組織培養(yǎng)技術(shù)的基本理論知識(shí)

組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主講：周曉霞1可編輯版

第一章

細(xì)胞培養(yǎng)的基本理論知識(shí)

2可編輯版

組織培養(yǎng)工作開始于20世紀(jì)初，Harrison(1907)最早對(duì)兩棲類胚胎的神經(jīng)管組織進(jìn)行了懸滴培養(yǎng)-哈里森懸滴培養(yǎng)法

真正開創(chuàng)大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)工作是在20世紀(jì)40年代，W.Earle和R.Dulbecco設(shè)計(jì)出了細(xì)胞培養(yǎng)液配方，并開始了單細(xì)胞的懸液培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)工作才得到廣泛發(fā)展。

細(xì)胞培養(yǎng)始傳我國(guó)是20世紀(jì)30年代。至50年代以后，組織培養(yǎng)已在我國(guó)逐步開展起來(lái)組織細(xì)胞培養(yǎng)的誕生和發(fā)展簡(jiǎn)史

3可編輯版第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基本概念

一、細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)基本概念：

細(xì)胞培養(yǎng)是指從動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適溫和豐富的營(yíng)養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。

4可編輯版體外培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)（InVitro）

組織培養(yǎng)

器官培養(yǎng)不分5可編輯版細(xì)胞培養(yǎng)(Cellculture)：細(xì)胞（包括單個(gè)細(xì)胞）在體外條件下的生長(zhǎng)。組織培養(yǎng)（TissueCulture）其本意是指從體內(nèi)取出組織，摹擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存和生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。注：組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)并無(wú)嚴(yán)格區(qū)別！

6可編輯版器官培養(yǎng)（QrganCulture）,指的是應(yīng)用和組織培養(yǎng)相似的條件，培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長(zhǎng)和保持一定功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用。7可編輯版多莉克隆猴8可編輯版單克隆抗體制備過(guò)程9可編輯版

優(yōu)點(diǎn)：1.活細(xì)胞：

能長(zhǎng)時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)等

二、細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)10可編輯版2.可控制：

選擇對(duì)象：均一性、重復(fù)性

哪一種：類型：上皮？間質(zhì)？

性質(zhì)：正常？腫瘤？

階段：

調(diào)節(jié)條件：物理、化學(xué)、生物等因素可控

研究方法：可采用各種研究技術(shù)、記錄方法11可編輯版3.應(yīng)用廣：學(xué)科多，對(duì)象廣。4.較經(jīng)濟(jì)：

可提供大量、同時(shí)、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象

12可編輯版缺點(diǎn)：雖然現(xiàn)在人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高,但人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際仍不完全相同。當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后,生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中久了，必然發(fā)生變化。13可編輯版１.與體內(nèi)主要不同相對(duì)孤立、相對(duì)單一，缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響。2.主要表現(xiàn)

失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分化減弱或不顯，細(xì)胞趨向單一化；3.提示

要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞：是一種特定條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。

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第二節(jié)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)生物學(xué)

一、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)類型

按生長(zhǎng)方式分為二型粘附型細(xì)胞:

附著在某一固相支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。

絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞。

15可編輯版粘附型細(xì)胞：粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式

有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須粘附于一固相表面才能生存和生長(zhǎng)。

16可編輯版細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異：

體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征

體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同17可編輯版按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為以下類型：(1)上皮型細(xì)胞(2)成纖維型細(xì)胞(3)游走型細(xì)胞(4)多形型細(xì)胞

18可編輯版(1)上皮型細(xì)胞(2)成纖維型細(xì)胞(3)游走型細(xì)胞(4)多形型細(xì)胞

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上皮樣細(xì)胞型

名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全等于來(lái)源：來(lái)源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞（個(gè)別例外）如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡，上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核

20可編輯版生長(zhǎng)特點(diǎn)易相連成片相靠—緊密相連—成薄層—鋪路石狀生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)

21可編輯版成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)

胞體梭形或不規(guī)則三角形胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起中有卵圓形核22可編輯版生長(zhǎng)特點(diǎn)

排列成放射狀，漩渦狀并不緊靠連成片，細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而

單獨(dú)行動(dòng)游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起

23可編輯版體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞24可編輯版游走型細(xì)胞

具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征。經(jīng)常處于較活躍的變形及游走狀態(tài)，因此外形不規(guī)則且不斷變化。當(dāng)細(xì)胞密度增大相互連接成片時(shí)，游走受限，形狀上類似上皮型細(xì)胞或成纖維細(xì)胞型的細(xì)胞。表現(xiàn)這種形態(tài)的細(xì)胞主要是具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝枯否細(xì)胞(Kupffercell)以及某些腫瘤細(xì)胞等。

25可編輯版多形型細(xì)胞

多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞，但它不像成纖維細(xì)胞型的細(xì)胞那樣，不規(guī)則形態(tài)由寬扁的胞質(zhì)突起所致。其細(xì)胞一般分胞體和胞突兩部分。胞突為細(xì)長(zhǎng)形，似絲狀偽足。胞體雖略呈多角形，但沒(méi)有成纖維細(xì)胞型那樣不規(guī)則。體外培養(yǎng)中呈現(xiàn)多形型的細(xì)胞最常見的類型是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。26可編輯版注意：細(xì)胞形態(tài)并非固定不變，可隨培養(yǎng)條件、生長(zhǎng)時(shí)期、細(xì)胞數(shù)量等而變化細(xì)胞形態(tài)只是對(duì)培養(yǎng)物判斷或識(shí)別的參考指標(biāo)若要確定某一培養(yǎng)物的確切細(xì)胞類型，必須借助更為特異的鑒定方法，如進(jìn)行組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。27可編輯版培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定

血清Hela高血清低血清

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

pHHela太酸或太堿標(biāo)準(zhǔn)pH

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

細(xì)胞密度3T3低密度高密度

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

生長(zhǎng)狀態(tài)改變

懸浮或貼附懸浮貼附

圓形成纖維或上皮樣

轉(zhuǎn)化與否未轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后

成纖維樣可成上皮樣28可編輯版懸浮生長(zhǎng)型

概念培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)來(lái)源來(lái)自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞也可能特點(diǎn)在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)29可編輯版優(yōu)點(diǎn)

生存空間大，提供數(shù)量大傳代方便(不需消化)易于收獲

缺點(diǎn)觀察不方便很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞)

30可編輯版小結(jié)：體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)類型粘附型細(xì)胞懸浮型細(xì)胞：血細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞

上皮型細(xì)胞成纖維型細(xì)胞

游走型細(xì)胞

多形型細(xì)胞

31可編輯版培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的變化分化特征逐漸減弱，原本各種各樣的分化細(xì)胞，逐漸失去各自的形態(tài)與功能“個(gè)性”，表現(xiàn)出某種趨同性，這種現(xiàn)象被稱為去分化或脫分化培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力

分裂增殖和生長(zhǎng)發(fā)育是體外培養(yǎng)細(xì)胞的兩大生命特征;增殖能力一般與該種細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力相仿。

32可編輯版二、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程１）單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程：ＤＮＡ合成細(xì)胞分裂復(fù)習(xí)：細(xì)胞周期＝Ｇ１＋Ｓ＋Ｇ２＋Ｍ２）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程原代培養(yǎng)期傳代期衰退期33可編輯版細(xì)胞周期(Cellcycle)：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束開始至本次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過(guò)程。常分為4個(gè)時(shí)期，即DNA合成期（S期）、有絲分裂期（M期）、有絲分裂完成至DNA合成開始的間隙期（G1期）以有DNA復(fù)制結(jié)束至有絲分裂開始的間隙期（G2期）。若某種原因（如乏氧、血清饑餓等）細(xì)胞不再沿細(xì)胞周期運(yùn)行，而進(jìn)入休眠狀態(tài)，則稱為G0期。34可編輯版

體外培養(yǎng)細(xì)胞的整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程分期35可編輯版原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中繼續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程。36可編輯版原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞加入胰蛋白酶消化液鏡下觀察倒去酶液，加入培養(yǎng)液反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液按比例分裝后培養(yǎng)37可編輯版

2)每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）38可編輯版1.游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。時(shí)間：10分鐘一4小時(shí)2.貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。

底物：玻璃、塑料、膠原、其它細(xì)胞等39可編輯版40可編輯版3.潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。4.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：

細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。5.停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度限制41可編輯版每一代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程分期42可編輯版第三節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境與條件１．細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要：１）基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：

氨基酸（１２種＋谷氨酰胺）維生素葡萄糖、核糖、脫氧核糖等無(wú)機(jī)離子等２）促細(xì)胞生長(zhǎng)因子：多由血清提供

43可編輯版２．細(xì)胞的生存環(huán)境１）溫度條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同生物來(lái)源的組織細(xì)胞培養(yǎng)溫度不同；體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞最常用的溫度是37℃。耐低溫不耐高溫！在生理溫度范圍內(nèi)，溫度與細(xì)胞生長(zhǎng)率之間存在正相關(guān)關(guān)系。（復(fù)習(xí)：溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響）

44可編輯版２）氣相環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的氣相環(huán)境都是采用5%CO2與95%空氣（提供氧）的混合氣體。

Ｏ2參與細(xì)胞的能量代謝過(guò)程。ＣＯ2用于維持培養(yǎng)液的酸堿度。

一般多為開放式培養(yǎng)

45可編輯版３）培養(yǎng)液的酸堿度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響大多數(shù)的有機(jī)體細(xì)胞能在pH6.0～8.0的環(huán)境中生存。最適宜的pH值范圍是7.2～7.4。體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞耐酸能力要強(qiáng)于耐堿能力４）無(wú)污染、無(wú)毒（前提條件?。?/p>

46可編輯版組織培養(yǎng)常用術(shù)語(yǔ)Cellculture(細(xì)胞培養(yǎng))：細(xì)胞（包括單個(gè)細(xì)胞）在體外條件下的生長(zhǎng)，稱為細(xì)胞培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞不再形成組織，但在實(shí)驗(yàn)室口語(yǔ)中，人們常將它擴(kuò)展至組織培養(yǎng)與器官培養(yǎng)。貼壁依賴性：為細(xì)胞需貼附于底物或支撐物上才能生長(zhǎng)的性質(zhì)。47可編輯版Primaryculture(原代培養(yǎng))：從體內(nèi)取