不同產(chǎn)地鐵皮石斛的質(zhì)量評價+最終稿

前言鐵皮石斛是一種名貴的中藥材，其是蘭科植物鐵皮石斛dendrobiumofficinalekimuraetmigo的干燥莖。根據(jù)《中國藥典》的記載，鐵皮石斛味甘甜，性微寒，歸胃經(jīng)和腎經(jīng)，有養(yǎng)胃生津，滋陰清熱之效[1]，臨床上多用于熱病津液外溢所致的口渴、心煩、胃部不適、食欲不振、干嘔等癥，亦可用于熱邪不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目明目暗，筋骨乏力等。其具有多種藥用價值[2]，如抗腫瘤、抗突變、降血糖、抗氧化和增強機體免疫力等。由此可見，鐵皮石斛在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有非常重要的應(yīng)用前景。其中，有研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛增強機體免疫力的作用機理是增強腫瘤組織中的巨噬細胞吞噬功能，促進T淋巴細胞增殖分化，增強NK細胞活力。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛可顯著提高荷瘤動物的血清溶血素水平[3]，從而對機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生積極的影響?，F(xiàn)階段，對鐵皮石斛的研究主要關(guān)注多糖和甘露糖[4,5]等活性成分，并且其他化合物的研究也主要集中在分離和鑒定方面，缺少系統(tǒng)性地研究其營養(yǎng)成分含量。此外，不同產(chǎn)地的鐵皮石斛的功效成分存在差異，但相關(guān)研究仍然相對較少，這限制了該藥材在不同地區(qū)的綜合開發(fā)[6,7]。如今，隨著鐵皮石斛的人工種植技術(shù)越來越完善，在國內(nèi)的主要產(chǎn)地也越來越多，已經(jīng)有一定的規(guī)模栽培，目前市面上所用的商品化鐵皮石斛，其產(chǎn)地主要為國內(nèi)。在不同地區(qū)的人工種植基地中，因為不同的種源，不同的地理、氣候環(huán)境等原因[8,9]，很可能會導(dǎo)致在鐵皮石斛的組成和含量上出現(xiàn)不同。因此，不同的藥材之間必然存在著不同的藥效。針對鐵皮石斛，《中國藥典》將鐵皮石斛列為單獨品種，對鐵皮石斛品質(zhì)的評價方法是以多糖及醇溶性浸出物的含量為評價品質(zhì)好壞的標準[10-13]，但因其種類繁多，缺乏統(tǒng)一的名稱與規(guī)范，使得其真假鑒定成為中藥材鑒定的難點。鐵皮石斛是否安全有效，是否安全，是否能發(fā)揮藥效，也是制約其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的一個重要問題。因此，開展鐵皮石斛藥材的品質(zhì)調(diào)控研究[14]是亟待解決的科學(xué)問題。為探討不同產(chǎn)地鐵皮石斛的質(zhì)量，本試驗選取了4個不同產(chǎn)地的11批鐵皮石斛，對其主要活性成分進行了檢測，并對其主要活性成分進行了比較，通過分析其在浸出物、多糖、甘露糖和水分含量等方面的差異，來判斷不同產(chǎn)地的鐵皮石斛的質(zhì)量，進而對其質(zhì)量進行了初步的評價。2儀器與材料2.1儀器表2-1主要儀器信息表儀器名稱儀器廠家BSA225S-CW萬分之一電子天平廣州授科儀器科技有限公司RHP-100型高速多功能粉碎機CX51RF型生物數(shù)碼攝影顯微鏡GZX-9070MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱KSW型電阻爐溫度控制器HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋HY-2調(diào)速多用振蕩器TC-15套式恒溫器79-1磁力加熱攪拌器AA-7000原子吸收分光光度計UltiMate3000型高效液相色譜儀DT5-2型低速臺式離心機SHIMADZU紫外分光光度計UV-1780UltiMate3000型高效液相色譜儀浙江永康榮浩工貿(mào)有限公司JAPANOLYMPUSCORPORATION上海博迅實習(xí)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠余姚金電儀表有限公司常州澳華儀器有限公司江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠海寧市新華醫(yī)療器械廠常州澳華儀器有限公司日本島津公司美國戴安公司美國戴安公司美國戴安公司美國戴安公司2.2材料表2-2主要試藥信息表試藥名稱廠家批號鐵皮石斛對照藥材中國藥品生物制品檢定研究院121501-201402無水萄萄糖對照品中國藥品生物制品檢定研究院110833-201205續(xù)表2-2主要試藥信息表試藥名稱廠家批號甘露糖對照品中國藥品生物制品檢定研究院140651-201504鹽酸氨基葡萄糖中國藥品生物制品檢定研究院140649-200702表2-3主要試劑信息表試劑名稱廠家水合氯醛、甘油天津市致遠化學(xué)試劑有限公司三氯甲烷、甲醇、甲苯、甲酸乙酯廣州化學(xué)試劑廠甲酸、硫酸、乙醇、苯酚廣州化學(xué)試劑廠水屈臣氏蒸餾水表2-4主要樣品（鐵皮石斛）信息表編號批號樣品產(chǎn)地1YPA6A0001浙江樂清2YPA6A0002浙江樂清3YPA6A0003浙江樂清4YPA6A0004云南保山龍陵縣5YPA6A0005云南保山龍陵縣6YPA6A0006云南保山龍陵縣7YPA6A0007云南玉溪8YPA6A0008云南玉溪9YPA6A0009云南玉溪10YPA6A0010廣東高要11YPA6A0011廣東高要3實驗方法與結(jié)果3.1鐵皮石斛顯微和薄層鑒別的研究3.1.1顯微鑒別3.1.1.1鑒別方法將鐵皮石斛粉適量放置于清潔的載玻片上，制作成水合氯醛透化片及水合片，用顯微鏡對其進行觀測，并拍照作記錄。3.1.1.2鑒別特征本實驗對11批樣品的粉末進行觀察，發(fā)現(xiàn)樣品粉末呈暗黃綠色，草酸鈣呈針晶成束或散在。淀粉粒形狀為類圓，橢圓，星狀，半圓形，臍點多散于點狀，或成直線狀，或不可見，有時可見復(fù)粒。管道以梯形管道為主，纖維則多成束狀，且形狀較長棱形。有的纖維束外側(cè)還包含了小型薄壁細胞，其中含有硅質(zhì)塊。見圖3-1。1.草酸鈣針晶；2.淀粉粒；3.導(dǎo)管；4.纖維及硅質(zhì)塊圖3-1鐵皮石斛顯微圖3.1.2薄層鑒別3.1.2.1鑒別方法通過試驗研究，確定了鐵皮石斛的薄層色譜法為《中國藥典》2020版，其結(jié)果具有較好的重現(xiàn)性和明顯的特征，可以作為鐵皮石斛的薄層色譜法用于其薄層色譜法。3.1.2.2薄層色譜將對照藥材溶液和鐵皮石斛供試品溶液，用毛細管分別抽取2-5μL，滴在同樣的硅膠G薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（6:3:1）為鋪展劑，鋪展一段時間后，將鋪展好的樣品拿出來，鋪上10%的硫酸酒精，將其噴灑到95℃的溫度下，5分鐘后，置于紫外線（365nm）下觀察。結(jié)果表明，待測樣品和對照樣品的色譜峰上均出現(xiàn)了同色的熒光斑點。見圖3-2。（R：鐵皮石斛對照藥材；1～11號為鐵皮石斛供試品）圖3-2鐵皮石斛薄層色譜圖（紫外光365nm）3.2鐵皮石斛中水分與灰分的測定與結(jié)果3.2.1鐵皮石斛水分的測定及其結(jié)果《中國藥典》2020年版第四部分0832中的水份檢測方法，分別檢測了11個試樣的水份，每個試樣分別檢測了三次，11個試樣的水份含量在7.48%-9.63%之間，平均水份含量在8.51%之間。結(jié)果見表3-1。表3-1鐵皮石斛水分測定結(jié)果（，）樣品水分含量（%）RSD（%）18.94±0.111.4528.89±0.241.4939.00±0.201.5848.32±0.150.8757.93±0.092.6068.20±0.052.2478.05±0.010.1287.48±0.212.1697.66±0.131.92109.63±0.162.01119.51±0.170.233.2.2鐵皮石斛中灰分的測定及其結(jié)果按《中國藥典》2020年版第四部分2302中的總灰分含量測定方法，共11個批次，每個批次分別進行3個批次的灰分含量測定。11個批次的試樣，其總的灰分值在0.26%-0.38%之間，平均為0.31%。結(jié)果見表3-2。表3-2鐵皮石斛總灰分測定結(jié)果（，）樣品總灰分（%）RSD（%）10.32±0.040.30續(xù)表3-2鐵皮石斛總灰分測定結(jié)果（，）樣品總灰分（%）RSD（%）20.27±0.031.5430.31±0.051.3440.33±0.092.1150.30±0.022.4260.34±0.010.8770.29±0.012.5380.38±0.021.3890.26±0.051.45100.28±0.010.23110.35±0.012.963.3鐵皮石斛中二氧化硫殘留量與浸出物的測定及其結(jié)果3.3.1鐵皮石斛中二氧化硫殘留量的測定及其結(jié)果依照《中國藥典》2020版四部通則2331項下二氧化硫殘留量測定法，對11批樣品進行二氧化硫殘留量測定，每批平行測定3次。結(jié)果見表3-3。表3-3鐵皮石斛中二氧化硫殘留量測定結(jié)果（，）樣品二氧化硫殘留量（mg/kg）RSD（%）1--2--3--4--5--6--7--8--續(xù)表3-3鐵皮石斛中二氧化硫殘留量測定結(jié)果（，）樣品二氧化硫殘留量（mg/kg）RSD（%）9--10--11--注：“-”表示未檢出。對11批樣品進行二氧化硫殘留量測定，均未檢出二氧化硫殘留。3.3.2鐵皮石斛中浸出物的測定及其結(jié)果用《中國藥典》2020年版第四部分2201的乙醇浸出物方法，以11個批次的乙醇浸出物為對照，每個批次分別進行3次，乙醇浸出物比值在6.76%-9.28%之間，平均值在8.00%之間。結(jié)果見表3-4。表3-4鐵皮石斛浸出物測定結(jié)果（，）樣品醇溶性浸出物含量（%）RSD（%）18.13±0.141.7228.47±0.030.3537.91±0.040.5148.90±0.020.2259.28±0.050.0168.72±0.010.1176.84±0.111.6188.37±0.101.1996.76±0.091.33107.56±0.070.93117.09±0.020.283.4鐵皮石斛中甘露糖與葡糖糖峰面積比檢查方法與結(jié)果取一定量的葡萄糖對照品，與水配制成對照品液，每1mL含50μg。準確提取0.4mL，按照甘露糖中的含量測定方法進行測定。實驗結(jié)果表明，在不同條件下，葡萄糖峰面積的比值在2.4-5.8之間，平均為4.0。結(jié)果見表3-5。表3-5鐵皮石斛甘露糖與葡糖糖峰面積比測定結(jié)果（，）樣品甘露糖與葡糖糖峰面積比RSD（%）14.9±0.020.4122.4±0.052.0833.5±0.102.8644.0±0.010.2553.7±0.082.1663.2±0.122.7574.1±0.071.7185.8±0.111.9095.3±0.010.19104.2±0.061.43113.0±0.031.00

4鐵皮石斛的含量測定4.1鐵皮石斛中多糖的含量測定對照品溶液的制備取一定量的無水葡萄糖對照品，加水制成每1mL含90μg的溶液，即得對照品溶液。標準曲線的制備精密吸取對照品溶液分別為0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別放入10mL具塞試管中，再各加水補至1.0mL，精密加入5%苯酚溶液1mL（準備使用前配制），搖勻，再精密加入硫酸5mL，搖勻，加熱20分鐘后冷卻，再以相應(yīng)的試劑作為空白對照，依照紫外-可見分光光度法（《中國藥典》2020版通則0401），以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，測定488nm波長處的吸光度，繪制標準曲線。供試品溶液的制備用萬分之一電子天平精密稱定鐵皮石斛粉末（過九號篩）約0.3置于250mL錐形瓶中，加入水200mL，加熱回流2小時，取出放涼，將溶液倒入250mL量瓶中，少量多次方法的用水洗滌錐形瓶，將洗液一起放入同一量瓶中，加水至刻度定容，充分振蕩，濾過，精密吸取續(xù)濾液2mL，置于15mL離心管中，精密加入無水乙醇10mL，搖勻，放入冰箱或者制冷器冷藏1小時后取出，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）20分鐘，舍去上清液，沉淀物加8mL的80%乙醇，洗滌2次，離心，舍去上清液，沉淀物再加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，一段時間冷卻后，加水至刻度定容，充分振蕩，即得供試品溶液。測定法精密吸取1mL的供試品溶液，置于10mL具塞試管中，依照標準曲線制備項下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1mL”起，按照方法測定其吸光度，從標準曲線上記錄出供試品溶液中無水葡萄糖的量，計算，即得。4.2鐵皮石斛中甘露糖的含量測定采用《中國藥典》第20版總則0512號規(guī)定的HPLC法，對試樣中的甘露糖進行了分析。柱層析條件及體系適應(yīng)性研究：以十八烷基硅為填料；用乙腈-醋酸銨溶液0.02mol/L作為流動相（20∶80)；其檢測波長為250nm。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)甘露糖含量的峰值來推算，理論板數(shù)不小于4000。校正因子測定取一定量的鹽酸氨基葡萄糖，加水制成每1mL含12mg的內(nèi)標溶液。取甘露糖對照品約10mg，置于100mL量瓶中，精密加入內(nèi)標液1mL，加適量水溶解至刻度，搖勻，吸取400μL。加入0.5mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液與0.3mol/L的氫氧化鈉溶液各400μL，混勻，70℃水浴反應(yīng)100分鐘。加入0.3mol/L的鹽酸溶液500μL，混勻，用三氯甲烷洗3次，每次2mL，分離去除三氯甲烷液，水層離心后，取上清液10μL。注入液相色譜儀并測定，計算校正因子。測定法取鐵皮石斛粉末（過九號篩）約0.12g，加入索氏提取器中，加入一定量的80%乙醇，加熱回流提取4小時，除去酒精，同時將藥渣中的酒精揮發(fā)掉，將其打開，將其放置在燒杯中，倒入100mL的水，然后精確地加入2mL的內(nèi)標液，煎煮1個小時，不斷地攪拌，將其取出，冷卻后，再倒入100mL的清水，攪拌均勻，離心，精密吸取上清液1mL，將其放到一個安瓿瓶中，再添加3.0mol/L的鹽酸溶液0.5mL，將其封口，將其混勻，然后在110℃的高溫下進行一段時間的水解，然后拿出來，將其放冷，用3.0mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7，精密吸取400μL，依照校正因子測定方法，自“加入0.5mol/L的PMP甲醇溶液”起，根據(jù)方法操作，取上清液注入液相色譜儀并測定，即得。4.3測定結(jié)果鐵皮石斛中多糖和甘露糖含量測定結(jié)果見表4-1、圖4-1、圖4-2表4-1鐵皮石斛中多糖和甘露糖的含量（，）樣品多糖含量（%）RSD（%）甘露糖含量（%）RSD（%）145.71±0.030.0733.3±0.040.12244.36±0.010.0227.4±0.010.04348.37±0.100.2133.3±0.030.09443.17±0.070.1619.1±0.100.52529.29±0.060.2025.7±0.070.27630.32±0.050.1622.9±0.110.48741.45±0.030.0737.0±0.020.05833.33±0.080.2430.8±0.010.03930.33±0.010.1736.2±0.090.251028.31±0.020.0724.6±0.050.201132.40±0.040.1234.5±0.020.06圖4-1鐵皮石斛中無水葡萄糖標準曲線圖（A：混合對照品；B：鐵皮石斛樣品；1：甘露糖；2：D-鹽酸氨基葡萄糖；3：葡萄糖）圖4-2鐵皮石斛中甘露糖HPLC圖4.4不同產(chǎn)地鐵皮石斛的綜合評價——單因素分析法采用IBMSPSSStatistics19軟件，對這11批不同產(chǎn)地鐵皮石斛藥材中多糖含量的結(jié)果進行單因素數(shù)據(jù)分析處理，其處理結(jié)果見圖4-3，圖4-4，圖4-5。圖4-3方差齊性檢驗示意圖圖4-4主體間效應(yīng)檢驗結(jié)果圖圖4-5LSD比較示意圖由上圖4-3可知，不同產(chǎn)地鐵皮石斛中多糖含量的平均值的“顯著性”P=0.096>0.05，此數(shù)據(jù)屬于方差齊性，故可進行LSD比較。通過主體間效應(yīng)檢驗結(jié)果圖（即圖4-4）可知，不同產(chǎn)地鐵皮石斛之間多糖含量差異顯著，F(xiàn)值為4.534，顯著性水平Sig為0.046小于0.05,故可認為該組數(shù)據(jù)結(jié)果有意義。LSD的比較圖（即圖4-5）顯示，可以明顯發(fā)現(xiàn)浙江樂清與其他三個產(chǎn)地比較，其顯著性水平Sig均小于0.05，則可認為浙江樂清地區(qū)生產(chǎn)的鐵皮石斛多糖含量與其他三個地區(qū)存在明顯地顯著性差異。因此初步可以認為鐵皮石斛中多糖的含量可作為評價不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量的主要考察指標。5討論5.1研究發(fā)現(xiàn)在本次實驗研究中，采用2020版中國藥典方法對鐵皮石斛藥材進行薄層鑒別、水分檢查、灰分檢查、浸出物含量測定以及多糖、甘露糖含量測定等實驗分析。不同產(chǎn)地生產(chǎn)的鐵皮石斛活性化學(xué)成分含量差異明顯，受不同的地理、氣候環(huán)境、栽培方式等因素的影響,廣東高要地區(qū)的鐵皮石斛水分含量較高，分析原因可能與廣東的濕熱氣候有關(guān)。通過單因素分析法來分析多糖含量與不同產(chǎn)地間的影響，可以得知浙江樂清生產(chǎn)的鐵皮石斛多糖含量比其他三個產(chǎn)區(qū)的要高，分析原因可能與浙江的地理環(huán)境以及獨特的栽培方式有關(guān)。5.2研究價值與經(jīng)濟價值鐵皮石斛是一種名貴的中藥材，除了具有很高的藥用價值之外，還具有很高的研究價值以及經(jīng)濟價值。目前研究表明，鐵皮石斛中含有多種有效成分，如黃酮類、多糖類、生物堿類等，這些成分對于人體健康具有重要的作用。因此，對鐵皮石斛的深入研究可以為新藥的開發(fā)和臨床治療提供重要的依據(jù)。鐵皮石斛是一種珍貴的中藥材，市場需求量大，價格較高，具有很高的經(jīng)濟價值。因此，對鐵皮石斛的種植、加工、開發(fā)和利用等方面的研究，不僅可以促進中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，還可以為地方經(jīng)濟的發(fā)展提供重要的支撐和保障。由此可見，鐵皮石斛具有很高的藥用價值、研究價值和經(jīng)濟價值，對其進行深入研究和利用，對人類健康和社會經(jīng)濟發(fā)展都具有重要的意義。

6結(jié)論鐵皮石斛作為珍貴的藥材，具有多方面的生物學(xué)活性。本次實驗通過對3個省4個不同地區(qū)11批鐵皮石斛的水分、總灰分、浸出物、二氧化硫殘留量、多糖、甘露糖等進行比較分析，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛中含有大量的多糖與甘露糖等活性成分，它們之間可能存在著協(xié)同作用，從而發(fā)揮出抗氧化、抗衰老、提高免疫力等功效。對11個批次的鐵皮石斛的乙醇溶解提取物進行了分析，得到的結(jié)果為6.76%-9.28%，其中龍陵寶山縣編號5的醇溶性浸出物含量最高，含量最低則為云南玉溪編號9，平均值為8.00%，全部處于2020版《中國藥典》標準規(guī)定范圍內(nèi)（不得少于6.5%），浸出物含量普遍偏高，原因可能是樣品藥材在超微粉碎之后的溶出率增加有關(guān)；多糖含量結(jié)果為28.31%～45.71%，其中多糖含量最高的為浙江樂清編號3，含量最低的為廣東高要編號10，平均值為38.10%，全部都處于2020版《中國藥典》標準規(guī)定范圍內(nèi)（不得少于25.0%），其中浙江樂清產(chǎn)地三個批次的鐵皮石斛的多糖含量較高，但各個地區(qū)鐵皮石斛整體品質(zhì)良好；甘露糖含量結(jié)果為19.1%～37.0%，平均值為29.5%，均符合標準規(guī)定（本品按干燥品計算，含甘露糖應(yīng)為13.0%～38.0%）；其甘露糖和葡糖峰面積比結(jié)果為2.4～5.8，平均值為4.0，同樣在標準規(guī)定內(nèi)（甘露糖和葡糖峰面積比應(yīng)為2.4～8.0），甘露糖與葡糖糖峰面積比不高，可能與鐵皮石斛經(jīng)過凈選、浸泡、粉碎等工序有關(guān)，這些步驟大大降低了藥材本身的甘露糖含量。不同產(chǎn)地鐵皮石斛中多糖與甘露糖所占比例可能不同[15,16]，這一指標還有待研究；在有害元素方面，11批樣品均未檢測出二氧化硫殘留，分析原因可能與鐵皮石斛原藥材不進行二氧化硫熏蒸加工有關(guān)。其水分、總灰分含量也處于標準規(guī)定范圍內(nèi)（水分不得過12%；總灰分不得過6%)，水分含量不高，可能是與藥材超微粉碎之后的滅菌干燥工藝有關(guān)，干燥使藥材內(nèi)部水分大大減少；鐵皮石斛的總灰分含量較低，主要是由于其經(jīng)過了“凈選”、“浸泡”和“粉碎”等工序，使其自身的雜質(zhì)大大減少。研究結(jié)果表明，鐵皮石斛的品質(zhì)受到環(huán)境的影響，在不同產(chǎn)地之間存在較大差異。通過對3個不同省份4個不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛的理化性狀分析，得出浙江、云南兩地的鐵皮石斛質(zhì)量較好，尤以浙江樂清為最好。浙江是鐵皮石斛最大的產(chǎn)地，其栽培經(jīng)驗豐富，資源經(jīng)營體制完善，是其優(yōu)質(zhì)品質(zhì)形成的重要因素。此外，樂清地區(qū)具有適宜的氣候條件和海拔高度[17]，有利于鐵皮石斛有效成分的積累。浙江樂清地區(qū)生產(chǎn)的3批鐵皮石斛，采用比較貼近自然的栽培方式——仿野生栽培方式，對傳統(tǒng)的大棚種植培養(yǎng)模式而言，前者更有利于其活性成分的積累[18]。此次實驗初步比較了浸出物、多糖、甘露糖、水分和總灰分等指標的差異，為鐵皮石斛的品質(zhì)評價提供了一定參考，但還需要進一步研究其他影響其活性成分累積的因素，以為人工栽培鐵皮石斛提供科學(xué)指導(dǎo)。

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