血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

關(guān)于血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳1.掌握醋酸纖維膜電泳的基本原理及其臨床意義;2.掌握醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的操作技術(shù);3.熟悉電泳儀器的使用和操作。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模旱?頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、實(shí)驗(yàn)原理：（一）電泳(electrophoresis)：帶電粒子在電場(chǎng)中向與其電性相反的電極方向泳動(dòng)的現(xiàn)象。正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。第3頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）電泳法：利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的方法和技術(shù)。第4頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維素薄膜作為支持物的電泳方法。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH4.0～7.3之間，在pH8.6的緩沖溶液中均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所以帶電荷量也不同。此外各種蛋白質(zhì)的分子大小各有差異，因此在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度不同。分子小而帶電荷多者，泳動(dòng)較快；反之，則較慢。（三）血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳原理第5頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天+白蛋白(A)α1α2

βγ定量----將染色后的區(qū)帶分別剪開，將其溶與堿液，進(jìn)行比色測(cè)定，計(jì)算各區(qū)帶的百分?jǐn)?shù)。第6頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天醋酸纖維素薄膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)（厚約120

m），滲透性強(qiáng)，對(duì)分子移動(dòng)的阻力很弱。用其作支持物進(jìn)行電泳，具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分離清晰、對(duì)樣品無(wú)吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)已廣泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面。第7頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、實(shí)驗(yàn)器材1.電泳儀：為電泳提供直流電源。2.電泳槽：為電泳提供場(chǎng)所。多用有機(jī)玻璃制成，電極用鉑絲。3.血清加樣器：可用蓋玻片或X膠片或微量加樣器。4.醋酸纖維素薄膜：2cm×8cm5.其它：培養(yǎng)皿（直徑9-10cm）、濾紙、玻璃板、鑷子等。DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽第8頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天

四、實(shí)驗(yàn)試劑和材料1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH=8.6，離子強(qiáng)度0.075)：稱取1.66g巴比妥和12.76g巴比妥鈉,置于大燒杯中，加蒸餾水約600ml，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定溶至1000ml。置4℃保存，備用。2、染色液：稱取0.5g氨基黑，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸餾水加至100ml。3、漂洗液：取無(wú)水乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸餾水50ml，混勻置塞試劑瓶?jī)?nèi)貯存。3、0.4N氫氧化鈉：稱取氫氧化鈉16.0g，蒸餾水加至1000ml第9頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.醋酸纖維素薄膜的潤(rùn)濕與選擇將醋酸纖維素薄膜完全浸泡于緩沖液中10-30分鐘后，每組取醋酸纖維素薄膜1張，取時(shí)用竹鑷子夾住薄膜一端，放在折疊的濾紙中，并用它吸干表面液體。五、實(shí)驗(yàn)操作步驟（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備第10頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天

2.電泳槽的準(zhǔn)備第11頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天

點(diǎn)樣時(shí)，先在醋酸纖維薄膜的無(wú)光澤面距一端1.5cm處，預(yù)先用鉛筆劃一條線作為點(diǎn)樣線，在緩沖液中浸泡10分鐘后，用濾紙吸去多余的緩沖液，用點(diǎn)樣器的邊緣沾上血清后，在點(diǎn)樣線上迅速地壓一下，使血清通過(guò)點(diǎn)樣器印吸在薄膜上，點(diǎn)樣力求均勻。（見圖）。此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖（虛線處為點(diǎn)樣位置）（二）點(diǎn)樣：第12頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天

將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽(yáng)極端支架上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓為100伏，電泳時(shí)間1hr。電泳后，調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。醋酸纖維薄膜電泳裝置示意圖1.濾紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽膜支架5.電極室中央隔板（三）電泳第13頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天

電泳完畢后將薄膜取下,直接浸于氨基黑10B的染色液中，染5min取出。將薄膜從染色液中取出后用水沖洗后，依次在第一、第二、第三漂洗液中漂洗，最后再用清水漂洗一遍，直至可清晰分辨出5條色帶。取出薄膜放在濾紙上。血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜示意圖（四）染色與漂洗第14頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天

漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對(duì)位置進(jìn)行描述、記錄在預(yù)習(xí)本上，并判斷分析其結(jié)果。（五）記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果第15頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、注意事項(xiàng)1、薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。2、點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。3、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過(guò)多或過(guò)少。5、電泳時(shí)應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且點(diǎn)樣面向下。6、應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長(zhǎng)，薄膜底色不易脫去；時(shí)間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。第16頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天第17頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天附：4、定量

1）取6支試管并編號(hào)，分別加入0.4N氫氧化鈉4ml。

2）剪下各條蛋白帶和在膜空白部位剪一條帶（空白帶的寬度以最窄的條帶為準(zhǔn)，why？），將各條帶浸入試管，不時(shí)搖動(dòng)，洗脫藍(lán)色。

3）光光度計(jì)比色，波長(zhǎng)為650nm，以空白薄膜條洗出液為空白對(duì)照，讀取其它5管的光密度值。

5、計(jì)算總吸光度

光密度總和T＝A＋α1＋α2＋β＋γ

各部分蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)：

蛋白質(zhì)％＝A/T×100％

第18頁(yè),共20頁(yè)，2024年2月25日，星期天臨床意義

血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分,含量為60～80g/L,絕大部分由肝臟合成,僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成正常值:白蛋白57%—72%α1球蛋白2%—5%α2球蛋白4%—9%β球蛋白6.5%—12%γ球蛋