GBT 31402-2023 塑料和其他無孔材料表面抗菌活性的測定

塑料和其他無孔材料表面抗菌活性的測定2023-11-27發(fā)布 I 2規(guī)范性引用文件 l3術(shù)語和定義 4材料 24.1試驗(yàn)細(xì)菌 24.2試劑、培養(yǎng)基與溶液 2 6儀器滅菌和菌種保藏 46.1干熱滅菌 6.2高壓蒸汽滅菌 46.3玻璃器皿的準(zhǔn)備 46.4菌種的保藏 57試驗(yàn)步驟 57.1細(xì)菌預(yù)培養(yǎng) 7.2試樣的制備 57.3接種液的制備 57.4試樣接種 57.5接種試樣的培養(yǎng) 67.6試樣上的細(xì)菌回收 77.7平板培養(yǎng)法測定活菌數(shù) 78試驗(yàn)結(jié)果 78.1活菌數(shù)測定 78.2試驗(yàn)有效的條件 88.3抗菌活性值的計(jì)算 88.4抗菌效果 9重復(fù)性與再現(xiàn)性 810試驗(yàn)報(bào)告 8附錄A(規(guī)范性)生物材料的質(zhì)量要求 附錄B(資料性)重復(fù)性和再現(xiàn)性 附錄NA(資料性)抗菌率的計(jì)算 參考文獻(xiàn) I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件代替GB/T31402—2015《塑料塑料表面抗菌性能試驗(yàn)方法》,與GB/T31402—2015相a)更改了“范圍”,適用范圍由塑料擴(kuò)展為塑料和其他無孔材料，補(bǔ)充了有關(guān)本文件不涉及的材料和產(chǎn)品的描述(見第1章，2015年版的第1章);b)更改了“試驗(yàn)細(xì)菌”使用要求(見4.1,2015年版的4.1);c)更改了“試樣的制備”中清洗試樣的要求(見7.2,2015年版的7.2)。本文件等同采用ISO22196:2011《塑料和其他無孔材料表面抗菌活性的測定》。本文件做了下列最小限度的編輯性改動：——用資料性引用文件GB/T19275—2003中的方法B替換了ISO846:1997中的方法C,兩個(gè)文件相關(guān)技術(shù)內(nèi)容完全一致(見第1章);——表1中列出了與測試菌種等同的國內(nèi)菌株號，并以腳注的形式加以說明；請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中國石油和化學(xué)工業(yè)聯(lián)合會提出。本文件由全國塑料標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC15)歸口。本文件起草單位：廣東省科學(xué)院微生物研究所(廣東省微生物分析檢測中心)、廣東迪美生物技術(shù)有海)有限公司、上海幗帆化工新材料有限公司、中星(廣州)納米材料有限公司、上海潤河納米材料科技有本文件于2015年首次發(fā)布，本次為第一次修訂。Ⅱ抗菌材料和產(chǎn)品因其全新的功能已被消費(fèi)者廣泛而迅速地認(rèn)可，該功能與傳統(tǒng)的材料保護(hù)功能具有明顯的差異。加入抗菌劑(殺菌劑)的產(chǎn)品能夠抑制細(xì)菌條件合適時(shí)在其表面生長，保持表面清潔和衛(wèi)生，同時(shí)具有最大程度減少抗菌劑擴(kuò)散對環(huán)境的影響的優(yōu)點(diǎn)。因此，抗菌技術(shù)對提高生活質(zhì)量具有重要作用。GB/T31402—2015的適用范圍主要為塑料表面。本文件適用范圍已擴(kuò)展到由其他無孔材料制成的產(chǎn)品表面，適用于上述各類產(chǎn)品?；贘ISZ2801的試驗(yàn)方法則維持不變。1塑料和其他無孔材料表面抗菌活性的測定經(jīng)過微生物學(xué)技術(shù)培訓(xùn)的人員才能進(jìn)行這些檢測工作，并應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)的消毒、滅菌和個(gè)人衛(wèi)生規(guī)范本文件描述了經(jīng)抗菌處理的塑料和其他無孔材料、產(chǎn)品(包括半成品)表面抗菌活性的評價(jià)方法。本文件不涉及因抗菌處理而帶來的次級效應(yīng)，如預(yù)防生物腐蝕和異味；也不適用于評價(jià)塑料材料的本文件不涉及建筑材料，除非將其以相同方式進(jìn)行抗菌處理。本文件不涉及抗菌紡織品，即使是表面經(jīng)涂層和層壓處理的產(chǎn)品(ISO20743[]適用)。本文件不涉及光催化材料及產(chǎn)品(ISO27447[8]適用)。試驗(yàn)結(jié)果宜包括對本文件的引用和試驗(yàn)條件。利用本文件所得結(jié)果表明，在本文件規(guī)定的試驗(yàn)條件下得到的抗菌活性，不代表在其他溫度、濕度、菌種和營養(yǎng)等試驗(yàn)條件下的抗菌活性。本方法的抗菌試驗(yàn)需要把最小劑量的抗菌劑(化學(xué)品)溶入到接種菌液中。建議試驗(yàn)人員按照ISO7218進(jìn)行微生物檢驗(yàn)操作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。ISO7218食品和動物飼料的微生物學(xué)微生物檢驗(yàn)的一般要求和指南(Microbiologyoffood3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。產(chǎn)品表面抑制細(xì)菌生長的性能或抗菌劑抑制產(chǎn)品表面細(xì)菌生長的效果?？咕鷦゛ntibacterialagent通過表面抗菌處理或添加到產(chǎn)品而抑制細(xì)菌在產(chǎn)品表面生長的藥劑?？咕钚灾礱ntibacterialactivity經(jīng)過抗菌處理后的產(chǎn)品和未經(jīng)抗菌處理后的產(chǎn)品在接種細(xì)菌培養(yǎng)后，得到的活菌數(shù)的對數(shù)的差值。2抗菌效果antibacterialeffectiveness使用抗菌劑處理的材料表面抑制細(xì)菌生長的能力，由抗菌活性值表征。4材料應(yīng)使用以下兩種細(xì)菌：a)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus);b)大腸桿菌(Escherichiacoli)。試驗(yàn)所用菌株如表1所示。如從表1以外的機(jī)構(gòu)獲取菌株，則該機(jī)構(gòu)應(yīng)是世界菌種保藏聯(lián)合會(WFCC)的成員，并且菌株應(yīng)與表1所列的相同，根據(jù)供應(yīng)商的使用說明制備菌種。菌種名稱菌株金黃色葡萄球菌ATCC6538P(CGMCC1.2910*)CIP53.156NCIB8625大腸桿菌ATCC8739(CGMCC1.2463)CIP53.126NBRC3972NCIB8545中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)是WFCC成員，與金黃色葡萄球菌ATCC6538P等同的國內(nèi)菌株號為CGMCC1.2910,與大腸桿菌ATCC8739等同的國內(nèi)菌株號為CGMCC1.2463。如需要也能采用其他菌種，使用其他菌種時(shí)，應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中注明并說明理所用水應(yīng)為蒸餾水或去離子水，電導(dǎo)率小于1μS/cm。所有試劑應(yīng)為分析純和/或適用微生物試驗(yàn)用的級別。非離子表面活性劑應(yīng)為聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯。所需生物材料如下：——D-葡萄糖；——酵母膏；——牛肉膏(按照附錄A);3——蛋白胨(按照附錄A);——酪蛋白胨；——大豆蛋白胨；——胰蛋白胨。應(yīng)使用4.2.3.2～4.2.3.6培養(yǎng)基。也可采用商品培養(yǎng)基，并應(yīng)按照生產(chǎn)商的說明書配制。將3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨和5.0g氯化鈉溶入1000mL蒸餾水或去離子水中。用蒸餾水或去離子水稀釋至500倍體積，并用氫氧化鈉溶液或鹽酸將pH值調(diào)整至6.8～7.2。用高壓蒸汽滅菌(見6.2)。如不立即使用，置于5℃~10℃條件下保藏。不應(yīng)使用存放7d或以上的1/500NB。將5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化鈉和15.0g瓊脂粉溶入1000mL蒸餾水或去離子水中。在電爐上或沸水水浴箱中加熱，攪拌直至瓊脂溶解。用氫氧化鈉溶液或鹽酸將pH值調(diào)整至7.0～7.2(25℃)。用高壓蒸汽滅菌(見6.2),如不立即使用，置于5℃~10℃條件下保藏。不應(yīng)使用存放30d或以上的營養(yǎng)瓊脂。將2.5g酵母膏、5.0g胰蛋白胨、1.0g葡萄糖和15.0g瓊脂粉溶入1000mL蒸餾水或去離子水中。在電爐上或沸水水浴箱中加熱，攪拌直到瓊脂溶解。用氫氧化鈉溶液或鹽酸將pH值調(diào)整至7.0~7.2(25℃)。用高壓蒸汽滅菌(見6.2)。如不立即使用，置于5℃~10℃條件下保藏。不應(yīng)使用存放30d或以上的平板計(jì)數(shù)瓊脂。將6mL～10mL加熱溶解的營養(yǎng)瓊脂倒入螺蓋試管中，用高壓蒸汽滅菌(見6.2)。滅菌后將試管與水平方向呈15°左右的角度放置，讓培養(yǎng)基凝固。如不立即使用，置于5℃~10℃條件下保藏。不應(yīng)使用存放30d或以上的斜面培養(yǎng)基。4.2.3.6大豆酪蛋白卵磷脂聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯培養(yǎng)液(SCDLP培養(yǎng)液)脂溶入1000mL蒸餾水或去離子水中，攪拌均勻后加入7.0g非離子表面活性劑，用氫氧化鈉溶液或鹽酸將pH值調(diào)整至6.8～7.2(25℃),高壓蒸汽滅菌(見6.2)。如不立即使用，置于5℃~10℃條件下保藏。不應(yīng)使用存放30d或以上的SCDLP培養(yǎng)液。注：在大多數(shù)情況下SCDLP是默認(rèn)的中和劑，在EN1040]和ASTME1054[]中規(guī)定了替代的中和劑選擇和評價(jià)方法。將34.0g磷酸二氫鉀放入1000mL容量瓶中，加入500mL去離子水或蒸餾水，攪拌溶解后，用氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至6.8～7.2(25℃)。加入去離子水或蒸餾水至1000mL。高壓蒸汽滅菌(見46.2)。不應(yīng)使用存放30d或以上的磷酸鹽緩沖液。將8.5g氯化鈉加入1000mL去離子水或蒸餾水中，攪拌均勻，制備生理鹽水。以生理鹽水稀釋磷酸鹽緩沖液(4.2.3.7)至800倍體積。高壓蒸汽滅菌(見6.2)。如不立即使用，置于5℃~10℃條件下保藏。不應(yīng)使用存放30d或以上的磷酸鹽緩沖生理鹽水。5.1干熱滅菌器：溫度保持在160℃~180℃,溫度波動不超過±2℃。5.2高壓蒸汽滅菌鍋：溫度保持在121℃±2℃,壓力保持在103kPa±5kPa。5.3帶攪拌的加熱電爐或水浴箱。5.6移液器：帶有1000μL的吸頭，滅菌后使用。5.7培養(yǎng)箱：在設(shè)定溫度下，溫度波動不超過士1℃。5.10接種環(huán)：直徑4mm,滅菌后使用。5.11覆蓋膜：不影響細(xì)菌生長并且不吸水(以聚乙烯、聚丙烯或聚對苯二甲酸乙二醇酯制成等)。膜厚度宜在0.05mm～0.10mm之間。5.12帶螺蓋試管。5.13培養(yǎng)皿：直徑90mm～100mm,滅菌后使用。5.14紗布或脫脂棉。5.151000mL容量瓶。5.16制備培養(yǎng)基所需要的具塞錐形瓶或培養(yǎng)基瓶。6儀器滅菌和菌種保藏6.1干熱滅菌溫度滅菌時(shí)間6.2高壓蒸汽滅菌將物品放入高壓蒸汽滅菌鍋，于121℃±2℃滅菌15min或以上。用堿性或中性清潔劑清洗，然后用蒸餾水或去離子水沖洗干凈。使用前用干熱滅菌器或高壓蒸汽5滅菌鍋滅菌。菌種接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，應(yīng)存放在5℃~10℃條件下，每30d轉(zhuǎn)種一次。不應(yīng)使用轉(zhuǎn)種超過5次或轉(zhuǎn)種間隔超過30d的菌種，如超過，應(yīng)從相關(guān)菌種保藏機(jī)構(gòu)獲取新的菌種進(jìn)行試驗(yàn)。7試驗(yàn)步驟7.1細(xì)菌預(yù)培養(yǎng)用無菌接種環(huán)將細(xì)菌從保藏菌種的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基(4.2.3.5)上并于35℃±1℃培養(yǎng)16h～24h。再將培養(yǎng)好的細(xì)菌用無菌接種環(huán)轉(zhuǎn)至新鮮的斜面培養(yǎng)基，于35℃±1℃培養(yǎng)16h～20h。7.2試樣的制備每種經(jīng)過抗菌處理的材料應(yīng)至少準(zhǔn)備3片試樣，未經(jīng)抗菌處理的材料至少準(zhǔn)備6片。3片未經(jīng)抗菌處理試樣用于接種后立即測量活的細(xì)菌數(shù)，另3片用于測量接種后24h的活細(xì)菌數(shù)。注：使用3個(gè)以上的經(jīng)過處理的試樣有助于減少誤差，尤其對于抗菌效果較差的材料更為必要。在對同一聚合材料的一系列抗菌處理的樣品檢測時(shí)，若所有抗菌樣品都采用同一個(gè)菌液同時(shí)進(jìn)行檢測，則每個(gè)抗菌樣品可只與同一組未經(jīng)抗菌處理的對照樣進(jìn)行比較。制備抗菌處理和未經(jīng)抗菌處理的試樣，試樣尺寸為(50±2)mm×(50±2)mm,試樣厚度不宜超過10mm。如果無法切割成規(guī)定尺寸的試樣，可采用其他尺寸和形狀，只要試樣能夠被面積為(400~1600)mm2的覆蓋膜覆蓋即可。優(yōu)先考慮從產(chǎn)品上制備測試樣，如果無法從制品上制備上述尺寸的試樣，可利用相同原料和工藝以適宜測試的尺寸單獨(dú)制備試樣。如果試樣尺寸不是50mm×50mm,則應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中寫明實(shí)際的試樣尺寸。在制樣時(shí)，注意避免試樣被微生物或有機(jī)物污染。同樣，試樣不應(yīng)互相接觸。如果使用金屬器具防止交叉污染，應(yīng)確保該金屬無抗菌效果。必要時(shí)，能在試驗(yàn)前對試樣進(jìn)行清洗、消毒或殺菌(如以70%清洗試樣可能導(dǎo)致表面軟化、表面涂層溶解或者組分溶出等，因此宜避免清洗。如果因嚴(yán)重污染需使用無菌接種環(huán)，轉(zhuǎn)移一環(huán)預(yù)培養(yǎng)好的細(xì)菌(見7.1)到少量的1/500NB(4.2.3.2)中。確保細(xì)菌分散均勻，并采用顯微鏡觀測及細(xì)胞計(jì)數(shù)板或利用其他合適的方法(如分光光度計(jì)法)測定細(xì)菌數(shù)量。用1/500NB稀釋菌懸液，使細(xì)菌的濃度在2.5×10?cells/mL～10×10?cells/mL之間，最適濃度為6.0×10?cells/mL,用作接種液。如果接種液不立即使用，將其放置于冰塊上(0℃)并在2h內(nèi)使用。產(chǎn)品的暴露面作為測試表面，不應(yīng)測試產(chǎn)品的橫切面。將各個(gè)試樣(見7.2)分別放入單獨(dú)的無菌培養(yǎng)皿中，測試面朝上。用移液管吸取0.4mL接種液(見7.3),滴到每個(gè)試樣表面。將制備好的40mm×40mm覆蓋膜(5.11)蓋于接種液上，并向下輕輕按壓覆蓋膜使接種液向四周擴(kuò)散，確保接種液不要從覆蓋膜邊緣滲出。在試樣接種完并蓋上覆蓋膜后，蓋上培養(yǎng)皿蓋(見圖1)。6單位為毫米標(biāo)引序號說明：1——覆蓋膜；2——接種劑(0.4mL);3——試樣；4——培養(yǎng)皿；5——培養(yǎng)皿蓋。圖1試樣接種與覆蓋膜放置除非特別說明，覆蓋膜的標(biāo)準(zhǔn)尺寸應(yīng)為正方形(40±2)mm×(40±2)mm,而試樣尺寸為50mm×50mm。如果測試樣品不是標(biāo)準(zhǔn)尺寸，則應(yīng)根據(jù)試樣的大小按比例減小覆蓋膜的尺寸，但是覆蓋膜尺寸不應(yīng)小于400mm2,并且覆蓋膜邊緣距試樣邊緣應(yīng)為2.5mm～5.0mm。如果覆蓋膜的尺寸不是40mm×40mm,應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中說明其實(shí)際尺寸。所使用的接種液體積也應(yīng)按覆蓋膜面積變化的比例相應(yīng)調(diào)整并在試驗(yàn)報(bào)告中記錄。接種液不應(yīng)從覆蓋膜邊緣滲出。然而，很難防止菌液從某些表面(如親水性非常強(qiáng)的表面)滲出。采用下面的選項(xiàng)1防止菌液滲出。如果采用選項(xiàng)1仍發(fā)生滲出，則選用選項(xiàng)2。如果采用其中一個(gè)選——選項(xiàng)1:減少菌液體積以適應(yīng)試樣表面，但菌液體積不應(yīng)小于0.1mL。當(dāng)菌液體積減少時(shí)，應(yīng)增加接種液細(xì)菌的濃度，以保證測試時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的細(xì)菌數(shù)相同?！x項(xiàng)2:通過增加惰性增稠劑(如瓊脂)以增加接種液的黏度。除特別說明外，含有接種試樣(包括3片未經(jīng)抗菌處理產(chǎn)品的接種試樣)的培養(yǎng)皿，在(35±1)℃相對濕度不小于90%的條件下培養(yǎng)(24±1)h。根據(jù)在培養(yǎng)溫度下檢測所得到的抗菌活性值來確定產(chǎn)品的抗菌效果。在相關(guān)方同意的條件下，也可采用其他培養(yǎng)溫度。如使用的不是(35±1)℃,應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中記錄。7注：若培養(yǎng)溫度低于35℃,活菌總數(shù)將會減少。這將使所測得的抗菌活性值與35℃下所測得的結(jié)果不同。接種后，立即對已接種的3片未經(jīng)抗菌處理試樣進(jìn)行菌種回收，在這3個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入10mLSCDLP培養(yǎng)液(4.2.3.6)或其他適宜而有效的中和劑。從未經(jīng)抗菌處理試樣獲得的菌數(shù)將用于確定細(xì)菌的回收率。確保試樣得到充分沖洗，即用移液管吸取和釋放SCDLP培養(yǎng)液，沖洗試樣至少4次。特別注意的是，需要達(dá)到足夠的接種菌的回收率。尤其是如試驗(yàn)中采用了7.4中的選項(xiàng)2,導(dǎo)致菌液的黏度增大。對此情況可采用機(jī)械攪拌，如均質(zhì)袋振動、旋動和超聲波振動等。若回收率達(dá)到或超過沖洗法，則可采用上述方法。若變更回收方法，則應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中說明。由于試樣的尺寸和性質(zhì)的原因，采用10mL中和劑回收細(xì)菌有困難，則可增加中和劑溶液用量。若中和劑的體積不是10mL,則應(yīng)在試驗(yàn)報(bào)告中記錄，并在計(jì)算抗菌效果時(shí)予以考慮。其他沖洗方法將影響所測得的抗菌活性結(jié)果，因而應(yīng)充分證實(shí)其有效性。7.7平板培養(yǎng)法測定活菌數(shù)用磷酸鹽緩沖生理鹽水(4.2.3.8)對SCDLP回收液進(jìn)行10倍梯度稀釋，以計(jì)算活菌。將試樣上的回收液及其10倍稀釋液各取1mL,分別放入無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)稀釋度應(yīng)做兩個(gè)培養(yǎng)皿。每個(gè)培養(yǎng)皿中注入15mL平板計(jì)數(shù)瓊脂(4.2.3.4),輕輕旋轉(zhuǎn)以分散細(xì)菌。蓋上皿蓋，倒置培養(yǎng)皿，于(35±1)℃培養(yǎng)40h～48h。培養(yǎng)后，對培養(yǎng)皿中菌落數(shù)在30～300之間的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。記下每個(gè)稀釋度培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)并保留兩位有效數(shù)字，記錄稀釋倍數(shù)。若1mL洗脫液中的細(xì)菌數(shù)小于30,則對該培養(yǎng)皿直接計(jì)數(shù)。如8試驗(yàn)結(jié)果對于每個(gè)試樣的活菌數(shù)，按照公式(1)進(jìn)行計(jì)算：N=(100×C×D×V)/A (1)N——每個(gè)試樣每平方厘米的活菌數(shù)；C——兩個(gè)培養(yǎng)皿的菌落平均值；D——稀釋倍數(shù)；V——用于洗脫的SCDLP培養(yǎng)液的體積，單位為毫升(mL);A——覆蓋膜的表面積，單位為平方毫米(mm2)。計(jì)算每組試樣回收活菌數(shù)的算術(shù)平均值并記錄，取兩位有效數(shù)字。若各稀釋度的所有瓊脂板上都沒有菌落，則將菌落數(shù)計(jì)作<V(用于洗脫的SCDLP培養(yǎng)液的體積)。計(jì)算平均值時(shí)，如各稀釋度均沒示例：V=10mL,用于計(jì)算平均值的活菌數(shù)采用10。88.2試驗(yàn)有效的條件8.2.1當(dāng)8.2.2、8.2.3、8.2.4中給定的3個(gè)條件均得到滿足時(shí)，試驗(yàn)才被認(rèn)定為有效。反之，則試驗(yàn)無8.2.2未經(jīng)抗菌處理試樣接種后立即測得的細(xì)菌數(shù)的對數(shù)值應(yīng)符合公式(2)要求：(Lmx—Lmin)/Lmen≤0.2…Lmx——試樣上最大活菌數(shù)的常用對數(shù)；Lmin——試樣上最小活菌數(shù)的常用對數(shù)；Lmen——試樣上活菌數(shù)平均值的常用對數(shù)。8.2.4每個(gè)未經(jīng)抗菌處理試樣接種后培養(yǎng)24h活菌數(shù)不應(yīng)小于62cells/cm28.3抗菌活性值的計(jì)算在試驗(yàn)被認(rèn)為有效的情況下，按照公式(3)計(jì)算抗菌活性值，結(jié)果保留一位小數(shù)。R=(U?-U)-(A,-U?)=U,-A, (3)R——抗菌活性值；U?——未經(jīng)抗菌處理試樣接種后立即回收的活菌數(shù)的常用對數(shù)的平均值，菌數(shù)單位為細(xì)菌數(shù)每平方厘米(cells/cm2);U,——經(jīng)抗菌處理試樣接種24h回收活菌數(shù)的常用對數(shù)的平均值，菌數(shù)單位為細(xì)菌數(shù)每平方厘A?——經(jīng)抗菌處理試樣接種24h的菌數(shù)的常用對數(shù)的平均值，菌數(shù)單位為細(xì)菌數(shù)每平方厘米抗菌活性值能用于表征抗菌效果。判定抗菌效果的抗菌活性值指標(biāo)應(yīng)由相關(guān)方商定。9重復(fù)性與再現(xiàn)性對重復(fù)性和再現(xiàn)性進(jìn)行了定量討論(見附錄B)。10試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下信息：a)注明采用本文件編號；b)經(jīng)抗菌處理和未經(jīng)抗菌處理試樣的材質(zhì)、尺寸、形狀和厚度；d)試驗(yàn)用菌種和菌株號，如采用其他菌種則說明原因；e)接種菌液的體積；f)計(jì)算得到的接種菌液的活菌數(shù)；9h)計(jì)算所得的抗菌活性值；i)采用任何不同于本文件的操作，如試樣清洗方法的變更、惰性增稠劑的使用、所用中和劑的種類和體積有變化、菌液回收方法變更及培養(yǎng)溫度不同時(shí)；k)試驗(yàn)日期；1)試驗(yàn)報(bào)告日期。(規(guī)范性)生物材料的質(zhì)量要求A.1概述根據(jù)來源的不同，用于接種液制備的材料的質(zhì)量會有所差異，從而對結(jié)果產(chǎn)生重大影響，因而其成分需專門規(guī)范。牛肉膏和蛋白胨是控制1/500營養(yǎng)肉湯質(zhì)量差異的關(guān)鍵成分。以下是本文件對市售材料中總氮和蛋白胨(酪蛋白的酶消解產(chǎn)物)(資料性)重復(fù)性和再現(xiàn)性本附錄內(nèi)容是基于大量研究結(jié)果所獲得的本方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性。該研究于2000年至2004年由日本國家技術(shù)與評價(jià)研究所完成，其目的一方面是采納ISO/IEC17025[6]作為實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可體系(見參考文獻(xiàn)[12])的一部分，另一方面是測定JISZ2801[1]的不確定度，該方法是本文件制定的依據(jù)。通過統(tǒng)計(jì)分析確定了本方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性(見ISO5725-2[2])。對兩種經(jīng)處理過的測試樣品在5個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，從而得出抗菌活性的試驗(yàn)結(jié)果。在剔除其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)后，根據(jù)剩余實(shí)驗(yàn)室的同一實(shí)驗(yàn)室的相同測試項(xiàng)目重復(fù)性為0.087;不同實(shí)驗(yàn)室相同測試項(xiàng)目的再現(xiàn)性為0.304。這些數(shù)據(jù)是用本方法能獲得的重復(fù)性和再現(xiàn)性的舉例，不宜用于判定是否認(rèn)可不同實(shí)驗(yàn)室的測試結(jié)果。B.3試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間測試所用的材料和應(yīng)用的試驗(yàn)條件見表B.1。抗菌處理的試樣PET膜，50mm×50mm方塊，厚度0.055mmI類試樣：丙烯酸(樹脂)涂層，混合350μg/g銀化合物Ⅱ類試樣：丙烯酸(樹脂)涂層，混合450pg/g銀化合物未經(jīng)抗菌處理對照試樣PET膜，50mm×50mm方塊，厚度0.055mm,但涂層中不加銀化合物覆蓋膜PE膜，40mm×40mm方塊，厚度0.09mm菌種金黃色葡萄球菌NBRC12732(見注)接種菌液體積注：僅使用金黃色葡萄球菌，是因?yàn)樗却竽c桿菌具有更高的變異性。參加實(shí)驗(yàn)室間測試的5個(gè)實(shí)驗(yàn)室都對兩種樣品進(jìn)行了重復(fù)的測試。用于各個(gè)階段的樣品數(shù)均符合樣品包含涂了水溶性丙烯酸樹脂涂層的PET膜。在涂丙烯酸樹脂前混入一定量的銀系抗菌劑，以確保試驗(yàn)樣品上的抗菌劑均勻分布。由于丙烯酸涂層是水溶性的，接種菌液容易擴(kuò)散到涂層以外的區(qū)有時(shí)，空白對照膜和未經(jīng)處理的材料(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0)上的細(xì)菌存活率存在很大差異。有可能無法制備真正的空白材料，因?yàn)樘砑觿┎皇遣牧系慕M成部分，就是材料的載體，相關(guān)的未處理體系將是無涂B.4結(jié)果與討論經(jīng)初步分析，采用裂區(qū)分析計(jì)算得到一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的Z值大于2.0,因此，該實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)結(jié)果被棄用，數(shù)據(jù)分析僅采用剩余4個(gè)實(shí)驗(yàn)室的測試結(jié)果。表B.2列出了抗菌性能的平均值和每種抗菌處理試樣的標(biāo)準(zhǔn)差。重復(fù)性試驗(yàn)顯示為下表第一組和第二組。表B.2平均抗菌活性值和標(biāo)準(zhǔn)差樣品種類(見表B.1)平均抗菌活性值(括號內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)差)第一組第二組I類試樣Ⅱ類試樣每個(gè)實(shí)驗(yàn)室對兩種類型樣品均做了2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每種類型樣品采用3個(gè)相同的試樣?？紤]分析結(jié)果的變異性來源包括重復(fù)試驗(yàn)變異性V(即結(jié)果或來自第一組或來自第二組),實(shí)驗(yàn)室間變異性V?和3種被測試樣之間的變異性Vs。因?yàn)閂和V.不能隨機(jī)化，每組都要單獨(dú)分析。表B.3列出了方差分析結(jié)果和不確定度。表B.3方差分析表與不確定度變異性來源平方和自由度平方平均值F(檢驗(yàn))重復(fù)，VR實(shí)驗(yàn)室，Vt3—VR×Vt(一階誤差，e?)3a測試樣品，Vs1313二階誤差，e?——總計(jì)—————另一方面，與e?相比，Vg×Vs和Vg×V?×Vs沒有統(tǒng)計(jì)顯著性。所以這兩個(gè)量的影響就被合并于二階誤差e?中，表B.4列出了合并非顯著性差異后的方差分析結(jié)果。表B.4方差分析表和不確定度(非顯著性差異匯總)變異性來源平方和自由度平方平均值F(檢驗(yàn))重復(fù)，VR1實(shí)驗(yàn)室，Vt3Vg×V?(一階誤差，e?)3表B.4方差分析表和不確定度(非顯著性差異匯總)(續(xù))變異性來源平方和自由度平方平均值F(檢驗(yàn))試樣，Vs13二階誤差，e'2總計(jì)————上述結(jié)果證明，Vg來源于重復(fù)性試驗(yàn)的差異；V,來源于實(shí)驗(yàn)室之間的差異，相互獨(dú)立并無統(tǒng)計(jì)顯本研究結(jié)果能得出下列結(jié)論?！貜?fù)性：通過3個(gè)重復(fù)的試驗(yàn)，重復(fù)性條件下的標(biāo)準(zhǔn)不確定度能由上述數(shù)據(jù)計(jì)算如下：o(e?)=[V(e'?)/3]1/2=(0.0228/3)1/2=0.087——再現(xiàn)性：再現(xiàn)性條件下的標(biāo)準(zhǔn)不確定度能由上述數(shù)據(jù)計(jì)算如下：o(e?)={[V(e?)-V(e'?)]/3}Y2=[(0.2997-0.0228)/3]12=0.304(資料性)抗菌率的計(jì)算用公式(NA.1)計(jì)算抗菌率。R'——抗菌率，%;……………(NA.1)U',未經(jīng)抗菌處理試樣接種24h后回收的活菌數(shù)的平均菌數(shù)，單位為細(xì)菌數(shù)每平方厘米(cells/cm2);[2]ISO5725-2Accuracy(truenessandprecision)ofmeasurementmethodsandresults—Part2:Basicmethodforthedeterminationofrepeatabilityandreproducibilityofastandardmeasure-mentmethodaqueousmedium—Methodbymeasuringtheoxygendemandinaclosedrespirometer[4]ISO14852Determinationoftheultimateaerobicbiodegradabilityofplasticmaterialsinanaqueousmedium—Methodbyanalysisof