胰島素的制備

關(guān)于胰島素的制備必要性胰島素這類活性蛋白多肽和細(xì)胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立體結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜，體外難以人工合成。所以過去糖尿病患者只能服用從牛、豬體中提取的胰島素來治療；但牛、豬胰島素結(jié)構(gòu)上與人胰島素有差別，如與豬胰島素B鏈第30個(gè)基酸殘基不同，長期服用會(huì)引起腎和眼的疾病，故必需要用基因工程方法獲得重組人胰島素進(jìn)行治療。第2頁,共43頁,2024年2月25日，星期天第3頁,共43頁,2024年2月25日，星期天原理基因工程技術(shù)主要內(nèi)容或步驟可分為目的基因制備和分離，構(gòu)建DNA重組體；DNA重組體擴(kuò)增和表達(dá)，重組體篩選和鑒定；外源基因表達(dá)，產(chǎn)物分離純化和鑒定以及將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下次進(jìn)行功能性表達(dá)，生產(chǎn)出人類所需要的物質(zhì)。第4頁,共43頁,2024年2月25日，星期天預(yù)想把人的胰島素的基因提取出來，接在一個(gè)小的載體上，得到一個(gè)重組的載體，再轉(zhuǎn)化到真核細(xì)胞，細(xì)胞并不認(rèn)為是人的基因就不管它，會(huì)當(dāng)成自己的基因進(jìn)行胰島素的合成，每一個(gè)細(xì)胞就相當(dāng)于生產(chǎn)胰島素的工廠，實(shí)際上我們可以通過改變胰島素基因前面的調(diào)控序列，讓細(xì)胞停止合成其他的蛋白質(zhì)，只合成胰島素。第5頁,共43頁,2024年2月25日，星期天但是胰島素的A鏈、B鏈分別表達(dá)后如何使其正確連接成了人們關(guān)注的問題。

第6頁,共43頁,2024年2月25日，星期天人胰島β細(xì)胞生成胰島素過程主要分為三個(gè)階段：第一步，機(jī)體首先合成由109個(gè)氨基酸組成的前胰島素原。第二步，前胰島素原脫去23個(gè)氨基酸，轉(zhuǎn)變成含有86個(gè)氨基酸的胰島素原。胰島素原分子量為9000，是長的單鏈，含胰島素的A鏈和B鏈及連接鏈。第三步，胰島素原再脫去4個(gè)堿基氨基酸，生成含31個(gè)氨基酸的C肽及含51個(gè)氨基酸的胰島素分子。第7頁,共43頁,2024年2月25日，星期天第8頁,共43頁,2024年2月25日，星期天用E.coli做表達(dá)系統(tǒng)

及A鏈、B鏈分別表達(dá)的問題 E.coli是原核生物沒有真核生物翻譯后加工、修飾。E.coli中表達(dá)的小分子外源蛋白不穩(wěn)定。E.coli與人的種屬差異較大，有密碼子的偏好性。A鏈、B鏈間二硫鍵正確連接和其空間構(gòu)象正確形成較難。第9頁,共43頁,2024年2月25日，星期天一些解決辦法替換表達(dá)系統(tǒng),換為酵母或動(dòng)物細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)。仍用E.coli作為表達(dá)系統(tǒng)，將胰島素基因與一些較大的蛋白分子的基因適當(dāng)連接，使表達(dá)的蛋白分子量足夠大，避免被蛋白水解酶分解，提高其穩(wěn)定性及表達(dá)率。在A鏈、B鏈間加入C鏈或其功能類似物，使胰島素能夠形成正確的空間構(gòu)象。第10頁,共43頁,2024年2月25日，星期天一、人胰島素原在Pichiapastoris

（畢赤酵母）中的表達(dá)畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)酵母，用酵母合成胰島素的主要優(yōu)點(diǎn)是可以進(jìn)行體內(nèi)加工形成二硫鍵的正確配對(duì)，產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，下游純化比較簡單。甲醇誘導(dǎo)醇氧化酶(AlcoholOxidase)，AOX的表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的，其啟動(dòng)子(PAoxl)屬誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，能非常有效的控制外源基因的表達(dá)。不僅能克服強(qiáng)啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞內(nèi)大劑量表達(dá)外源蛋白，會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞受損，甚至死亡的缺點(diǎn)，而且能高水平表達(dá)。第11頁,共43頁,2024年2月25日，星期天

材料與方法

1．

材料1．1菌種和質(zhì)粒

E.coli

、JMl09、SMDll68，質(zhì)粒pUCl8、pHIL—S11．2限制性內(nèi)切酶

EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ及T4DNA連續(xù)酶均購于Promega公司第12頁,共43頁,2024年2月25日，星期天

1．3培養(yǎng)基·LB、YPD、RDB、BMG、BMM其中包括的主要成分YNB(yeastnitrogenbase)購于Difco公司

1．4其它材料DNA回收試劑盒購于原平公司第13頁,共43頁,2024年2月25日，星期天2方法2．1克隆步驟擴(kuò)增已克隆在質(zhì)粒pUCl8上的胰島素原基因，用EcoRI和BamHI雙酶切，電泳，瓊脂糖凝膠上回收283bp的胰島素原基因片段，將穿梭質(zhì)粒同樣用EcoRI和BamHI雙酶切，65℃，15min，酶滅活。酚抽提，酒精沉淀。溶于0．1XTE中。用T4DNA連接酶連接穿梭質(zhì)粒與膠上回收片段。氯化鈣法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JMl09中，挑單菌落擴(kuò)增鑒定。第14頁,共43頁,2024年2月25日，星期天第15頁,共43頁,2024年2月25日，星期天第16頁,共43頁,2024年2月25日，星期天2．2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母SMDl168菌制備酵母感受態(tài)細(xì)胞，再將帶有外源基因的穿梭質(zhì)粒線性化，(可用BglⅡ酶切)。可用電激法，也可用invitrogen公司提供的轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后在RDB選擇培養(yǎng)基上篩選。——般酵母轉(zhuǎn)化菌需在28—30℃長2—4天。第17頁,共43頁,2024年2月25日，星期天2．3．1酵母生長期將轉(zhuǎn)化菌在BMG培養(yǎng)基中生長至OD600=4—6時(shí)，4℃離心3000g，5min，棄上清。2．3．2誘導(dǎo)表達(dá)期棄上清，菌體重新培養(yǎng)于l／5原體積的BMM培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)。每隔24小時(shí)，加0.5％體積的誘導(dǎo)劑—甲醇，誘導(dǎo)時(shí)間在100h以上。2．3．3SDS凝膠電泳分析

4℃離心7000g，5min，留上清，電泳分析。2．3．4超濾濃縮與分子篩分離純化胰島素原。第18頁,共43頁,2024年2月25日，星期天第19頁,共43頁,2024年2月25日，星期天二.人胰島素原及其類似物

在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)為了使表達(dá)的胰島素原穩(wěn)定采取了下列方法：１．構(gòu)建雙Ｃ肽的人胰島素基因２．構(gòu)建融合蛋白基因（其他蛋白基因＋胰島素原基因）３．構(gòu)建胰島素原基因串第20頁,共43頁,2024年2月25日，星期天（一）Met－Lys－雙Ｃ肽人胰島素原基因

的構(gòu)建表達(dá)及分離純化在研究胰島素的結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系中，過去人們一直認(rèn)為C肽含有使胰島素二硫鍵正確配對(duì)足夠的結(jié)構(gòu)信息。我國科學(xué)家在成功地解決胰島素的A、B鏈重組問題及隨后對(duì)交聯(lián)胰島素的研究后，人們對(duì)“C肽含有使胰島素二硫鍵正確配對(duì)的足夠的結(jié)構(gòu)信息”這一論點(diǎn)產(chǎn)生了質(zhì)疑。第21頁,共43頁,2024年2月25日，星期天

20世紀(jì)80年代至90年代，科學(xué)家對(duì)不同長度的C肽進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，C肽在胰島素A、B鏈正確配對(duì)時(shí)，可能只起柔性連結(jié)肽作用，使得雙分子反應(yīng)變?yōu)榉肿觾?nèi)反應(yīng)。而A、B鏈包含了足夠的使二硫鍵正確配對(duì)的信息，C肽的長短可能對(duì)A、B鏈的重組產(chǎn)生影響。第22頁,共43頁,2024年2月25日，星期天材料與方法1．1材料1．1．1質(zhì)粒與菌株質(zhì)粒pJGl03:含B-C-A人胰島素原基因(Met-HPⅠ）；質(zhì)粒pJG111：含B—C′—C—A人胰島素原基因(Met—雙C肽—HPⅠ)表達(dá)載體；質(zhì)粒pBV220：溫度誘導(dǎo)質(zhì)粒。第23頁,共43頁,2024年2月25日，星期天1．1．2酶和主要試劑胰蛋白酶(10900U／mg)、人胰島素(26．0U／mg)、豬胰島素(26．0U／mg)、羧肽酶B、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、dNTPs、T4DNA聚合酶、DNA測(cè)序試劑盒、T7SequencingTMKit、陰離子交換層析柱ResourceTMQ、SephadexG—75、胰島素放免試劑盒、人胎盤胰島素受體。第24頁,共43頁,2024年2月25日，星期天1．1．3引物

5′突變引物

5′GGAATTCCGGATGAAGTTTGTC3′，起始密碼子ATG與Phe之間插入了Lys的密碼子AAG．測(cè)序引物

5′ACGCTTTTGAAGTGAT3′，與雙C肽人胰島素原基因294～279堿基互補(bǔ)．3′通用引物

5′GTCGACGGATCCTCA3′．第25頁,共43頁,2024年2月25日，星期天1．2方法1．2．1重組質(zhì)粒pJG112(含Met—Lys—雙C肽人胰島素原基因)的構(gòu)建．第26頁,共43頁,2024年2月25日，星期天第27頁,共43頁,2024年2月25日，星期天以pJG111(含Met—雙C肽人胰島素原基因)質(zhì)粒DNA作為模板，利用5′端突變引物和3′端通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積50μl，95℃預(yù)變性10min后加入1.5UTaq聚合酶，反應(yīng)參數(shù)為93℃,45s；50℃，60s；72℃，90s；35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min．第28頁,共43頁,2024年2月25日，星期天1．5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，然后用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收后與pJGl03(含B—C—A人胰島素原基因)載體大片段連接(經(jīng)EcoR

Ⅰ和BamHⅠ雙酶切后回收)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α．第29頁,共43頁,2024年2月25日，星期天1．2．2質(zhì)粒pJGll2的篩選和鑒定酶切篩選：將轉(zhuǎn)化出的單菌落采用常規(guī)小量質(zhì)粒制備方法制備質(zhì)粒DNA，取1μgDNA，用EcoRI和BamHI雙酶切后進(jìn)行1．5％瓊脂糖凝膠電泳，凡有約380bp片段出現(xiàn)的重組克隆作序列分析鑒定．第30頁,共43頁,2024年2月25日，星期天溫度誘導(dǎo)表達(dá)篩選：挑取轉(zhuǎn)化的單菌落，37℃培養(yǎng)過夜，次日擴(kuò)大10倍37℃培養(yǎng)3h，42℃誘導(dǎo)4—6h。離心得菌體，適量無菌水懸浮后，取適量菌體懸浮液進(jìn)行15％SDS—PAGE，以pBV220和pJGl03轉(zhuǎn)化菌液作為對(duì)照．DNA序列測(cè)定：采用izard?plusMiniprepsDNApurificationSystem提取測(cè)序模板，采用Sanger雙脫氧終止法，測(cè)序反應(yīng)按Pharmacia公司T7SequencingTMKit說明書進(jìn)行．6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析．第31頁,共43頁,2024年2月25日，星期天1．2．3Met—Lys—雙C肽人胰島素原基因的搖瓶表達(dá)挑取單菌落于3mlLBAmp+培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)12h，擴(kuò)大100倍30℃培養(yǎng)過夜，次日上午以1：10稀釋，30℃培養(yǎng)4h，42℃誘導(dǎo)6h，6000r／min離心收獲菌體．第32頁,共43頁,2024年2月25日，星期天1．2．4Met—Lys—雙C肽人胰島素原的分離純化

20g濕菌體經(jīng)超聲破碎細(xì)胞，裂解包含體，還原，重組，超濾濃縮至6～7ml的重組液．經(jīng)SephadexG—75(1．7cm×l00cm)層析分離，收集目的蛋白．取少量進(jìn)行“％SDS—PAGE分析，其余的調(diào)pH2．5～3．0，加入NaCl使終濃度達(dá)12％(W／V)，離心，收集沉淀，冰凍保存．第33頁,共43頁,2024年2月25日，星期天1．2．5Met—Lys—雙C肽人胰島素原轉(zhuǎn)化為人胰島素取適量上述胰島素原類似物鹽析沉淀溶于0.05mol／LTris—HCLpH7．5緩沖液，經(jīng)紫外吸收法準(zhǔn)確測(cè)定Met—Lys—雙C肽HPI的濃度后，加入適量胰蛋白酶和羧肽酶B，使質(zhì)量比例分別為50：1和300：1，37℃反應(yīng)0．5h，立即冷卻，終止反應(yīng)，酶解液用HCl調(diào)pH2．5～3．0，并加入異丙醇使其濃度達(dá)40％(V／V)經(jīng)ResourceTMQ(1m1)陰離子交換柱分離，采用NaCl鹽濃度梯度為0～0．15mol/l的上述緩沖液進(jìn)行洗脫，以豬胰島素作為對(duì)照，收集胰島素峰，用0．5mol/l乙酸透析除鹽，凍干備用．第34頁,共43頁,2024年2月25日，星期天結(jié)果

2．l重組質(zhì)粒的構(gòu)建利用5′端起始密碼子ATG和胰島素B1TTT之間加入Lys密碼子AAG的突變引物相3′端通用引物，以含雙C肽胰島素原基因的質(zhì)粒pJG111作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約380bp的產(chǎn)物，由于胰島素原基因的5′端和3′端分別引入了EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，因此PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒pJGl03(含B—C—A人胰島素原基因)可分別用這兩種酶酶切后產(chǎn)生粘性末端，經(jīng)回收的PCR產(chǎn)物酶切小片段與載體大片段連接，轉(zhuǎn)化E．coliDH5α后獲得重組質(zhì)粒pJG112，采用3種方法進(jìn)行篩選和鑒定。第35頁,共43頁,2024年2月25日，星期天首先提取pJG112質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切篩選，產(chǎn)物進(jìn)行1．5％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明雙酶切的小片段大小與pJG111雙酶切小片段相近，約370bp，比pJGl03雙酶切的小片段(約280bp)大，初步說明已獲得突變胰島素原類似物基因，并重組到pJGl03質(zhì)粒內(nèi)。第36頁,共43頁,2024年2月25日，星期天第37頁,共43頁,2024年2月25日，星期天鑒于所用載體為一個(gè)表達(dá)型載體，所以可進(jìn)行表達(dá)篩選．將初步篩選出的陽性克隆小量進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)物進(jìn)行SDS—PAGE分析，結(jié)果表明在電泳條帶的前沿有明顯表達(dá)帶，分子大小比pJGl03