第二章-核酸化學(xué)-3-(2)課件

第三節(jié)核酸的理化性質(zhì)與應(yīng)用一、兩性電解質(zhì)二、高分子性質(zhì)三、UV吸收260nm四、變性、復(fù)性與分子雜交五、核酸性質(zhì)的應(yīng)用

一、兩性電解質(zhì)1.

兩性電解質(zhì)\但酸性強(qiáng)

電泳行為---向正極移動(dòng)（pH7-8），移動(dòng)速率與分子大小、凝膠濃度、電流強(qiáng)度有關(guān)。

2.DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液，RNA可溶；DNA溶于1mol/L的NaCl溶液，而RNA則不溶；

3.蛋白質(zhì)的去除：加入SDS、高溫變性、有機(jī)溶劑（氯仿＋異戊醇）變性、檸檬酸、高氯酸等。用高氯酸除去磷蛋白、糖類、磷脂、核苷酸類輔酶和游離核苷酸、酸溶性小分子物質(zhì)等雜質(zhì)。4.DNA提?。翰蝗苡谝话阌袡C(jī)溶劑，在乙醇中不溶形成沉淀?？俁NA電泳圖DNA電泳圖二、高分子性質(zhì)

粘度DNA>RNA超離心沉降凝膠過(guò)濾（電泳）三、UV吸收260nm嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，在紫外波段具有強(qiáng)烈吸收，最大吸收值在260nm附近。核酸的UV吸收的應(yīng)用核酸濃度的測(cè)定雙鏈DNA：A260表示樣品的260nm吸收值為0.01，核酸的濃度為500ng/ml。A260×（稀釋倍數(shù)）×50ug/mlRNA：A260×（稀釋倍數(shù)）×40ug/ml單鏈DNA：A260×（稀釋倍數(shù)）×33ug/ml寡核苷酸：

A260×稀釋倍數(shù)×20ug/ml1％核酸的純度A260/A280

DNA：比值1.8左右比值＞1.9,表明有RNA污染比值＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染RNA：比值為1.8-2.0比值＜1.7，表明有蛋白質(zhì)或酚污染比值＞2.0，表明可能有異硫氰酸殘存（一）變性(denaturation)核酸在理、化因素作用下，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞變成單鏈，但不涉及共價(jià)鍵的斷裂稱核酸變性。與降解的區(qū)別？引起的因素：化學(xué)因素：酸堿變性、尿素、甲醛變性物理因素：熱變性DNA的熱變性更具典型意義

四、變性、復(fù)性與分子雜交DNA的熱變性特點(diǎn)：生物活性部分或完全喪失粘度改變，線性分子變得無(wú)序，粘度下降UV吸收增強(qiáng)DNA的熱變性是指DNA分子在加熱條件下由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無(wú)規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。

增色效應(yīng)與減色效應(yīng)核酸變性后,氫鍵破壞，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，紫外吸收（260nm）增強(qiáng)，謂增色效應(yīng)減色效應(yīng)：核酸的光吸收值比其各核酸成分的光吸收值之和少，這是由于堿基有規(guī)律地堆積在一起造成的。

熔點(diǎn)\熔解溫度(Tm)熱變性過(guò)程中光吸收達(dá)到最大吸收值（完全變性）的50%時(shí)的溫度，稱Tm8090100100%50%A260

Tm

變性溫度范圍①②③℃Tm值大小與DNA的結(jié)構(gòu)相關(guān):DNA(G+C)含量有關(guān)，G+C含量愈大，Tm愈高與核酸分子的均一性有關(guān)，均一性愈強(qiáng)，Tm愈低。與介質(zhì)離子強(qiáng)度成正比DNA發(fā)生熱變性后，經(jīng)緩慢降溫，如放置室溫逐漸冷卻，解開的互補(bǔ)鏈之間對(duì)應(yīng)的堿基對(duì)再形成氫鍵，恢復(fù)完整的雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱DNA熱變性的復(fù)性。核酸復(fù)性時(shí)對(duì)UV的吸收下降，發(fā)生減色效應(yīng)（二）DNA的復(fù)性(renaturation)退火：DNA熱變性后緩慢冷卻恢復(fù)成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。

DNA加熱變性后，若經(jīng)驟然降溫，互補(bǔ)鏈堿基之間來(lái)不及配對(duì)互補(bǔ)，兩鏈維持分離狀態(tài)。慢驟

（三）核酸分子雜交hybridization

當(dāng)不同來(lái)源的核酸變性后一起復(fù)性時(shí)，只要這些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成堿基配對(duì)，出現(xiàn)復(fù)性現(xiàn)象，形成雜種核酸分子，或稱雜化雙鏈，稱核酸分子雜交。DNA-DNASouthernblottingDNA-RNANorthernblotting五、核酸性質(zhì)的應(yīng)用（了解）一核酸雜交與基因芯片技術(shù)二DNA的體外擴(kuò)增（PCR技術(shù)）一核酸雜交與基因芯片二DNA的測(cè)序雙脫氧DNA鏈合成終止法（DNA一代測(cè)序技術(shù)）原理:DNA的合成過(guò)程中，在新合成的DNA鏈的3

末端，依據(jù)堿基配對(duì)的原則，通過(guò)生成新的3

，5

-磷酸二酯鍵，逐一接入相應(yīng)的核苷酸。如果DNA合成反應(yīng)只使用一種引物，那么新合成的任何DNA鏈的起點(diǎn)都一樣。如果接入的核苷酸不是一般的脫氧核苷酸，而是2

，3

-雙脫氧核苷酸時(shí)，由于該核苷酸的3

碳位不含羥基，不能夠再生成新的3

，5

-磷酸二酯鍵，使DNA鏈合成終止，產(chǎn)生短的DNA鏈。5′端3′端CGA1.多聚核苷酸的連接(3’,5’磷酸二脂鍵）

Fig.DNAsequencingbySanger(dideoxy)method第二代DNA測(cè)序技術(shù)（主流）第二代測(cè)序技術(shù)靠的是連接測(cè)序，或者合成測(cè)序，包括焦磷酸測(cè)序和可逆性的鏈終止法。由羅氏(Roche)，以魯米那(Illumina),赫利克斯(Helicos)和生命技術(shù)公司(LifeTechnologies)以商業(yè)化提供的儀器，以短的連續(xù)性的片段序列和測(cè)序閱讀長(zhǎng)度的形式，每周輸出數(shù)十億堿基對(duì)(Gbp)的DNA序列。第三代DNA測(cè)序技術(shù)（研發(fā)中）第三代測(cè)序技術(shù)也叫從頭測(cè)序技術(shù)（denovosequence），即單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序。脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就同時(shí)能在DNA鏈上探測(cè)到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。三DNA的體外擴(kuò)增

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR)所需條件：DNA模板dNTPs引物（Primer）DNA聚合酶反應(yīng)體系（bufferwithMg2+）過(guò)程：變性退火延伸變性退火延伸……….第1章緒論本章重點(diǎn)和難點(diǎn)：生物化學(xué)的定義和學(xué)習(xí)生化的意義。小結(jié)第2章核酸化學(xué)本章和難點(diǎn)：重點(diǎn)是DNA、RNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；難點(diǎn)是DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。2.1核酸的種類和化學(xué)組成（掌握）DNA,RNA（tRNA,rRNA,mRNA）分布DNA

RNA

細(xì)胞核（%）98<10細(xì)胞質(zhì)（%）2>90三種主要RNA的比較tRNArRNAmRNA總量10-15%80%~5%數(shù)量多少（3－4）最多功能運(yùn)輸氨基酸，具有反密碼子蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所蛋白質(zhì)合成模板，具有密碼子核酸的化學(xué)組成磷酸核苷（nucleoside)戊糖-ribose(R)deoxyribose(dR)

堿基AGUCAGTC

核酸——多聚核苷酸（polynucleotides)n×核苷酸（nucleotide)基本結(jié)構(gòu)單位——核苷酸2.2核酸的結(jié)構(gòu)（掌握）核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu):DNA或RNA分子中核苷酸的排列順序與連接方式。核苷酸之間以磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈。DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)(DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)）重點(diǎn)理論基礎(chǔ)：DNA的堿基組成（1952年Chargaff法則）[A]=[T]、[G]=[C][A]+[G]=[T]+[C]DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1)DNA雙螺旋是反平行雙鏈右手螺旋，螺旋直徑為2nm。2)兩條鏈之間通過(guò)A/T,G/C互補(bǔ)配對(duì)的氫鍵相連。3)堿基平面與螺旋軸垂直,磷酸與脫氧核糖為DNA的骨架。4)相鄰堿基平面距離0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10對(duì)堿基。5）形成相間的大溝(majorgroove)及小溝(minorgroove)維持DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素（1）堿基間氫鍵（2）堿基堆積力是使DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要因素（3）磷酸基與介質(zhì)陽(yáng)離子間的離子鍵（4）堿基分子內(nèi)能堿基堆積力：由同一條核酸鏈中的相鄰堿基之間的疏水作用力和范德華力構(gòu)成DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。負(fù)超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反,即左手超螺旋(常見生物體狀態(tài)).正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同,即右手超螺旋(目前僅嗜熱菌體內(nèi)存在).

2.3RNA的結(jié)構(gòu)（掌握）RNA的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：核糖核苷酸按一定順序相連（3’，5’-磷酸二酯鍵）基本組成單位：AMP、GMP、CMP、UMP主要為單鏈mRNA的結(jié)構(gòu)與功能：真核生物中：功能：合成蛋白質(zhì)的模板結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：原核生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可直接參與蛋白質(zhì)合成2.3’尾巴：polyA尾巴（AAAAAAAAAAAAA）3.前體為hnRNA,具有編碼區(qū)、非編碼區(qū)1.5’帽子：m7GpppNtRNA的結(jié)構(gòu)與功能：

功能：轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸至蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.由70－90個(gè)核苷酸組成2.含10~20%的稀有或修飾核苷（DHU，假尿嘧啶，mG，mA）3.二級(jí)結(jié)構(gòu)為三葉草形4.含有四個(gè)臂和四個(gè)環(huán)5.3’端為CCA-OH結(jié)構(gòu)，為接受AA的部位6.反密碼子環(huán)含有反密碼子7.三級(jí)結(jié)構(gòu)為倒L型。rRNA的結(jié)構(gòu)與功能：21種原核真核小亞基rRNA蛋白質(zhì)rRNA蛋白質(zhì)大亞基16S18S33種5S，23S5S，5.8S，28S49種34種大小30S40S大小50S60S核糖體大小70S80SrRNA+蛋白質(zhì)核糖體

核糖體的組成（蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所）2.4核酸的理化性質(zhì)（掌握）

一、兩性電解質(zhì)1.

兩性電解質(zhì)\但酸性強(qiáng)

電泳行為---向正極移動(dòng)（pH7-8），移動(dòng)速率與分子大小、凝膠濃度、電流強(qiáng)度有關(guān)2.DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液，RNA可溶；DNA溶于1mol/L的NaCl溶液，而RNA則不溶；3.DNA提取：DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末，都溶于水，不溶于一般有機(jī)溶劑，在乙醇中不溶形成沉淀。二、高分子性質(zhì)DNA分子由于直徑小而長(zhǎng)度大，因此粘度DNA>RNA超離心沉降，可以測(cè)定核酸的沉降常數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量凝膠電泳可以分離大小不同的核酸分子三、核酸的紫外吸收性質(zhì)嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，在紫外波段具有強(qiáng)烈吸收，最大吸收值在260nm附近。核酸濃度的測(cè)定雙鏈DNA：A260表示樣品的260nm吸收值為0.01，核酸的濃度為500ng/ml。A260×（稀釋倍數(shù)）×50ug/mlRNA：A260×（稀釋倍數(shù)）×40ug/ml單鏈DNA：A260×（稀釋倍數(shù)）×33ug/ml寡核苷酸：

A260×（稀釋倍數(shù)）×20ug/ml1％核酸的純度A260/A280

DNA：比值1.8左右比值＞1.9,表明有RNA污染比值＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染RNA：比值為1.8-2.0比值＜1.7，表明有蛋白質(zhì)或酚污染比值＞2.0，表明可能有異硫氰酸殘存（一）變性(denaturation)核酸在理、化因素作用下，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞變成單鏈，但不涉及共價(jià)鍵的斷裂稱核酸變性。

四、變性、復(fù)性與分子雜交DNA的熱變性是指DNA分子在加熱條件下由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無(wú)規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。

增色效應(yīng)與減色效應(yīng)核酸變性后,氫鍵破壞，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，紫外吸收（260nm）增強(qiáng)，謂增色效應(yīng)減色效應(yīng)：核酸的光吸收值比其各核酸成分的光吸收值之和少，這是由于堿基有規(guī)律地堆積在一起造成的。

熔點(diǎn)\熔解溫度(Tm)熱變性過(guò)程中光吸收達(dá)到最大吸收值（完全變性）的50%時(shí)的溫度，稱Tm8090100100%50%A260

Tm

變性溫度范圍①②③℃Tm值大小與DNA的結(jié)構(gòu)相關(guān):DNA(G+C)含量有關(guān)，G+C含量愈大，Tm愈高與核酸分子的均一性有關(guān)，均一性愈強(qiáng)，Tm愈低。與介質(zhì)離子強(qiáng)度成正比DNA發(fā)生熱變性后，經(jīng)緩慢降溫，如放置室溫逐漸冷卻，解開的互補(bǔ)鏈之間對(duì)應(yīng)的堿基對(duì)再形成氫鍵，恢復(fù)完整的雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱DNA熱變性的復(fù)性。核酸復(fù)性時(shí)對(duì)