內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性凋亡在糖尿病膀胱逼尿肌病變進展中作用的實驗研究可編輯

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性凋亡在糖尿病膀胱逼尿肌病變進展中作用的實驗研究在泌尿系統(tǒng)受糖尿病影響而發(fā)生的一系列病理生理學(xué)改變中,十分常見且重要的一項即為糖尿病膀胱(diabetescystopathy,DCP)。已有研究證實其發(fā)病過程伴隨細胞凋亡水平的顯著升高。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)負責在蛋白合成后通過折疊修飾使之進一步成熟的重要細胞器,對維持細胞正常穩(wěn)態(tài)具有重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress,ERS)相關(guān)性凋亡是機體除線粒體凋亡途徑外又一條重要的內(nèi)源性激活途徑,包括細菌病毒感染、氧自由基堆積、離子泵功能障礙等多種體內(nèi)外因素均可使之激活。在應(yīng)激狀態(tài)下,ERS因應(yīng)激強度及持續(xù)時間的不同而觸發(fā)不同的級聯(lián)反應(yīng)(Cascade):應(yīng)激初期可代償性緩沖環(huán)境壓力,修復(fù)細胞;若應(yīng)激持續(xù)存在,則誘導(dǎo)細胞凋亡。未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinresponse,UPR)是機體對抗應(yīng)激損害的重要機制,具體機制為:阻抑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶及折疊酶的轉(zhuǎn)錄激活,并暫停早期蛋白質(zhì)合成。同時對已堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)進行空間結(jié)構(gòu)及功能的修復(fù),最終使受損細胞得以存續(xù)。如果細胞損傷程度過重,UPR則轉(zhuǎn)入失代償階段,ERS相關(guān)性凋亡途徑占據(jù)優(yōu)勢,最終誘導(dǎo)受損細胞凋亡。GRP78是UPR特征性標志物,而CHOP及Caspase12則被認為是ERS相關(guān)性凋亡標志因子。三者結(jié)合可以特異性地表征反映細胞ERS相關(guān)性凋亡所處階段及強度,已被廣泛應(yīng)用于該領(lǐng)域的研究。糖尿病患者體內(nèi)存在諸如高血糖、氧化應(yīng)激、RAS系統(tǒng)激活、脂質(zhì)代謝障礙等多種可誘發(fā)ERS的因素。ERS可顯著促進多種糖尿病并發(fā)癥(如糖尿病心肌病、糖尿病血管病變、糖尿病胃腸病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病肝病、糖尿病腎病等)發(fā)生進展的現(xiàn)象已在近年來國內(nèi)外的諸多實驗研究中被證實,但其對DCP病理生理學(xué),特別是DCP逼尿肌病變發(fā)生進展的影響目前仍不清楚,開展相關(guān)領(lǐng)域的研究對于更加充分深刻地認識理解DCP的致病形成機理十分有意義。鑒于ERS相關(guān)性凋亡作為細胞內(nèi)源性凋亡途徑中重要組成部分以及諸多糖尿病其它并發(fā)癥均被證實涉及ERS相關(guān)性凋亡的事實,我們推測:ERS相關(guān)性凋亡與DCP及其逼尿肌病變的發(fā)生進展亦應(yīng)在病因?qū)W及病理生理學(xué)演變等方面具有相關(guān)性。為驗證以上假說,我們通過第一部分動物在體實驗進行了ERS相關(guān)性凋亡在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型逼尿肌病變進展中的作用研究。主要內(nèi)容為:1.以鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射法構(gòu)建并鑒定糖尿病大鼠模型,在造模后不同時間點(STZ注射后4w、8w、12w和16w)依次測定各組大鼠尿動力學(xué)指標及逼尿肌收縮力;2.運用HE染色法及透射電子顯微鏡(Transmissionelectronmicroscope,TEM)分別觀察評估糖尿病模型大鼠逼尿肌隨病程進展在光鏡下顯微結(jié)構(gòu)及電鏡下超微結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)學(xué)演變,運用VG(VanGieson)染色法檢測并計算比較各組糖尿病大鼠不同病程階段逼尿肌膠原纖維所占面積比例;3.運用SABC免疫組化染色法檢測PCNA表達測定評估四個病程時點糖尿病模型大鼠逼尿肌細胞增殖水平,運用TUNEL染色法測定評估四個病程時點糖尿病模型大鼠逼尿肌細胞凋亡水平;4.以qRT-PCR及Westernblotting法分別測定各組大鼠逼尿肌細胞三種ERS相關(guān)性凋亡標志因子GRP78、CHOP及Caspase12在mRNA及蛋白水平的表達變化,并分析GRP78表達與PCNA陽性表達率演變之間的相關(guān)性以及CHOP和Caspase12表達與凋亡指數(shù)演變之間的相關(guān)性。大量研究表明,在糖尿病其它并發(fā)癥中,高葡萄糖血癥(Hyperglycemia)作為獨立危險因素可通過線粒體途徑直接誘導(dǎo)并加重細胞凋亡,但在DCP研究領(lǐng)域,高葡萄糖血癥是否能通過ERS途徑影響逼尿肌細胞病理生理狀態(tài)則鮮有報道。為了進一步檢測高葡萄糖血癥通過影響ERS相關(guān)性凋亡途徑作用于DCP逼尿肌病變發(fā)生進展的情況,在第一部分實驗證實ERS相關(guān)性凋亡與DCP發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基礎(chǔ)上,我們設(shè)計了第二部分體外細胞實驗,以體外高葡萄糖濃度環(huán)境模擬在體的高葡萄糖血癥,研究ERS對體外高糖環(huán)境下大鼠膀胱逼尿肌細胞(Detrusorsmoothmusclecells,DSMCs)凋亡的影響效應(yīng)。主要內(nèi)容如下:1.分離、原代培養(yǎng)并通過α-SMA免疫熒光法在激光共聚焦顯微鏡下觀察鑒定大鼠DSMCs,之后將大鼠DSMCs分為正常葡萄糖濃度組(NG組)及高濃度葡萄糖濃度組(HG組);2.兩組DSMCs在四個不同時點(12h、24h、48h和72h)在TEM下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)演變;3.運用MTT比色法檢測NG組及HG組在上述四個不同時點DSMCs增殖水平;運用AnnexinV-FITC/PI雙染,通過流式細胞術(shù)檢測評估兩組DSMCs在相應(yīng)時點的凋亡水平;4.測定四個不同時點各組大鼠DSMCs上述三種ERS相關(guān)性凋亡標志因子在mRNA及蛋白水平的表達變化,并分析CHOP及Caspase12的表達與流式細胞術(shù)測得凋亡率之間的相關(guān)性。第一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性凋亡在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型逼尿肌病變進展中的作用機制研究第一節(jié)糖尿病模型大鼠隨病程進展逼尿肌功能學(xué)演變觀察評估目的:觀察評估糖尿病模型大鼠隨病程進展的一般狀況改變及其膀胱組織在尿動力學(xué)指標及逼尿肌收縮力方面發(fā)生的功能學(xué)演變情況。方法:取成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠50只,隨機分為對照組(Control組)、糖尿病4周組(DM4w組)、糖尿病8周組(DM8w組)、糖尿病12周組(DM12w組)及糖尿病16周組(DM16w組),每組10只,共計5組。DM4w-DM16w四組大鼠同期采用一次注射法經(jīng)腹腔注射60mg/kg的STZ溶液構(gòu)建糖尿病大鼠模型,Control組同期給予腹腔注射等量不含STZ的緩沖液。糖尿病成模判定標準如下:注射后72h以刀片切割鼠尾末端行鼠尾靜脈取血,血糖儀三次測得血糖濃度若大于300mg/dL則判定該鼠已制備為糖尿病模型大鼠。在鑒定成模后分別于4w、8w、12w及16w分別對五組大鼠運用壓力換能器及生物信號采集處理系統(tǒng)行包括膀胱最大容量、逼尿肌漏尿點壓(DetrusorLeakPointPressure,DLPP)和順應(yīng)性等指標在內(nèi)的尿動力學(xué)檢測;并在不同病程時點對接受尿動力學(xué)檢測后的相應(yīng)組別大鼠即刻處死,Control組大鼠與DM4w組大鼠同期處死,取出膀胱并制備逼尿肌肌條,運用生物信號記錄分析系統(tǒng)行逼尿肌收縮力測定。結(jié)果:成功構(gòu)建并鑒定獲得四個不同病程時點的糖尿病大鼠模型。各模型組大鼠隨病情進展逐漸呈現(xiàn)出三多一少(多飲、多食、多尿,瘦弱減重)、萎靡遲緩、倦怠少動、對痛感反應(yīng)鈍化。此外,還可見毛色轉(zhuǎn)為灰黃,眼球由紅轉(zhuǎn)白,呈現(xiàn)白內(nèi)障樣渾濁,肢體可見大小不一的多發(fā)潰瘍膿性創(chuàng)面等表現(xiàn)。四組糖尿病模型大鼠平均血糖水平、膀胱濕重及膀胱濕重/體重比值較對照組均顯著升高;各組糖尿病模型大鼠平均體重均顯著低于對照組大鼠,且隨病程進展呈現(xiàn)逐漸降低趨勢;各糖尿病模型大鼠組膀胱最大容量、順應(yīng)性及DLPP均顯著高于對照組大鼠,且隨病程進展逐漸升高;四組糖尿病模型大鼠逼尿肌平均收縮力均高于對照組大鼠,升高趨勢隨病程進展在DM8w組達到峰值,DM12w組及DM16w組較DM8w組有所回落。結(jié)論:(1)糖尿病對膀胱逼尿肌的順應(yīng)性、興奮性、自律性均會造成損害,其收縮舒張功能障礙將引起一系列臨床癥狀。(2)糖尿病模型大鼠膀胱功能障礙的進展呈現(xiàn)時間依賴性。(3)糖尿病模型大鼠膀胱功能障礙的演變存在代償期向非代償期的過渡,過渡時段可能為成模后8-12w。第二節(jié)糖尿病模型大鼠隨病程進展膀胱逼尿肌組織形態(tài)學(xué)演變觀察評估目的:觀察評估糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌隨病程進展在顯微、超微結(jié)構(gòu)水平以及膠原纖維含量方面發(fā)生的組織形態(tài)學(xué)演變情況。方法:取DM4W、DM8W、DM12W及DM16W四組大鼠及Control組大鼠膀胱逼尿肌組織,完成以下三項檢測觀察:行HE染色后于光鏡下觀察各組大鼠逼尿肌組織顯微結(jié)構(gòu)變化;行VG染色后于光鏡下觀察各組大鼠逼尿肌間質(zhì)中膠原纖維并計算其面積所占百分比;接受組織特殊固定處理后在透射電鏡下觀察逼尿肌細胞包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核等在內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:HE染色光鏡下觀察膀胱逼尿肌肌束隨病程進展走行漸紊亂,局部出現(xiàn)排列松散及肌纖維間隙增大現(xiàn)象,肌束間疏松纖維結(jié)締組織漸增多且分布混亂;VG染色光鏡觀察見膠原纖維存在于逼尿肌間質(zhì)中,隨著糖尿病病程的進展,膠原纖維所占面積比例逐漸增多。除DM4w組大鼠,其余實驗組大鼠膀胱逼尿肌膠原纖維所占面積比例差異與對照組大鼠相比均顯著升高;透射電鏡下見逼尿肌細胞隨病程進展逐漸出現(xiàn)核旁內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域的脫顆粒及空泡化改變,并伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常結(jié)構(gòu)的破壞;細胞核外形漸扭曲。到糖尿病病程12w之后,散在空泡化改變出現(xiàn)廣泛的融合現(xiàn)象,大量細胞核出現(xiàn)固縮及崩解現(xiàn)象,核仁漸消失并可見大量異常電子致密物沉積。結(jié)論:(1)隨著糖尿病病程的進展,糖尿病模型大鼠出現(xiàn)不同程度的膀胱重構(gòu)現(xiàn)象,逼尿肌組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)進行性破壞。(2)糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌間質(zhì)膠原纖維隨糖尿病病程的延長逐漸堆積增多,間質(zhì)纖維化程度逐漸升高,與膀胱順應(yīng)性的下降密切相關(guān)。(3)糖尿病成模后8w-12w是膀胱逼尿肌組織形態(tài)加速破壞惡化的關(guān)鍵時段,與逼尿肌功能在此期間經(jīng)歷由代償向失代償?shù)霓D(zhuǎn)變相對應(yīng)。第三節(jié)糖尿病模型大鼠隨病程進展膀胱逼尿肌細胞增殖與凋亡水平演變的研究目的:測定糖尿病模型大鼠隨病程進展膀胱逼尿肌細胞增殖及凋亡水平的演變情況。方法:取不同病程時點糖尿病模型大鼠及對照組大鼠膀胱逼尿肌組織切片,運用SABC免疫組化染色法檢測PCNA表達測定評估四個病程時點糖尿病模型大鼠逼尿肌細胞增殖水平,行TUNEL染色計算并比較各組大鼠膀胱逼尿肌凋亡陽性細胞百分比。結(jié)果:隨著糖尿病病程的進展,糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌細胞PCNA平均陽性表達率與對照組大鼠相比均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),陽性表達率均值在造模后8w檢測時點達峰,后逐漸回落,至造模后16w檢測時點時,陽性表達率均值已與造模后4w檢測值相近持平,但仍高于control組水平;隨著糖尿病病程的進展,各實驗組大鼠平均凋亡指數(shù)與對照組大鼠相比均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),凋亡指數(shù)平均數(shù)值呈現(xiàn)逐漸增長趨勢,提示細胞凋亡水平逐漸升高。結(jié)論:(1)糖尿病模型大鼠DSMCs細胞數(shù)量變化呈現(xiàn)時間依賴性。(2)糖尿病模型大鼠DSMCs細胞凋亡水平較正常大鼠顯著升高,并隨糖尿病病程的延長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢;細胞增殖水平亦顯著高于正常大鼠,但存在漸次升高到逐漸回落的過渡。(3)成模后8w-12w對于糖尿病模型大鼠DSMCs的數(shù)量演變來說是一個重要的轉(zhuǎn)折時段,是由增殖凋亡雙上升,但以增殖為強的代償階段逐漸過渡為增殖回落凋亡繼續(xù)走強占據(jù)主導(dǎo)的失代償階段。第四節(jié)糖尿病模型大鼠隨病程進展膀胱逼尿肌細胞ERS相關(guān)性凋亡標志物表達變化的研究目的:在測定糖尿病模型大鼠隨病程進展膀胱逼尿肌細胞增殖及凋亡水平演變情況基礎(chǔ)上,通過對三種ERS相關(guān)性凋亡標志因子在mRNA及蛋白水平表達變化的檢測,初步評估ERS相關(guān)性凋亡在糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌病程進展過程中的作用。方法:取不同病程時點糖尿病模型大鼠及對照組大鼠膀胱逼尿肌組織,以qRT-PCR及Westernblotting法分別測定各組大鼠逼尿肌細胞三種ERS相關(guān)性凋亡標志因子GRP78、Caspase12及CHOP在mRNA及蛋白水平的表達變化,并分析上述三者表達與DSMCs增殖及凋亡水平演變的相關(guān)性。結(jié)果:各組糖尿病模型大鼠三種ERS相關(guān)性凋亡標志因子GRP78、Caspase12及CHOP的mRNA及蛋白表達水平均顯著高于對照組大鼠,其中Caspase12及CHOP的mRNA及蛋白表達水平隨病程進展均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢,而GRP78的mRNA表達水平于DM12w組達到峰值,其蛋白表達水平于DM8w組達到峰值。GRP78蛋白及mRNA表達與逼尿肌細胞PCNA陽性表達率均呈顯著正相關(guān),而CHOP及Caspase12蛋白及mRNA表達與逼尿肌細胞AI均呈顯著正相關(guān)。結(jié)論:(1)UPR主導(dǎo)的細胞修復(fù)活動與ERS相關(guān)性凋亡在DCP病程進展過程中同時存在。(2)UPR主導(dǎo)的細胞修復(fù)活動在成模后8w-12w時段經(jīng)歷了由代償性增強向失代償性減弱的轉(zhuǎn)變。(3)ERS相關(guān)性凋亡在DCP逼尿肌病變進展過程中是一個持續(xù)發(fā)揮負性效應(yīng)且隨時間延長強度不斷增強的重要病理生理學(xué)事件。(4)糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌病變的發(fā)生發(fā)展與ERS相關(guān)性凋亡密切相關(guān)。第二部分:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對體外高糖環(huán)境下大鼠膀胱逼尿肌細胞凋亡的影響研究第一節(jié)大鼠逼尿肌細胞的分離、純化、培養(yǎng)、傳代及鑒定目的:通過適宜的體外分離、原代培養(yǎng)、傳代以及準確明晰的鑒定,為后續(xù)實驗獲取活性良好的可靠DSMCs。方法:運用膠原酶Ⅱ(4mg/mL)分離并原代培養(yǎng)DSMCs,之后通過α-SMA免疫熒光法在激光共聚焦顯微鏡下觀察鑒定大鼠逼尿肌細胞。結(jié)果:原代培養(yǎng)的大鼠DSMCs在光鏡下呈長梭形。分離后經(jīng)培養(yǎng)8h左右即可見細胞出現(xiàn)伸展貼壁現(xiàn)象,提示細胞活性良好。ɑ-SMA免疫熒光染色后在激光共聚焦顯微鏡下可見DSMCs的梭形胞質(zhì)呈現(xiàn)特異性的綠色熒光,提示胞質(zhì)內(nèi)特異性地表達平滑肌標志蛋白ɑ-SMA;胞核則呈現(xiàn)DAPI特異性的藍色熒光。結(jié)合細胞形態(tài)觀察及免疫熒光染色陽性結(jié)果,可綜合判定所分離培養(yǎng)之細胞為DSMCs。結(jié)論:(1)采用適宜濃度及合理消化時間的膠原酶Ⅱ消化法可以高效快捷地分離出活性良好、生理性能穩(wěn)定的DSMCs。(2)運用上述方法在24-48h內(nèi)分離得到的原代培養(yǎng)的DSMCs能夠滿足后續(xù)實驗研究的要求。第二節(jié)體外高糖環(huán)境下大鼠膀胱逼尿肌細胞超微結(jié)構(gòu)觀察評估目的:在體外構(gòu)建單純的高糖環(huán)境,模擬在體的高葡萄糖血癥,觀察DSMCs在接受體外不同時長高濃度葡萄糖刺激下的情況下,細胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)的改變。方法:將細胞同步化處理后的DSMCs分為接種于高濃度葡萄糖(25mM)液體培養(yǎng)基組(HG組)及接種于正常濃度葡萄糖(5mM)液體培養(yǎng)基對照組(NG組)。接受特殊固定處理后在透射電鏡下觀察兩組DSMCs在接種后12h、24h、48h和72h四個不同時點的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:鏡下見NG對照組DSMCs細胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,染色質(zhì)向核膜聚集分布;胞漿內(nèi)可見核周區(qū)域?qū)盈B分布的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其間散在分布的線粒體,形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常,在不同培養(yǎng)時間點的NG組細胞超微結(jié)構(gòu)亦未見明顯差異。與對應(yīng)NG組DSMCs相比,HG12h組及HG24h組DSMCs的鏡下表現(xiàn)并未見明顯的差異,部分細胞的核周區(qū)域可見空泡結(jié)構(gòu)的出現(xiàn),但并非普遍現(xiàn)象。當高糖刺激時長延至48h時,在HG48h組DSMCs內(nèi)的核周區(qū)域開始出現(xiàn)較多量的囊泡結(jié)構(gòu),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逐漸變得腫脹,并伴有輕度脫顆粒現(xiàn)象。部分細胞的核膜形態(tài)變得不規(guī)則,部分區(qū)域彎卷折疊,出現(xiàn)質(zhì)膜微囊。在持續(xù)接受高糖刺激72h之后,HG72h組的部分DSMCs細胞核出現(xiàn)扭曲固縮,體積變小,形態(tài)漸失常,并可見多量的黑褐色電子致密物沉積于核膜內(nèi)側(cè)區(qū)域,而核周的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體分布區(qū)域則未見明顯的形態(tài)結(jié)構(gòu)進一步惡化的表現(xiàn)。此外,在各組細胞鏡下觀察時均可見到DSMCs典型的凋亡影像以及特征性的凋亡小體,NG組及HG12h組數(shù)量較少,高糖刺激24h后的各組細胞中則有所增多。結(jié)論:(1)體外高糖環(huán)境下DSMCs在接受不同時長(0-72h)刺激時,其細胞超微結(jié)構(gòu)演變時間依賴性并不顯著。(2)各組細胞中均可觀察到典型凋亡小體結(jié)構(gòu),NG組及HG12h組數(shù)量較少,高糖刺激24h后的各組細胞中則有所增多。第三節(jié)體外高糖環(huán)境下大鼠膀胱逼尿肌細胞增殖及凋亡水平的演變目的:檢測并定量評估體外高糖濃度環(huán)境不同時長刺激對DSMCs增殖及凋亡水平的影響。方法:運用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定NG組及HG組對數(shù)生長期DSMCs在12h、24h、48h和72h四個不同時點的吸光值(OD值);運用AnnexinV-FITC/PI雙染法對細胞染色,并以流式細胞術(shù)測定兩組DSMCs在上述四個時點的早期、晚期凋亡率以及總凋亡率。結(jié)果:除12h時點兩組的平均OD值無明顯統(tǒng)計學(xué)差異外,HG組在24h、48h和72h的平均OD值均顯著低于NG組(P<0.05);NG組DSMCs平均OD值逐漸增高,HG組DSMCs平均OD值則隨接受刺激時間的延長逐漸降低。與NG組DSMCs相比,除HG12h組早期、晚期及平均總凋亡率與之基本持平,數(shù)據(jù)未見統(tǒng)計學(xué)差異外,HG24h組、HG48h組、HG72h組DSMCs的早期、晚期及平均總凋亡率均顯著升高(P<0.05)