涂好后，再輕擠耳垂擠出約火柴頭大一血滴，將這一滴血滴在玻片中心1/3處然后用推片一角由血滴中央向周圍旋轉(zhuǎn)涂成直徑約一厘米圓形血膜，旋轉(zhuǎn)涂制時(shí)間不宜過短，以免形成纖維蛋白束，遮蓋了瘧原蟲。

厚血薄涂好后，應(yīng)平放待干，防蒼蠅舔食血膜或灰塵落在上面。受檢者編號(hào)可用鉛筆或鋼筆寫在薄血膜邊緣上，也可用蠟筆寫在厚血膜一端。2.厚血膜涂制瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第11頁(yè)血片制作和染色質(zhì)量規(guī)范

項(xiàng)目血膜好中差血片制作

厚血量位置直徑外觀4.0～5.0mm3玻片右1/38～1.0cm圓形厚膜均勻，邊緣整齊略多或略少稍偏右0.7～0.8或1.0～1.2cm圓形稍不均不整齊過多或過少偏右過多＜0.7或＞1.2cm厚薄不勻影響著色薄血量位置長(zhǎng)寬外觀1.5～2.0mm3玻片1/2～1/3處1.5×2.0cm舌狀厚薄均勻略多或略少稍偏右或偏左稍大或稍小舌狀稍不勻過多或過少偏右或偏左過多過大或過小厚薄不勻呈波浪型染色外觀鏡下蘭紫色白細(xì)胞瘧原蟲漿呈蘭色，核深紅深蘭色胞漿淡蘭或深蘭，核紅色紅色或灰白色胞漿不易見，核淡紅或蘭色清潔度外觀鏡下光潔無油灰無沉渣稍有油污稍有沉渣油灰粘連沉渣多或有雜菌瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第12頁(yè)血片制作和染色質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)1.血片制作質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血膜中。中：薄血膜中，厚血膜好或中。差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第13頁(yè)2.血片制作和染色合格率要求：分別以血片制作、染色和清潔度好、中、差合并計(jì)算合格率。(1)血片制作合格率應(yīng)在85%以上。(2)染色合格率應(yīng)在85%以上。(3)清潔度合格率應(yīng)在80%以上。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第14頁(yè)三、染色常見染色方法有姬姆薩氏和瑞氏兩種(一)吉氏染色法：吉氏染劑是最可靠血膜染劑，其優(yōu)點(diǎn)是易于掌握極少染色過分，染好后血膜褪色較慢.

瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第15頁(yè)吉氏染劑粉0.5g甘油（中性）25ml甲醇（純，分析純）25ml將吉氏染劑粉0.5置于乳缽中，加少許甘油充分研磨，再加甘油研磨，直至25ml甘油加完為止。將充分研磨吉氏甘油液倒入無水，潔凈棕色玻塞瓶中，然后分次加甲醇于乳缽洗出染劑倒入瓶中，直至25甲醇將乳缽洗凈并全部倒入瓶中，塞緊，充分搖勻，放置室內(nèi)一星期，天天搖動(dòng)數(shù)次，以后即可使用.1.吉氏染劑配制：瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第16頁(yè)

為了確保染色良好，使瘧原蟲紅核和蘭胞漿分明，感染紅血球上薛氏小點(diǎn)清楚，在稀釋染劑原液時(shí)，所用蒸餾水必須加緩沖液（緩沖蒸餾水）。新鮮蒸餾水可能靠近中性，但貯存在一個(gè)時(shí)期后，因?yàn)槲樟丝諝庵卸趸级優(yōu)樗嵝?，所以蒸餾水中必須加緩沖液，使其到達(dá)咱們需要酸堿度。

2.緩沖液配制;瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第17頁(yè)

磷酸氫二鈉（無水）9.5g

蒸餾水1000ml

磷酸二氫鉀9.07g

蒸餾水1000ml

將上二液分別貯存于緊塞玻瓶中。

緩沖液配制：瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第18頁(yè)稀釋染劑所用蒸餾水ph以7.0-7.2為最適宜，現(xiàn)用現(xiàn)配，可按下表配制：緩沖蒸餾水配制（ml）

ph磷酸二氫鈉液磷酸二氫鉀液蒸餾水6.6

37

63

9006.8

49

51

9007.0

63

37

9007.2

73

27

9007.4

81

19

900在無條件地方，此時(shí)也可用當(dāng)?shù)仫嬘盟蠓羞^濾后試染，試染結(jié)果如淋巴細(xì)胞胞漿呈蘭色紅血球染色不很蘭就可使用。

瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第19頁(yè)3.染色步驟：①固定：用吉氏染液染色須先將薄血膜用甲醇或無水酒精固定。滴于薄血膜上，也可用玻棒沾取甲醇涂在薄血膜上，防止甲醇流至厚血膜，誤將其固定，可用蠟筆劃一條線，或者是斜放玻片，玻片上甲醇蒸發(fā)干后即可染色。②溶解血紅蛋白，在厚血膜上加2-3滴蒸餾水，待血紅蛋白充分溶解后傾去玻片上水，待血膜干后即可染色。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第20頁(yè)③染色：快染：5：1(20%)，5滴水，1滴染液(原液)，染5分鐘清水沖洗即成。慢染：20：1(5%)，20滴水，1滴染液(原液)，染30分鐘用清水沖洗。待片水干后鏡檢。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第21頁(yè)(二)瑞氏染色法：瑞氏染色法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便快速，缺點(diǎn)是染液在熱環(huán)境中易變質(zhì)，且染色時(shí)間不易掌握，血膜上有染劑沉淀；用本法染色血膜退色較快，不宜作長(zhǎng)久保留標(biāo)本。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第22頁(yè)

瑞氏染劑粉0.2g

甘油(中性)3ml(無中性也可)

甲醇(中性)97ml

將瑞氏染粉放入乳缽中，加入甘油充分研磨，然后加入甲醇10ml，混合后倒入干燥、清潔棕色玻璃瓶?jī)?nèi)，分次將甲醇倒入乳缽內(nèi)，至乳缽內(nèi)染劑洗凈為止，配制好染液充分搖勻即可使用。1.瑞氏染劑配制瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第23頁(yè)（1）先用蠟筆在厚薄血膜間劃一界限，然后用緩沖蒸留水滴2-3滴在已干厚血膜上，溶血后傾去水滴。

（2）加瑞氏染液5-8滴于薄血膜上，染色1-2分鐘。

（3）加5-8滴緩沖蒸留水于薄血膜上，用吸管混合均勻后把染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同時(shí)染色約10分鐘。

（4）用清水輕輕沖去染液，將玻片直立待干后鏡檢2.染色步驟瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第24頁(yè)四、鏡檢(1)間日瘧原蟲薄血片形態(tài)①被寄生紅細(xì)胞形態(tài)改變大?。猴@著脹大色澤：褪色斑點(diǎn)：紅色薛氏小點(diǎn)，細(xì)小數(shù)目多，重復(fù)感染：不多見瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第25頁(yè)②小滋養(yǎng)體胞漿：淡藍(lán)色，較大，稍粗厚，有一個(gè)空泡。核：紅色，通常一個(gè)，圓形。體積：較大，約占紅細(xì)胞直徑三分之一。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第26頁(yè)③大滋養(yǎng)體胞漿：阿米巴樣，含數(shù)個(gè)空泡，體積較大，淺藍(lán)色核：一個(gè)，呈點(diǎn)狀或桿狀，瘧色素：短桿狀，細(xì)小，棕黃色瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第27頁(yè)胞漿：阿米巴樣，體積很大，空泡甚小或消失，蘭色核：2-10個(gè)團(tuán)塊，不規(guī)則，瘧色素：細(xì)桿狀，棕黃色，分布不均勻④早期裂殖體瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第28頁(yè)⑤裂殖體裂殖子：12-24個(gè)，多為16-18個(gè)，排列不規(guī)則，瘧色素：棕黃色，常集中于一側(cè)。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第29頁(yè)

形狀：圓形，較小胞漿：淡蘭色，核：疏松，較大，常位于中央瘧色素：棕色，桿狀，均勻散在，⑥小配子體瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第30頁(yè)⑦大配子體形狀：圓形，較大胞漿：深蘭色核：致密，位于一側(cè)瘧色素：棕黃色，均勻散在，數(shù)很多。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第31頁(yè)(2)間日瘧厚血片形態(tài)①小滋養(yǎng)體胞漿：大多呈“感嘆號(hào)”，“問號(hào)”，飛鳥等形狀。核：較大，多數(shù)是一個(gè)，瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第32頁(yè)

間日瘧大滋養(yǎng)體相當(dāng)大，形狀不一，改變很多，胞漿蘭色，分散斷裂成為大小數(shù)目不等、邊緣不清楚圓塊，這是間日瘧原蟲大滋養(yǎng)特征，核一個(gè)，大而顯著，呈不整齊圓形，位于胞漿中央或邊緣。瘧色素短桿狀，棕黃色，分布于胞漿上中。②大滋養(yǎng)體瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第33頁(yè)

胞漿多，形態(tài)改變很大，有分布斷裂成塊現(xiàn)象，核分裂成數(shù)個(gè)，較大，呈圓形或不規(guī)則圓形，零亂地分布在胞漿中，棕黃色短桿狀瘧色素較多。

③裂殖體前期瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第34頁(yè)瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第35頁(yè)

胞漿多，形態(tài)改變很大，有分布斷裂成塊現(xiàn)象，核分裂成數(shù)個(gè)，較大，呈圓形或不規(guī)則圓形，零亂地分布在胞漿中，棕黃色短桿狀瘧色素較多。

③裂殖體前期瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第36頁(yè)裂殖子12-24個(gè)不等，色素集中，位于中央或一側(cè)。④成熟裂殖體瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第37頁(yè)

間日瘧原蟲配子體很大，幾乎同中性白細(xì)胞一樣大小，胞漿完整致密呈圓形或橢圓形，雌雄配子體形態(tài)與薄片上形態(tài)完全相同，配子體有時(shí)易與晚期滋養(yǎng)體相混同，但配子體胞漿比較固實(shí)，色素顆粒多而分散并有沿邊緣分布現(xiàn)象。⑤配子體瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第38頁(yè)間日瘧雄配子體間日瘧雌配子體瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第39頁(yè)1惡性瘧原蟲薄血膜--環(huán)狀體環(huán)纖細(xì),約為RBC直徑1/5核1個(gè)，但2個(gè)常見紅細(xì)胞常含2個(gè)以上原蟲蟲體常位于紅細(xì)胞邊緣，呈“鳥飛狀”瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第40頁(yè)2惡性瘧原蟲—大滋養(yǎng)體

普通不出現(xiàn)在外周血體小堅(jiān)固，圓形，不活動(dòng)瘧色素集中一團(tuán)，黑褐色原蟲此時(shí)開始集中在內(nèi)臟毛細(xì)血管瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第41頁(yè)3惡性瘧早期裂殖體瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第42頁(yè)4惡性瘧原蟲成熟裂殖體

裂殖子8～36個(gè)，通常18～24個(gè)，排列不規(guī)則瘧色素集中成一團(tuán)蟲體占紅細(xì)胞體積2／3至3／4瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第43頁(yè)5惡性瘧原蟲雌配子體新月形，兩端較尖核致密，深紅色，常位于中央瘧色素黑褐色，分布于核周圍瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第44頁(yè)5惡性瘧原蟲雄配子體臘腸形，兩端鈍圓胞質(zhì)色藍(lán)而略帶紅核疏松，淡紅色，位于中央瘧色素黃棕色，小桿狀，在核周圍較多

瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第45頁(yè)惡性瘧厚血片形態(tài)環(huán)狀體核1-2個(gè)，常呈“!”、飛鳥等形狀。大滋養(yǎng)體常呈圓形、瘧色素集成1-2個(gè)團(tuán)。裂殖體較小，裂殖子8-26個(gè)。?配子體新月形，雄配子體臘腸形。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第46頁(yè)瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第47頁(yè)五、是非區(qū)分1.生物物質(zhì)血液內(nèi)有性成份，白血球殘塊、血小板碎塊、紅血球內(nèi)何杰-喬氏點(diǎn)、卡玻氏環(huán)，水生阿米巴、細(xì)菌、滴蟲等。特點(diǎn)：①無瘧色素②湊合常不完善③大小與瘧色素不符。瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第48頁(yè)染料雜質(zhì)、灰塵。

特點(diǎn)：

①無生物體死亡自如感覺

②常折光

③有湊合痕跡。2.無生命物質(zhì)瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)第49頁(yè)3.厚薄血膜之差薄血膜：用血少，瘧原蟲形態(tài)完整，