細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞生物學(xué)試題

實(shí)驗(yàn)室規(guī)則和要求一般規(guī)定上課第一天請先熟悉環(huán)境，牢記“安全”是進(jìn)行任何實(shí)驗(yàn)最重要的事項。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)請穿著實(shí)驗(yàn)衣（最好長及膝蓋下），避免穿著涼鞋、拖鞋（腳趾不要裸露）。留有長發(fā)者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危險或污染實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止吸煙、吃東西、飲食、化妝、嚼口香糖、嬉戲奔跑，食物飲料勿存放于實(shí)驗(yàn)室的冰箱中，實(shí)驗(yàn)桌上勿堆放書包、書籍、衣服外套及雜物等。所有實(shí)驗(yàn)儀器、耗材、藥品等均屬實(shí)驗(yàn)室所有，不得攜出實(shí)驗(yàn)室外。每組分配之儀器、耗材請在課程開始前確定清點(diǎn)與保管，課程結(jié)束后如數(shù)清點(diǎn)繳回。公用儀器請善加愛惜使用。實(shí)驗(yàn)前后，請把工作區(qū)域清理擦拭，并隨時保持環(huán)境清潔。實(shí)驗(yàn)前詳閱實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)的原理及操作，注意上課所告知的注意事項。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中有任何狀況或疑問，隨時發(fā)問，切勿私自變更實(shí)驗(yàn)程序。打翻任何藥品試劑及器皿時，請隨即清理。實(shí)驗(yàn)后，適切記下自己的結(jié)果，嚴(yán)禁抄襲，確實(shí)關(guān)閉不用之電源、水、酒精燈及瓦斯等。身體不適、睡眠不足、精神不濟(jì)或注意力無法集中，請立即停止實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時間若延長，請注意時間的管制及自身的安全，不可自行逗留實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)完畢，請清理實(shí)驗(yàn)室、倒垃圾、滅菌、關(guān)閉燈光及冷氣，離開實(shí)驗(yàn)室前記得洗手。任何意外事件應(yīng)立即報告教師或?qū)嶒?yàn)室管理人員，并應(yīng)熟知相關(guān)之應(yīng)變措施。藥品使用任何藥品，請先看清楚標(biāo)示說明、注意事項，翻閱物質(zhì)安全資料，查明是否對人體造成傷害，使用完畢請放回原位。新配制的試劑請清楚注明內(nèi)容物、濃度、注意事項及配制日期，為避免污染，勿將未用完的藥劑倒回容器內(nèi)。揮發(fā)性、腐蝕性、有毒溶劑（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、鹽酸、硫酸、-巰基乙醇、甲醛、酚等）要在排煙柜中戴手套量取配制，取用完應(yīng)隨即蓋好蓋子，若不小心打翻試劑，馬上處理。有毒、致癌藥劑例如丙稀酰胺（神經(jīng)毒）、溴化乙啶（突變劑）、SDS（粉塵）請戴手套及口罩取用，并勿到處污染，脫下手套后，養(yǎng)成洗手的好習(xí)慣。使用后的實(shí)驗(yàn)試劑和材料，應(yīng)放在專用的收集桶內(nèi)。固體培養(yǎng)基、瓊脂糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。使用刻度吸管取物時，切勿用嘴吸取，請用自動吸管或吸耳球。

儀器使用儀器前先了解其性能、配備及正確操作方法，零件及附件嚴(yán)禁拆卸，勿私自調(diào)整，并注意插座電壓（110V或220V）之類別。使用離心機(jī)時，離心管要兩兩對稱、重量平衡，離心機(jī)未停下不得打開蓋子。冷凍離心機(jī)于開機(jī)狀態(tài)時，務(wù)必蓋緊蓋子，以保持離心槽之低溫并避免結(jié)霜。電源供應(yīng)器有高電壓，切勿觸摸電極或電泳槽內(nèi)溶液，手濕切勿開啟電源。使用微波爐加熱，不可有鋁箔等金屬物品，瓶蓋必須松開，以免爆炸。加熱后戴防熱手套取出瓶子，務(wù)必輕搖晃，確認(rèn)不會突沸。水浴鍋、干燥器等，使用前熟悉操作手續(xù)，嚴(yán)防燙傷。操作臺上有酒精等有機(jī)溶劑及易燃物（如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等）要遠(yuǎn)離火苗，不可留置火焰燃燒，萬一著火，應(yīng)力持鎮(zhèn)定，沉著處理。酒精或乙醚等著火時，應(yīng)使用泡沫滅火劑或濕毛巾覆蓋，勿使用水沖潑。實(shí)驗(yàn)完畢后需清理實(shí)驗(yàn)臺，除需收回共用物品外，不留任何器皿。傾倒的試劑、水漬應(yīng)擦干凈，保證實(shí)驗(yàn)臺和實(shí)驗(yàn)前同樣清潔。值日組協(xié)助實(shí)驗(yàn)室管理人員收回共用物品，清潔儀器，清理實(shí)驗(yàn)臺，打掃實(shí)驗(yàn)室。

第一部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1顯微技術(shù)概述實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏箤W(xué)生了解基本的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，熟悉常規(guī)和常用的實(shí)驗(yàn)方法。鍛煉學(xué)生動手能力，增強(qiáng)學(xué)生基本科研技能和科研思路；了解目前常用細(xì)胞生物學(xué)研究方法。任務(wù)：細(xì)胞生物學(xué)作為高校生命科學(xué)的主干課程之一，從本質(zhì)上講是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)，因此設(shè)置實(shí)驗(yàn)課程十分重要，學(xué)生可以通過這一教學(xué)環(huán)節(jié)掌握細(xì)胞生物學(xué)的基本研究手段和方法，并更深入理解理論課的各方面內(nèi)容。進(jìn)一步講，細(xì)胞是生物構(gòu)成的基本單位，是理解一切生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)，許多細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法也用于遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)等科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，在將來的各項工作中將會有廣泛的實(shí)際用途。培養(yǎng)目標(biāo)：使學(xué)生掌握細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，提高學(xué)生分析問題和解決問題的能力，為了今后獨(dú)立進(jìn)行科研工作打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)2細(xì)胞膜的滲透性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞膜的滲透性質(zhì)及各種物質(zhì)跨膜進(jìn)入細(xì)胞的不同速度二、實(shí)驗(yàn)原理將紅細(xì)胞放入數(shù)種等滲溶液中，由于紅細(xì)胞對各種溶質(zhì)的滲透性不同，有的溶質(zhì)可以滲入，有的溶質(zhì)則不能滲入；滲入的溶質(zhì)能夠提高紅細(xì)胞膜的滲透壓，所以水分進(jìn)入細(xì)胞引起溶血。由于溶質(zhì)滲入速度不同，因此溶血的時間也不相同。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑器材：50ml小燒杯，10ml移液管，試管（1～10ml），試管架。試劑：0.17mol/L氯化鈉，0.17mol/L氯化銨，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸鈉，0.12mol/L草酸銨，0.12mol/L硫酸鈉，0.32mol/L葡萄糖，0.32mol/L甘油，0.32mol/L乙醇，0.32mol/L丙酮。實(shí)驗(yàn)材料：動物血液（如羊血）四、實(shí)驗(yàn)步驟1、羊血細(xì)胞懸浮液取50ml小燒杯一只，加一份羊血和10份0.17mol/L氯化鈉溶液，形成一種不透明的紅色溶液，即稀釋的羊血。2、低滲溶液取試管一只，加入5ml蒸餾水，再加0.5ml稀釋的羊血，注意觀察溶液顏色變化，由不透明的紅色逐漸澄清，說明紅細(xì)胞發(fā)生破裂造成溶血，全部紅細(xì)胞溶血后光線比較容易透過溶液。3、羊紅細(xì)胞滲透性（1）取試管一支，加入0.17mol/L氯化鈉溶液5ml，再加入0.5ml稀釋的羊血，輕輕搖動，觀察顏色變化及溶血現(xiàn)象，說明原因。（2）取試管一支，加入0.17mol/L氯化銨溶液5ml，再加入0.5ml稀釋的羊血，輕輕搖動，觀察顏色變化及溶血現(xiàn)象，說明原因。（3）另外8種等滲溶液進(jìn)行同上實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并簡單分析表1不同低滲溶液中紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象溶液種類溶血與否時間結(jié)果分析0.17mol/L氯化鈉0.17mol/L氯化銨0.17mol/L醋酸胺0.17mol/L硝酸鈉0.12mol/L草酸銨0.12mol/L硫酸鈉0.32mol/L葡萄糖0.32mol/L甘油0.32mol/L乙醇0.32mol/L丙酮五、注意事項（或?qū)嶒?yàn)特別提示）六、實(shí)驗(yàn)報告結(jié)果與討論思考題實(shí)驗(yàn)3細(xì)胞器線粒體的分離與觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠貌钏匐x心法分離動、植物細(xì)胞線粒體二、實(shí)驗(yàn)原理線粒體是真核細(xì)胞特有的，司能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器。細(xì)胞種的能源物質(zhì)——糖、脂肪、部分氨基酸在此進(jìn)行最終的氧化，并通過偶聯(lián)磷酸華生成ATP，供給細(xì)胞生理活動之需。對線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的研究通常是在離體線粒體上進(jìn)行的。制備線粒體用組織勻漿在懸浮介質(zhì)中進(jìn)行差速離心的方法。在一給定的離心場中（對于所使用的離心機(jī)，就是選用一定的轉(zhuǎn)速），球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心某一時間內(nèi)，組織勻降中的各種細(xì)胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細(xì)胞器中最先沉降的是細(xì)胞核，其次是線粒體，其他更輕的細(xì)胞器和大分子可依次再分離。懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性，在pH7.2的條件下，亞細(xì)胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個操作過程應(yīng)注意樣品保持4，避免酶失活。線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。詹納斯綠B（janusgreenB）是對線粒體專一的活細(xì)胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引而堆積在線粒體膜上。線粒體的細(xì)胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。本實(shí)驗(yàn)介紹大鼠（動物）肝臟和玉米（植物）線粒體的分離。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟大鼠肝臟線粒體的分離實(shí)驗(yàn)用品材料：大鼠肝臟試劑：生理鹽水1％詹納斯綠B染液，生理鹽水配制蔗糖－Tris鹽酸緩沖液（pH7.4）0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/LTris-鹽酸緩沖液（pH7.4）0.1mol/LTris10ml0.1mol/L鹽酸8.4ml加重蒸水到100ml加蔗糖到0.25mol/L。蔗糖為密度梯度離心用D(+)蔗糖0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/LTris-鹽酸緩沖液（pH7.4）配制如上，加蔗糖到0.34mol/L。固定液：甲醇－冰醋酸（9：1）Giemsa染液：Giemsa粉0.5g，甘油33ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研缽內(nèi)，研磨至無顆粒，再將剩余甘油倒入混勻，56左右保溫2h，令其充分溶解，最后加甲醇混勻，成為Giemsa原液，保存于棕色瓶中。用時吸出少量用1/15mol/L磷酸緩沖液作10～20倍稀釋。1/15mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）：1/15mol/LKH2PO450ml1/15mol/LNa2HPO450ml器材高速離心機(jī)，解剖刀剪，小燒杯，冰浴盤，漏斗，尼龍織物，玻璃均漿器。實(shí)驗(yàn)方法制備大鼠肝細(xì)胞勻漿。實(shí)驗(yàn)前大鼠空腹12h，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織1g，剪碎，用預(yù)冷到0～4°C的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后在0~4°C條件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿，蔗糖溶液分?jǐn)?shù)次添加，勻漿用雙層尼龍織物過濾備用。注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時間，整個分離過程不宜過長，以保持組分生理活性。差速離心先將9ml0.34mol/L緩沖蔗糖溶液放入離心管，然后沿管壁小心的加入9ml肝勻漿使其覆蓋在上層。用冷凍控溫高速離心機(jī)按照圖1順序進(jìn)行差速離心。鼠肝勻漿鼠肝勻漿700g，離心10min沉淀上清洗滌（可省略）10ml預(yù)冷的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液，2次，每次1000g，離心15min。沉淀I細(xì)胞核及質(zhì)膜碎片上清合并10000g，離心10min沉淀洗滌（可省略）加10ml預(yù)冷的0.25mol/L緩沖蔗糖溶液，1000g，15min。沉淀II（線粒體）圖1差速離心順序圖分離物鑒定細(xì)胞核：取細(xì)胞核沉淀一滴涂片，在甲醇－冰醋酸溶液中固定15min，充分吹干，滴Giemsa染液（原液10～20倍稀釋）染色10分鐘。自來水沖洗，吹干，鏡檢。觀察結(jié)果。線粒體：取線粒體沉淀涂片，注意勿太濃密，不待干即滴加1％詹納斯綠B染液染色20min，蓋上蓋玻片鏡檢。觀察結(jié)果。玉米線粒體的分離從植物細(xì)胞中分離線粒體，除了做線粒體功能測定之外，在植物細(xì)胞遺傳工程中，常用于分離核外基因——線粒體DNA等目的。分離線粒體的方法仍采用均勻介質(zhì)中的差速離心法。介質(zhì)中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二價陽離子，Ca2+除去后細(xì)胞間粘著解體，促使組織分散成單個細(xì)胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在細(xì)胞外面，并作為競爭性底物削弱蛋白酶的作用。實(shí)驗(yàn)用品材料玉米黃化幼苗（水稻、高梁等幼苗均可）試劑分離介質(zhì)：0.25mol/L蔗糖，50mmol/LTris-鹽酸緩沖液（pH7.4），3mmol/LEDTA，0.75mg/mlBSA。50mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液（pH7.4）配法：50ml0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與42ml0.1mol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml。保存液：0.3mol/L甘露醇（pH7.4）20％次氯酸鈉（NaClO）溶液1％詹納斯綠B染液，生理鹽水配制。器材溫箱，冰箱，紗布，瓷研缽，冷凍控溫高速離心機(jī)實(shí)驗(yàn)方法玉米種子用20％次氯酸鈉溶液浸泡10min消毒，清水沖洗30min，再浸泡清水15h。將種子平鋪在放有濕紗布的盤內(nèi)，保持溫度，置溫箱28于暗處培育2～3d。待芽長到1～2cm長時剪下約5g，放0～41h。加3倍體積分離介質(zhì)，在瓷研缽內(nèi)快速研磨成勻漿。用多層紗布過濾，濾液經(jīng)700g離心10min。除去核和雜質(zhì)沉淀。取上清液10000g離心10min，沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一次。沉淀為線粒體，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上勻漿及離心均控制在0~4進(jìn)行。取線粒體沉淀涂片在清潔載玻片上，不待干即滴加1％詹納斯綠B染色20min，鏡下觀察，線粒體為藍(lán)綠色圓形顆粒。五、注意事項（或?qū)嶒?yàn)特別提示）六、實(shí)驗(yàn)報告結(jié)果與討論思考題實(shí)驗(yàn)4RNA的細(xì)胞化學(xué)（Brachet反應(yīng)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釨rachet反應(yīng)原理，掌握有關(guān)的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理甲基綠—派洛寧（methylgreen-pyronin）為堿性染料，它分別能與細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA結(jié)合呈現(xiàn)不同顏色。當(dāng)甲基綠與派洛寧作為混合染料時，甲基綠與染色質(zhì)中DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍(lán)色；派洛寧與核仁、細(xì)胞質(zhì)中的RNA選擇性結(jié)合顯示紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用，同時兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的DNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色。而派洛寧則與聚合程度較低的RNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色（但解聚的DNA也能和派洛寧結(jié)合呈現(xiàn)紅色）。即RNA對派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對甲基綠親和力大，被染成綠色。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑儀器、用具：顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、吸水紙。材料：洋蔥鱗莖內(nèi)表皮。試劑：Unna試劑：甲基綠－派洛寧染色液甲液：5％派洛寧水溶液6ml2％甲基綠水溶液6ml蒸餾水16ml乙液：1mol/L乙酸緩沖液（pH4.8）16ml甲液與乙液分別置于4冰箱備用，使用時兩溶液混勻即可。1mol/L乙酸緩沖液（pH4.8）配方：A液：冰醋酸6ml加蒸餾水至100ml。B液：乙酸鈉13.5g加蒸餾水至100ml。取A液40ml＋B液60ml混勻即為pH4.8乙酸緩沖液。四、實(shí)驗(yàn)步驟用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于載玻片上。滴一滴Unna試劑，染色30min。蒸餾水洗兩次，吸水紙吸去多余水分。蓋上蓋玻片，鏡檢。五、注意事項（或?qū)嶒?yàn)特別提示）CK對照：撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，經(jīng)5％三氯乙酸90水浴處理15min。再經(jīng)70％乙醇洗片刻，然后按照步驟（1）～（4）制片觀察。六、實(shí)驗(yàn)報告結(jié)果與討論思考題實(shí)驗(yàn)5DNA的細(xì)胞化學(xué)（Feulgen反應(yīng)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私釬eulgen反應(yīng)的原理，掌握有關(guān)的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理DNA是由許多單核苷酸聚合成的多核甘酸，每個單核苷酸又由磷酸、脫氧核糖和堿基構(gòu)成。DNA經(jīng)1mol/L鹽酸水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的雙鍵打開，使脫氧核糖的第一碳原子上形成游離的醛基，這些醛基與Schiff試劑反應(yīng)。Schiff試劑是堿性品紅和偏重亞硫酸鈉作用，形成無色的品紅液，當(dāng)無色品紅與醛基結(jié)合則形成紫紅色的化合物。因此凡是有DNA的地方，都能顯示紫紅色。紫紅色的產(chǎn)生，是由于反應(yīng)產(chǎn)物的分子內(nèi)含有醌基，醌基是一個發(fā)色基團(tuán)，所以具有顏色。材料不經(jīng)過水解或預(yù)先用熱的三氯醋酸或DNA酶處理，得到的反應(yīng)是陰性的，從而證明了Feulgen反應(yīng)的專一性。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑儀器、用具：顯微鏡，恒溫水浴箱、溫度計、解剖針、酒精燈、試管、燒杯、載玻片、蓋玻片、吸水紙。材料：洋蔥鱗莖。試劑：1mol/L鹽酸的配制：取82.5ml密度1.19g/ml的濃鹽酸加蒸餾水至1000ml。Schiff試劑的配制和保存：稱取0.5g堿性品紅加入到100ml煮沸的蒸餾水中（用三角燒瓶），時時振蕩，繼續(xù)煮5min（勿使其沸騰），使之充分溶解。然后冷卻至50℃時用濾紙過濾，濾液中就加入10ml1mol/LHCl，冷卻至25℃時，加入0.5gNa2S2O5（偏重亞硫酸鈉），充分振蕩后，塞緊瓶塞，在室溫暗處靜置至少24h（有時需2～3d），使其顏色退至淡黃色，然后加入0.5g活性炭，用力振蕩1min，最后用粗濾紙過濾于棕色瓶中，封嚴(yán)瓶塞，外包黑紙。濾液應(yīng)為無色無沉淀，貯于4℃冰箱中備用。如有白色沉淀，就不能再使用，如顏色變紅，可加入少許偏重亞硫酸鈉或鉀，使之再轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色時，仍可使用。亞硫酸水：取200ml自來水，加入10ml10％偏重亞硫酸鈉（或鉀）水溶液和10ml1mol/LHCl，三者于使用前混勻。四、實(shí)驗(yàn)步驟將洋蔥鱗莖內(nèi)表皮放在1mol/LHCl中，加熱到60℃水解8～10min。蒸餾水水洗。Schiff試劑遮光染色30min。用新鮮配制的亞硫酸水溶液洗3次，每次1min。水洗5min。顯微鏡觀察。細(xì)胞中有DNA的部位應(yīng)呈現(xiàn)紫紅色陽性反應(yīng)。五、注意事項（或?qū)嶒?yàn)特別提示）CK對照：另取同樣材料一份，不經(jīng)1mol/LHCl水解，直接在Schiff試劑中染色，然后按照步驟（4）～（6）制片觀察。六、實(shí)驗(yàn)報告結(jié)果與討論思考題實(shí)驗(yàn)6考馬斯亮藍(lán)R250（CoomassieblueR250）染色法觀察細(xì)胞骨架一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆談又参锛?xì)胞內(nèi)微絲的染色方法。二、實(shí)驗(yàn)原理真核細(xì)胞質(zhì)中有錯綜復(fù)雜的纖維網(wǎng)，稱為細(xì)胞骨架（cytoskeleton）。根據(jù)纖維的直徑分為微絲（microfilament,MF,7nm）、微管（microtubule,MT,25nm）、中間纖維（intermediatedfilament,IF,10nm）。此外，還散布著一些比微絲還細(xì)的纖維（3～6nm）。目前觀察細(xì)胞骨架的主要手段有電鏡、間接免疫熒光技術(shù)、酶標(biāo)、組織化學(xué)等。微絲是肌動蛋白構(gòu)成的纖維，稱為F-actin。單根微絲直徑約7nm，在光學(xué)顯微鏡下看不到。本實(shí)驗(yàn)觀察到的是由微絲平行排列組成的纖維束，在動物細(xì)胞里稱為“應(yīng)力纖維”（stressfiber）應(yīng)力纖維在體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞中尤為發(fā)達(dá)。一般當(dāng)細(xì)胞充分鋪展時，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色，可看到沿細(xì)胞長軸伸展的粗大纖維束，即應(yīng)力纖維。應(yīng)力纖維上還周期性地分布著微絲結(jié)合蛋白，包括-輔肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、類肌鈣蛋白等。應(yīng)力纖維的端部連接著質(zhì)膜上的粘著斑，與加強(qiáng)細(xì)胞對基質(zhì)的附著、鋪展及維持細(xì)胞特定形狀有關(guān)?？捡R斯亮藍(lán)R250可以染各種蛋白，并非特異染色微絲，實(shí)驗(yàn)中用1％TritonX－100抽提掉胞質(zhì)中除骨架蛋白外的其他蛋白，能清晰地顯示微絲束。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟考馬斯亮藍(lán)R-250染動物細(xì)胞微絲儀器光學(xué)顯微鏡、溫箱、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備材料平皿，直徑30mm小染缸，載波片，蓋玻片條（剪掉一角以區(qū)別細(xì)胞正反面）。體外培養(yǎng)的貼壁生長的HeLa細(xì)胞試劑細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM、RPMI－1640等），磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH7.4），0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.3），M－緩沖液，1％TritonX-100（用M－緩沖液配制），0.2%考馬斯亮藍(lán)R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制）。實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞培養(yǎng)在平皿中的蓋玻片上，尚未致密時即可使用。取出蓋玻片，用PBS洗3次。用1％TritonX-100處理25～30min，室溫或37度均可。立即用M-緩沖液輕輕洗細(xì)胞3次。略晾干后，用3.0%戊二醛固定細(xì)胞5～15min。PBS洗數(shù)次，濾紙吸干。用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色1小時，然后用水小心沖洗，蒸餾水沖洗，空氣中略干燥。普通光學(xué)顯微鏡下用40×物鏡或油鏡觀察?？捡R斯亮藍(lán)R-250染植物細(xì)胞微絲實(shí)驗(yàn)步驟：取洋蔥鱗莖表皮，大小約1cm2，放入盛有0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（6.8）的小燒杯中。吸去緩沖液，用1％TritonX-100處理洋蔥表皮20～30min。除去TritonX-100，用M-緩沖液充分洗3次，每次約10min。加3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制，pH6.8）固定0.5~1h。用PBS洗3次，濾紙吸去殘液。0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色30min。蒸餾水洗數(shù)遍。將樣品置于載玻片上，加蓋玻片，光學(xué)顯微鏡下觀察。五、注意事項（或?qū)嶒?yàn)特別提示）六、實(shí)驗(yàn)報告結(jié)果與討論思考題實(shí)驗(yàn)7動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)與觀察實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖炀氄莆占?xì)胞的傳代培養(yǎng)法。二、實(shí)驗(yàn)原理傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一。也是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長。這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)所需。傳代要在嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行，每一步都需要認(rèn)真仔細(xì)的無菌操作。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑材料：培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75％酒精棉球，酒精燈，培養(yǎng)細(xì)胞。藥品：培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶。儀器：C02培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈工作臺。四、實(shí)驗(yàn)步驟1．人進(jìn)入無菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒雙手。2．倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置37℃下預(yù)熱。3．超凈臺臺面應(yīng)整潔，用0.1％新潔爾滅溶液擦凈。4．打開超凈臺的紫外燈照射臺面20min左右，關(guān)閉超凈臺的紫外燈，打開抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。5．點(diǎn)燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。6．將培養(yǎng)用液瓶口用75％酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。7．倒掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2—3mLHanks液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。8．每個大培養(yǎng)瓶加入1mL胰酶，小瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細(xì)胞提早脫落入消化液中。9．加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7～10mL／大瓶，3～5mL／小瓶)制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。10．對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，步驟7-9不做?？蓪⒓?xì)胞懸液進(jìn)行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。五、注意事項（或?qū)嶒?yàn)特別提示）1．傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每一種細(xì)胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應(yīng)嚴(yán)格分開。2．每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折旋光性好，生長致密時即可傳代。3．如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染跡象，應(yīng)立即采取措施，一般應(yīng)棄置污染的細(xì)胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BSS或培養(yǎng)基反復(fù)清洗，隨后培養(yǎng)基中加入較大量的抗菌素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基等。六、實(shí)驗(yàn)報告1、結(jié)果與討論2、思考題第二部分綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)8MTT法檢測化學(xué)藥物對體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖及存活的影響一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庹莆誐TA法的基本原理及基本過程。二、實(shí)驗(yàn)原理測試藥物對細(xì)胞增殖的影響，對細(xì)胞的殺傷作用，一般采用集落形成法，生長曲線法等。這些方法作用量大，費(fèi)時對于處理大量樣品和受試對象，則更為繁瑣。1983年，T.Mosmann結(jié)合微空培養(yǎng)方法，利用細(xì)胞對tetrazolium(簡稱MTT)的還原作用，建立了比色檢測法。經(jīng)過以后的改進(jìn)，特別是M.C.Alley(1988)的研究，逐漸成熟，稱為MicrocultureTetrazoliumAssay，簡稱MTA。該法快速、簡便、使用面廣。在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下，結(jié)果重復(fù)性好，敏感性高。對于大規(guī)模篩選藥物，可在短時間內(nèi)處理大量樣品。MTA法是利用活細(xì)胞線粒體中呼吸鏈對tetrazolium的還原作用而生成有色的MTTforrmazan，其生成量與活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞的種類、作用時間等相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞種類、作用時間一定時，則MTTformazan的生成量與細(xì)胞數(shù)量呈直線相關(guān)。比色測定MTTformazan的量就可測知活細(xì)胞數(shù)量。此法與集落形成法、生長曲線法等的測定結(jié)果有良好的相關(guān)性。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑器材微孔細(xì)胞培養(yǎng)板、微量加樣器、酶聯(lián)免疫檢測儀、顯微鏡、細(xì)胞計數(shù)板。材料HeLa細(xì)胞株。試劑1．培養(yǎng)液2％RPMI164085ml小牛血清15ml青霉素10000IU鏈霉素10mg2mg/mlMTTMTT200mg，加入培養(yǎng)液100ml溶解后，用黑紙包好貯存于4℃。3％小牛血清－磷酸緩沖鹽水（3％FCS-PBS）PBS:NaCl7.6gKCl0.15gNa2HPO4.12H2O2.9gKH2PO40.15g加蒸餾水至1000ml取PBS970ml加滅活小牛血清30ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.細(xì)胞接種：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用培養(yǎng)基制成2×105細(xì)胞/ml的懸液。用微量加樣器接種于微孔板中，每孔100ul，邊緣孔中不加細(xì)胞，僅加培養(yǎng)基作為無細(xì)胞空白。37±0.5℃過夜或5％CO2培養(yǎng)箱中4h，使細(xì)胞貼壁。2.加藥：棄去培養(yǎng)液，于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)孔中加入一定濃度的H2O2，每孔100ul，留CK孔不加藥，而加入等體積培養(yǎng)液作空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)24h。3.加MTT，傾棄藥液，每孔中加入200ul培養(yǎng)基洗一次，3min后傾棄，每孔加入MTT溶液50ul，繼續(xù)培養(yǎng)3-4h。洗板：傾去MTT，以3％FCS-PBS洗二次，每次每孔約加入200ul。最后傾干孔內(nèi)液體。溶解：每孔加入DMSO（二甲基亞砜）200ul，室溫放置30min，并不時搖動。測量：以無細(xì)胞空白孔為零點(diǎn)，測量OD550或OD570，做好記錄。以空白對照為100％，按下式計算細(xì)胞的存活率：存活率%=×100%五、注意事項（或?qū)嶒?yàn)特別提示）六、實(shí)驗(yàn)報告結(jié)果與討論思考題細(xì)生大禮包第三彈.線粒體與細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換PART1教學(xué)大綱1.教學(xué)內(nèi)容第一節(jié)線粒體的基本特征第二節(jié)細(xì)胞呼吸與能量轉(zhuǎn)換第三節(jié)線粒體與疾病2.教學(xué)基本要求掌握：線粒體是由雙層單位膜套疊而成的封閉性膜囊結(jié)構(gòu)，線粒體的化學(xué)組成（尤其是各區(qū)間標(biāo)志酶），細(xì)胞呼吸的概念和特點(diǎn)，細(xì)胞能量的轉(zhuǎn)換分子——ATP，丙酮酸在線粒體內(nèi)生成乙酰輔酶A，三羧酸循環(huán)是各種有機(jī)物進(jìn)行最后氧化的過程，也是各類有機(jī)物相互轉(zhuǎn)化的樞紐，呼吸鏈概念，氧化過程中伴隨磷酸化的藕聯(lián)，1分子葡萄糖完全氧化釋放的能量，化學(xué)滲透假說。熟悉：線粒體的形態(tài)數(shù)量與細(xì)胞的類型和生理狀態(tài)有關(guān)，線粒體的遺傳體系，核編碼蛋白質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)，葡萄糖在細(xì)胞質(zhì)中的糖酵解，三羧酸循環(huán)，一分子葡萄糖經(jīng)過三羧酸循環(huán)的總反應(yīng)式，呼吸鏈和ATP合酶復(fù)合體是氧化磷酸化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，根據(jù)結(jié)合變構(gòu)機(jī)制ATP的合成。了解：線粒體的起源與發(fā)生，NADH+H+通過線粒體內(nèi)膜的穿梭機(jī)制，F(xiàn)0基片在ATP合成中的作用，與細(xì)胞死亡有關(guān)的線粒體機(jī)制，線粒體控制細(xì)胞死亡的假說，疾病過程中的線粒體變化，mtDNA突變與疾病。3.重點(diǎn)與難點(diǎn)重點(diǎn)：線粒體的組成結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呼吸與能量轉(zhuǎn)換。難點(diǎn)：電子傳遞鏈，氧化磷酸化，ATP生成。Part2題庫一．填空題線粒體是細(xì)胞的基地，其主要功能是。（七）線粒體的嵴由向內(nèi)腔突起而成，其上面的帶柄結(jié)構(gòu)是，由、和三部分組成，該結(jié)構(gòu)具有活性。功能是。（七）線粒體各部分結(jié)構(gòu)中有各自特殊的標(biāo)記酶，它們分別在外膜是________，外腔是___________，內(nèi)膜是__________，膜間腔是______________。（七）線粒體基因組共由個堿基組成，含個基因，可分別編碼rRNA、tRNA和蛋白質(zhì)。（七）細(xì)胞氧化的過程包括三個步驟：①；②；③。（七）答案：1.生物氧化和能量轉(zhuǎn)換營養(yǎng)物質(zhì)在線粒體內(nèi)氧化并與磷酸化藕聯(lián)生成ATP內(nèi)膜基粒頭部炳部基片酶催化ADP磷酸化生成ATP單胺氧化酶細(xì)胞色素氧化酶腺苷酸激酶1656937糖酵解三羧酸循環(huán)氧化磷酸化單項選擇1,可在光學(xué)顯微鏡下見到的結(jié)構(gòu)是A．微粒體B．基粒C．溶酶體D．線粒體E．受體2由兩層單位膜圍成的細(xì)胞器是A．高爾基復(fù)合體B．溶酶體C。線粒體D．微體E．內(nèi)質(zhì)網(wǎng)3線粒體的主要功能是A．貯存Ca2+B．DNA復(fù)制C．合成蛋白質(zhì)D．合成糖原E．以上都不是4糖的有氧氧化過程中丙酮酸、CO2＋H2O發(fā)生在A．核蛋白體B．內(nèi)質(zhì)網(wǎng)C．溶酶體D．細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)E．線粒體5細(xì)胞內(nèi)線粒體在氧化磷酸化過程中生成A．GTPB．cAMPC．AMPD．ATPE．cGMP6線粒體中三羧酸循環(huán)反應(yīng)進(jìn)行的場所是A．基質(zhì)B．內(nèi)膜C．基粒D．嵴膜E．膜間腔7線粒體中ADP—ATP發(fā)生在A．基質(zhì)B．內(nèi)膜C．膜間腔D．基粒E．嵴膜8在光鏡下可見線粒體的形狀為A．分技狀B．棒狀、線狀或顆粒狀C．星狀D．卵圓形E．以上形狀都有9在電鏡下觀察線粒體的形狀呈A短桿狀B．環(huán)形C．啞吟形D．星形E．以上形狀都有可能10線粒體嵴的形狀是A．板層狀峪B．縱行嵴C．管狀嵴D．鋸齒狀嵴E．以上形狀都有可能11真核細(xì)胞的核膜外DNA存在于A．核膜B．線粒體C．內(nèi)質(zhì)網(wǎng)D．核糖體E．高爾基復(fù)合體12細(xì)胞消耗游離氧的代謝發(fā)生在A．線粒體B．染色體C．溶酶體D．高爾基復(fù)合體E．中心體13下列哪一種說法描述線粒體DNA較為確切A．線狀DNAB．環(huán)狀DNAC．是與核DNA密碼略有不同的環(huán)狀DNAD．與核DNA密碼略有不同的線狀DNAE．mtDNA含線粒體全部蛋白的遺傳信息14動物細(xì)胞中含有DNA分子并能產(chǎn)生ATP的細(xì)胞器是A．中心體B．溶酶體C．核糖體D．線粒體E．高爾基復(fù)合體15細(xì)胞氧化過程中，乙酰輔酶A的生成發(fā)生在A．線粒體基質(zhì)B．線粒體內(nèi)膜C．線粒體外膜D．細(xì)胞基質(zhì)E．核基質(zhì)16關(guān)于線粒體的主要功能敘述A．由丙酮酸形成乙酰輔酶AB．進(jìn)行三羧酸循環(huán)C．進(jìn)行電子傳遞、釋放能量并形成ATPD．B＋C最確切E．A＋B＋C最確切17線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)的特點(diǎn)是A．脫羧產(chǎn)生CO。、放出電子B．脫羧產(chǎn)生CO。、放出氫原子C．放出氫原子和電子D．脫羧產(chǎn)生CO。、放出ADPE．脫羧放出ATP18葡萄糖分解的三個階段的順序是A．糖酵解一丙酮酸脫氫、三羧酸循環(huán)一電子傳遞和氧化磷酸化B．糖酵解一電子傳遞和氧化磷酸化一丙酮酸脫氫、三羧酸循環(huán)C．丙酮酸脫氫、三羧酸循環(huán)一糖酵解一電子傳遞和氧化磷酸化D．丙酮酸脫氫、三羧酸循環(huán)一電子傳遞和氧化磷酸化一糖酵解E．電子傳遞和氧化磷酸化一丙酮酸脫氫、三羧酸循環(huán)一糖酵解19一分子葡萄糖徹底氧化后可以產(chǎn)生的能量有A．34個ATPB．36個ATPC、38個ATPD．40個ATPE．42個ATP20線粒體半自主性的一個重要方面體現(xiàn)于下列哪一事實(shí)A．線粒體DNA（mtDNA）能獨(dú)立復(fù)制B．線粒體含有核糖體C．在遺傳上由線粒體基因組和細(xì)胞核基因組共同控制D．mtDNA與細(xì)胞核DNA的遺傳密碼有所不同E．mtDNA在G。期合成答案：1-5DCEED6-10ADBEE11-15BACDA16-20EEACC多項選擇1關(guān)于線粒體的結(jié)構(gòu)和功能哪些說法不正確A．不同生物的線粒體的峪形態(tài)相同B．細(xì)胞內(nèi)形成ATP的中心C．可完成細(xì)胞氧化的全過程D．是雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器2細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)氧化的特點(diǎn)是A．氧化產(chǎn)生的能量主要以熱能形式傳給細(xì)胞B．在常溫常壓下進(jìn)行，既不冒煙也不燃燒C．不同代謝過程需要不同的酶催化D．氧化放能是分步、小量和逐漸進(jìn)行的3線粒體的特征有A．細(xì)胞內(nèi)分解各種物質(zhì)的場所B．細(xì)胞內(nèi)供能中心C．具雙層膜結(jié)構(gòu)D．光鏡下呈線狀或顆粒狀4線粒體的超微結(jié)構(gòu)有A．外膜B．內(nèi)膜C．膜間腔D．基質(zhì)腔5發(fā)生在線粒體內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)有A．三羧酸循環(huán)B．丙酮酸一乙酰輔酶AC．ADP—ATPD．糖酵解6線粒體常分布于細(xì)胞中的部位有A．細(xì)胞需能區(qū)域B．高爾基體四周C．粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近D．核周圍7線粒體是細(xì)胞的動力工廠在于A．含有DNAB．含有產(chǎn)能有關(guān)的酶C．是產(chǎn)生能量的場所D．是蛋白質(zhì)合成的場所8在線粒體膜上進(jìn)行的代謝過程有A．三羧酸循環(huán)B．糖酵解C．丙酮酸一乙酰輔酶AD．氧化磷酸化9光鏡下線粒體的形狀可能是A．顆粒狀B．分枝狀C．棒狀D．線狀10清除衰老的線粒體是通過A．溶酶體的粒溶作用B．溶酶體的異溶作用C．溶酶體的自溶作用D．細(xì)胞膜的外吐11線粒體的基粒結(jié)構(gòu)可分為A．頭部B．囊腔C．柄部D．基部12含核酸成分的細(xì)胞器有A．染色體B．核糖體C．高爾基復(fù)合體D．線粒體13識別線粒體有關(guān)部位的標(biāo)志酶是A．單胺氧化酶B．腺苷酸激酶C．細(xì)胞色素氧化酶D．mtDNA復(fù)制的酶14屬膜相結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器是細(xì)胞核B．溶酶體C．線粒體D．中心體答案ACBCDBCDABCDABCABCDBCDACDCACDABDABCDABC名詞解釋1線粒體2線粒體嵴3基本微粒4半自主性細(xì)胞器5F1偶聯(lián)因子6呼吸鏈7mtDNA8細(xì)胞呼吸9三羧酸循環(huán)10氧化磷酸化答案1線粒體（mitochondria）——是存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一個重要的細(xì)胞器，由內(nèi)外二層單位膜圍成的膜相結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜向內(nèi)凸起形成峪，峪上的顆粒為基本微粒，它是氧化磷酸化的關(guān)鍵裝置。線粒體內(nèi)室是進(jìn)行三羧酸循環(huán)的場所，線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換的系統(tǒng)，其主要功能是產(chǎn)生ATP，提供細(xì)胞生命活動所需要的能量。線粒體嵴（mitochondriacristae）——是指線粒體內(nèi)膜向內(nèi)凹陷結(jié)構(gòu)，峪可增加細(xì)胞內(nèi)線粒體內(nèi)膜面積，有利于線粒體內(nèi)外的物質(zhì)交換。在線粒體嵴膜上，有許多有柄小球體，稱為基本微粒（基粒），它是偶聯(lián)磷酸化的關(guān)鍵裝置，即ATP的產(chǎn)生部位?；疚⒘＃╡lementaryparticle）——簡稱為基粒，是線粒體峪膜上的有柄小球體，也稱ATP酶復(fù)合體，是偶聯(lián)磷酸化的關(guān)鍵裝置。它由3部分組成：即頭部，為可溶性ATP酶（F1）；柄部，有對寡霉素敏感的蛋白（OSCP）；基部，有疏水蛋白（HP或F。），為質(zhì)子通道，并將頭柄部連結(jié)整合到線粒體的內(nèi)膜上。半自主性細(xì)胞器（semiautonomousorganelle）——線粒體能自我增殖，有mtDNA以及轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)的mtRNA、mt核糖體等。似乎線粒體是細(xì)胞內(nèi)一個獨(dú)立、自主的細(xì)胞器，但實(shí)際上它自身的遺傳系統(tǒng)貯存信息很少，不能為自己編碼全部蛋白質(zhì)，構(gòu)建線粒體的信息大部分來自細(xì)胞核DNA。因此，線粒體只能是一個半自主的細(xì)胞器，其遺傳上由線粒體基因組和細(xì)胞核基因組共同控制。F1偶聯(lián)因子（F1factor）——線粒體的基粒頭、柄部為F1偶聯(lián)因子，尤其是頭部的主要蛋白組成了DNA合成酶結(jié)構(gòu)，它使ADP磷酸化為ATP。頭部還有抑制ATP水解的酶蛋白，保護(hù)產(chǎn)生的ATP不被水解，因此F1因子是實(shí)現(xiàn)線粒體的氧化磷酸化功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。呼吸鏈(respiratorychain)---線粒體內(nèi)膜上由多個酶復(fù)合體組成的電子傳遞鏈叫呼吸鏈。呼吸鏈的成分有輔酶1（NAD）→黃酶（FAD）→輔酶Q→細(xì)胞色素b→c1→c→a等，它們按一定順序排列，可逆地接受和釋放電子和質(zhì)子，電子在逐級傳遞過程中釋放出能量，這些能量幫助質(zhì)子泵出內(nèi)膜外面，在膜間腔形成質(zhì)子濃度差透入基部，并通到柄、頭部，質(zhì)子的流動動力可以使ADP磷酸化為ATP。mtDNA（mitochondrialDNA）——即線粒體DNA，指存在于線粒體內(nèi)的DNA，mtDNA呈高度扭曲的雙股環(huán)狀。mtDNA能轉(zhuǎn)錄自身的mRNA、rRNA和tRNA，線粒體的蛋白質(zhì)約有10％是由mtDNA編碼的。如果沒有mtDNA編碼的mRNA、tRNA及核糖體，細(xì)胞核DNA也無法指令構(gòu)建線粒體。細(xì)胞呼吸（ellularrespiration）——細(xì)胞呼吸是指細(xì)胞利用氧氣氧化糖類或脂肪產(chǎn)生二氧化碳和水，同時放出能量形成ATP的生物氧化過程。細(xì)胞呼吸的主要步驟可簡單歸納為①糖酵解；②由丙酮酸形成乙酰輔酶A；③進(jìn)行三羧酸循環(huán)；④電子傳遞和化學(xué)滲透偶聯(lián)磷酸化。三羧酸循環(huán)（tricarboxylicacidcycle）——三羧酸循環(huán)發(fā)生在線粒體基質(zhì)中，是細(xì)胞呼吸的一個重要階段，由一系列的酶促反應(yīng)構(gòu)成。循環(huán)是從乙酰輔酶A與草酰乙酸結(jié)合成檸檬酸開始，經(jīng)過多次脫氫、脫羧作用，最后轉(zhuǎn)化成草酸乙酸，草酰乙酸又和乙酰輔酶A結(jié)合生成檸檬酸再進(jìn)入循環(huán)。脫下的氫經(jīng)呼吸鏈遞氫遞電子體系偶聯(lián)氧化過程生成ATP。氧化磷酸化（oxidativephosphorylation）——在有氧代謝的三羧酸循環(huán)等反應(yīng)中，脫下的氫首先與NAD或FAD結(jié)合成NADH和FADH2，經(jīng)呼吸鏈中其他成分的傳遞，NAD+和FAD從氧化底物中取得的電子與O2分子結(jié)合，提供的能量用以驅(qū)動ADP＋Pi轉(zhuǎn)變成為ATP的反應(yīng)，這就是氧化磷酸化作用，把NADH的氧化能轉(zhuǎn)換成ATP高能磷酸鍵的能。Part3拓展閱讀三羧酸循環(huán)的故事從前有個女孩檸檬（1），因?yàn)橹啬休p女，母親又生了個弟弟叫蘋果，十歲時父母就把她遺棄，帶著弟弟遠(yuǎn)赴美國，留給她一筆撫養(yǎng)費(fèi)，她是在福利院度過了八年的孤苦日子。十八歲后她離開了福利院，有天在海邊游玩，愛上了一只烏賊（2），可是烏賊并不喜歡她，于是她費(fèi)盡心機(jī)改變自己，終于有天，她變得與先前的自己完全相異（3），可烏賊還是不喜歡她。心灰意冷之際，她選擇了離開，不再做一個可憐的付出者而得不到絲毫的回報，整整幾天坐在梧桐樹下（4）默默流淚，黯然神傷。美麗的琥珀路過，心生憐憫，走到檸檬邊上坐下。時間在緩慢流逝，檸檬把先前發(fā)生的點(diǎn)點(diǎn)滴滴都傾訴給善良的琥珀聽，琥珀不停安慰著她，并鼓勵她忘掉過去，重新開始。兩人如此投機(jī)，決定結(jié)為姐妹，從此以后檸檬就成了琥珀的妹妹（5），她再也不是一個無依無靠的人，也算琥珀家人了（6）。后來她和琥珀一同到鹽湖城（7）游玩，命運(yùn)總是如此捉弄人，在那個城市的街頭，她遇見了她的家人，在茫茫人海中，她一眼就認(rèn)出了蘋果（8）。就在她準(zhǔn)備轉(zhuǎn)身離開的時候，她的父親草酰乙酸（9）和母親輔酶A（10）也認(rèn)出了自己的親生女兒，也許是隨著年齡的增長，他們越發(fā)覺得對不起自己的親生骨肉，希望以后能給檸檬創(chuàng)造優(yōu)越的生活條件彌補(bǔ)當(dāng)年遺棄她的過錯。可倔強(qiáng)的檸檬拒絕了，她不愿意原諒當(dāng)年絕情遺棄她的父母，她選擇自食其力。琥珀輕輕拭干檸檬眼角的淚珠，告訴她說：“我們的檸檬不是沒有眼淚的檸檬，而是喊著淚奔跑的檸檬！”

（1）檸檬酸（2）順烏頭酸（3）異檸檬酸（4）α-酮戊二酸（5）琥珀酰輔酶A（6）琥珀酸（7）延胡索酸（8）蘋果酸（9）草酰乙酸（10）乙酰輔酶A.細(xì)胞骨架與細(xì)胞的運(yùn)動Part1教學(xué)大綱1.教學(xué)內(nèi)容第一節(jié)微管第二節(jié)微絲第三節(jié)中間纖維第四節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動第五節(jié)細(xì)胞骨架與疾病2.教學(xué)基本要求掌握：細(xì)胞骨架概念，細(xì)胞骨架分布，微管蛋白與微管的結(jié)構(gòu)，微管組織中心概念，γ-微管蛋白環(huán)形復(fù)合體概念，微管的動態(tài)不穩(wěn)定性，中心體概念，微管的“踏車運(yùn)動”，微管的功能，馬達(dá)蛋白分為哪3個家族，微管的驅(qū)動蛋白與動力蛋白的運(yùn)輸方向及特點(diǎn)，肌動蛋白與微絲的結(jié)構(gòu)，微絲的功能，中間纖維的結(jié)構(gòu)和類型，中間纖維的功能。熟悉：微管結(jié)合蛋白的概念、種類、分布、功能，微管裝配的3個時期，微管的體外裝配，微管的體內(nèi)裝配，微絲的組裝過程分為、成核、聚合和穩(wěn)定三個階段，微絲的組裝可用踏車模型和非穩(wěn)態(tài)動力學(xué)模型來解釋，微絲結(jié)合蛋白及其功能，中間纖維的組裝特點(diǎn)，中間纖維的裝配與調(diào)節(jié)。了解：影響微管的組裝和解聚的因素，影響微絲組裝的因素，肌肉收縮的分子基礎(chǔ)，中間纖維的發(fā)現(xiàn)和命名，微管與細(xì)胞運(yùn)動，微絲與細(xì)胞運(yùn)動，細(xì)胞運(yùn)動的調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)胞骨架與腫瘤，細(xì)胞骨架蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)疾病，細(xì)胞骨架與遺傳性疾病。3.重點(diǎn)與難點(diǎn)重點(diǎn)：微管及微絲的組成、組裝和功能。難點(diǎn)：微管的組裝，踏車模型。Part2題庫填空題1.真核細(xì)胞的細(xì)胞骨架有、和組成。（六）2.微管的組裝是由________和_________首先形成二聚體，進(jìn)一步由二聚體組裝成_____根_________呈縱向排列而成。一些藥物如___________和___________可以引起微管分解。（六）3構(gòu)成微管的蛋白有兩類：________和________。（六）4微管共有種類型。其中具有根原纖維，具有根原纖維，具有根原纖維。（六）5微管的主要成分是，；微絲的主要成分是。（六）6在細(xì)胞骨架系統(tǒng)中較為穩(wěn)定的一種骨架纖維是____，其直徑約為____。（六）7細(xì)胞中微管組織中心包括鞭毛的、染色體的和位于細(xì)胞質(zhì)中的。（六）8中間纖維是由中間纖維蛋白單體組成，每個蛋白單體由三個區(qū)域組成：_____________、____________和____________。在橫切面上中間纖維有個蛋白單體。（六）答案：1.微管微絲中間纖維αβ13原纖維秋水仙素紫杉醇α管蛋白β管蛋白3單管13二聯(lián)管23三聯(lián)管33微管蛋白肌動蛋白絲中間纖維10nm頭部桿狀區(qū)尾部32單項選擇1下列哪種結(jié)構(gòu)不由微管構(gòu)成A．纖毛B．紡錘體C．鞭毛D．染色體E．中心體2細(xì)胞骨架系統(tǒng)的主要化學(xué)成分是A．多糖B．脂類C．蛋白質(zhì)D．核酸E．磷酸3電鏡下中心粒的超微結(jié)構(gòu)微管排列是A．9組單管B．9組二聯(lián)管C．9組三聯(lián)管D．6組二聯(lián)管E．6組三聯(lián)管4關(guān)于微管的化學(xué)組成哪項是錯誤的A．a(chǎn)微管蛋白B．b微管蛋白C．MAPD．tau蛋白E．組蛋白5微管的形態(tài)一般是A．中空圓柱體B．中空長方體C．中空圓球形D．實(shí)心纖維狀E．以上都是6微管蛋白的異二聚體上具有哪種三磷酸核苷的結(jié)合位點(diǎn)A．UTPB．CTPC．GTPD．ATPE．TTP7纖毛、鞭毛的基體由下列哪種微管構(gòu)成A．二聯(lián)管B．三聯(lián)管C．單管D．四聯(lián)管E．以上都不是8關(guān)于微管的超微結(jié)構(gòu)，下列哪項是錯誤的A．外徑25urnB．呈中空圓柱狀C．管壁厚10nmD．管壁由13條原纖維組成E．原纖維由微管蛋白組成9關(guān)于微管組裝下列哪項敘述不對A．微管的組裝是分步驟進(jìn)行的B．微管兩端的增長速度相同C．微管的極性對微管的增長具有重要作用D．微管蛋白的聚合和解聚是可逆的E．微管可以隨細(xì)胞的生命活動不斷地組裝和去組裝10下列哪項與微管的功能無關(guān)A．受體作用B．支持功能C．細(xì)胞運(yùn)動D．物質(zhì)運(yùn)輸E．信息傳遞11微絲中最主要的化學(xué)成分是A．原肌球蛋白B．肌鈣蛋白C．動力蛋白D．肌動蛋白E．穩(wěn)定因子結(jié)合蛋白12有關(guān)肌肉收縮原理，下列哪項敘述不對A．當(dāng)Ca2+濃度下降時，原肌球蛋白構(gòu)型改變，觸發(fā)肌絲滑行B．肌肉放松時，細(xì)肌絲中的原肌球蛋白隔在肌動蛋白與橫橋之間C．肌肉放松時，細(xì)肌絲不與粗肌絲結(jié)合在一起D．橫紋肌收縮是肌原纖維的細(xì)肌絲和粗肌絲相互滑動造成的E．橫紋肌收縮過程需要ATP提供能量13關(guān)于肌動蛋白的敘述錯誤的是A．G一肌動蛋白與F一肌動蛋白可互相轉(zhuǎn)變B．肌動蛋白上有肌球蛋白結(jié)合位點(diǎn)，但無二價陽離子的結(jié)合位點(diǎn)C．F一肌動蛋白的聚合過程不需能量D．肌動蛋白是微絲的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)E．微絲受到肌動蛋白一結(jié)合蛋白的調(diào)節(jié)14能特異性阻止微管蛋白聚合的物質(zhì)是A．Na+B．Mg2+C．秋水仙素D．細(xì)胞松弛素BE．鬼筆環(huán)肽15微絲在非肌細(xì)胞中與下列哪種功能無關(guān)A．變形運(yùn)動B．支架作用C．變皺膜運(yùn)動D．吞噬活動E．氧化磷酸化16對微絲有專一性抑制作用的物質(zhì)是A．秋水仙素B．細(xì)胞松弛素BC．長春新堿D．Mg2+E．K+17下列哪項敘述不符合肌球蛋白A．細(xì)胞中的肌球蛋白一般由6條多肽鏈組成B．肌球蛋白分子的2條輕鏈形成桿狀部C．肌球蛋白分子頭部聚集在肌球蛋白纖維的兩極D．肌球蛋白的頭部具有ATP酶活性E．肌球蛋白頭部存在肌動蛋白結(jié)合位點(diǎn)18在微絲組分中起調(diào)節(jié)作用的是A．肌動蛋白B．肌球蛋白C．a(chǎn)一輔肌球蛋白D．紐帶蛋白E．原肌球蛋白19秋水仙素對紡錘絲的抑制作用可使細(xì)胞分裂停于A．G。期B．前期C．中期D．后期E．末期20關(guān)于非肌細(xì)胞分裂時縊縮環(huán)，下列哪種敘述不對A．縊縮環(huán)由肌球蛋白和肌動蛋白構(gòu)成B．縊縮環(huán)含微絲成分C．抗肌動蛋白抗體可加快縊縮環(huán)的產(chǎn)生D．在胞質(zhì)分割開始時產(chǎn)生縊縮環(huán)E．胞質(zhì)分裂完成時縊縮環(huán)解聚消失答案：DCCAACBCBADABCEBBECC多項選擇1.關(guān)于微管的敘述正確的是A．呈中空圓柱體B．外徑25nmC．13條原纖維包圍而成D．主要存在溶酶體內(nèi)2.微管蛋白的聚合所需的三磷酸核苷是A．TTPB．GTPC．ATPD．UTP3.屬于細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的是A．微管B．微絲C．中等纖維D．微梁網(wǎng)格4.微管的功能包括A．支持功能B．細(xì)胞運(yùn)動C．物質(zhì)運(yùn)輸D．信息傳遞5.微管在細(xì)胞中的存在形式有A．單管B．二聯(lián)管C．三聯(lián)管D．四聯(lián)管6.下列哪些因素促進(jìn)微管的組裝A．GTPB．Mg2+C．MAPD．高Ca2+7.核骨架可能與下列哪些方面有關(guān)A．蛋白質(zhì)的加工B．蛋白質(zhì)翻譯C．DNA復(fù)制D．染色質(zhì)包裝8.微絲的功能主要包括A．參與肌細(xì)胞收縮B．參與胞質(zhì)環(huán)流C．參與細(xì)胞膜運(yùn)動D．參與構(gòu)成細(xì)胞骨架9.下列哪些纖維屬中等纖維A．肌原纖維B．波形蛋白纖維C．神經(jīng)蛋白纖維D．角質(zhì)蛋白纖維10.下列哪些細(xì)胞中常含有波形蛋白纖維A．骨骼肌細(xì)胞B．平滑肌細(xì)胞C．淋巴細(xì)胞D．成纖維細(xì)胞11含有動力蛋白的是A．線粒體B．溶酶體C．纖毛D．鞭毛12下列屬微管結(jié)合蛋白的是A．穩(wěn)定因子結(jié)合蛋白B．MAPC．tau蛋白D．蓋帽因子結(jié)合蛋白13.參與