課件速覽-細(xì)胞色素C提取液的中和

項(xiàng)目二細(xì)胞色素C的生產(chǎn)任務(wù)四細(xì)胞色素C提取液的中和嚴(yán)格遵循《細(xì)胞色素C提取液的中和崗位標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》及相關(guān)操作規(guī)程，用氨水將細(xì)胞色素C的提取液調(diào)pH至等電點(diǎn)，靜置過濾除去雜蛋白，得到紅色濾液供后續(xù)工序使用。任務(wù)描述細(xì)胞色素C提取液的中和2任務(wù)支撐（一）細(xì)胞色素C提取液的中和目的細(xì)胞色素C的提取液中除了目標(biāo)物細(xì)胞色素C，還含有很多其他非目標(biāo)蛋白質(zhì)，稱為雜蛋白，可以利用等電點(diǎn)沉淀法除去目的產(chǎn)物之外的雜蛋白。細(xì)胞色素C的等電點(diǎn)為10.7，因此可以用硫酸銨進(jìn)行pH調(diào)節(jié)中和，調(diào)至pH7.2，此時(shí)等電點(diǎn)接近7.2的一些堿性雜蛋白溶解度小，從溶液中沉淀出來。3細(xì)胞色素C提取液的中和（二）固相析出技術(shù)4等電點(diǎn)沉淀法屬于固相析出技術(shù)中的一種分離方法，在工業(yè)生產(chǎn)中，生物物質(zhì)的最終產(chǎn)品許多是以固體形式出現(xiàn)的。通過加入不同試劑或改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分離出來的操作技術(shù)稱為固相析出分離技術(shù)。固相析出技術(shù)根據(jù)析出固體的形式分為兩種類型：沉淀法和和結(jié)晶法。析出的固體是晶體時(shí)稱為結(jié)晶法，析出物是無定形固體時(shí)稱為沉淀法。固相析出技術(shù)結(jié)晶法沉淀法析出固體為無定形固體析出固體為晶體（二）固相析出技術(shù)沉淀法也稱溶解度法，基本原理是根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離的目的。等電點(diǎn)沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法鹽析法選擇性變性沉淀法有機(jī)聚合物沉淀法5（三）等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法是利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)狀態(tài)下的溶解度最低而沉淀析出的原理。適用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其它屬于兩性電解質(zhì)組分的沉淀分離，如大豆蛋白“堿提酸沉”的提取方法。大豆蛋白質(zhì)溶解度與pH的關(guān)系6等電點(diǎn)沉淀法原理在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零（即正負(fù)電荷相等），此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物。（三）等電點(diǎn)沉淀法7等電點(diǎn)沉淀法操作注意問題蛋白質(zhì)種類不同的蛋白質(zhì)，具有不同的等電點(diǎn)。在生產(chǎn)過程中應(yīng)根據(jù)分離要求，采用合適的pH值生產(chǎn)目的產(chǎn)物或者除去目的產(chǎn)物以外的雜質(zhì)。鹽離子對(duì)等電點(diǎn)的影響蛋白質(zhì)若結(jié)合較多的陰離子（如Cl-、SO42-等），則等電點(diǎn)移向較低的pH值；蛋白質(zhì)結(jié)合較多的陽離子，則等電點(diǎn)的pH值升高目的成分對(duì)pH值的要求盡可能避免直接用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿調(diào)節(jié)pH值，以免局部過酸或過堿；調(diào)節(jié)pH值應(yīng)以盡量不增加新物質(zhì)為原則（三）等電點(diǎn)沉淀法8（四）結(jié)晶法9結(jié)晶：是從氣相或液相中生成形狀一定、分子（或原子、離子）有規(guī)則排列的晶體的現(xiàn)象。結(jié)晶是新相生成的過程，是利用溶質(zhì)之間溶解度的差別進(jìn)行分離純化的一種擴(kuò)散分離操作，這一點(diǎn)與沉淀的生成原理是一致的。兩者的區(qū)別在于：結(jié)晶是內(nèi)部結(jié)構(gòu)的質(zhì)點(diǎn)元（原子、分子、離子）作三維有序規(guī)則的排列，形成形狀一定的固體粒子。而沉淀則是無規(guī)則排列的、無定形粒子。結(jié)晶的形成需要嚴(yán)密控制的操作條件下進(jìn)行，因此結(jié)晶的純度遠(yuǎn)高于沉淀。在生物技術(shù)中，結(jié)晶主要應(yīng)用于抗生素、氨基酸、有機(jī)酸等小分子的生產(chǎn)中，以作為精制的一種手段。10幾種典型的晶體結(jié)構(gòu)

雪花的結(jié)晶體（四）結(jié)晶法11幾種典型的晶體結(jié)構(gòu)山梨醇結(jié)晶硫酸鈉結(jié)晶

淀粉酶結(jié)晶

檸檬酸結(jié)晶（四）結(jié)晶法晶體基本特性晶體---內(nèi)部結(jié)構(gòu)中的質(zhì)點(diǎn)元素（原子、離子、分子）作三維有序規(guī)則排列的固態(tài)物質(zhì)。12（四）結(jié)晶法(a)晶體結(jié)構(gòu)

(b)晶格

(c)晶胞結(jié)晶過程13（四）結(jié)晶法物質(zhì)在溶解時(shí)一般要吸收熱量，在結(jié)晶時(shí)放出熱量，稱為結(jié)晶熱。相反的情況，即溶解時(shí)放熱，結(jié)晶時(shí)吸熱，比較少見。因此結(jié)晶又是一個(gè)同時(shí)有質(zhì)量和熱量傳遞的過程。①

形成過飽和溶液②

晶核形成③

晶體生長(zhǎng)。溶液達(dá)到過飽和是結(jié)晶的前提，過飽和度是結(jié)晶的推動(dòng)力。14飽和曲線與過飽和曲線A穩(wěn)定區(qū)：不飽和區(qū)B第一介穩(wěn)區(qū)：加入晶種結(jié)晶會(huì)生長(zhǎng)，但不產(chǎn)新晶核C第二介穩(wěn)區(qū)：加入晶種結(jié)晶會(huì)生長(zhǎng)，同時(shí)有新晶核產(chǎn)生D不穩(wěn)區(qū)：瞬時(shí)出現(xiàn)大量微小晶核，發(fā)生晶核泛濫溶解度與顆粒大小的關(guān)系（四）結(jié)晶法過飽和度曲線可多條溶解度曲線只有一條14（四）結(jié)晶法曲線AB

為飽和溶解度曲線，在此線以下的區(qū)域?yàn)椴伙柡蛥^(qū)，稱為穩(wěn)定區(qū)。曲線CD

為過飽和溶解度曲線，在此曲線以上的區(qū)域稱為不穩(wěn)區(qū)。而介于曲線AB和CD之間的區(qū)域稱為亞穩(wěn)區(qū)。在穩(wěn)定區(qū)的任一點(diǎn)溶液都是穩(wěn)定的，不管采用什么措施都不會(huì)有結(jié)晶析出。在亞穩(wěn)區(qū)的任一點(diǎn)，如不采取措施，溶液也可以長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定，如加入晶種，溶質(zhì)會(huì)在晶種上長(zhǎng)大，溶液的濃度隨之下降到AB線。曲線說明15過飽和溶液形成的方法

16（四）結(jié)晶法①熱飽和溶液冷卻法該法適用于溶解度隨溫度降低而顯著減小的場(chǎng)合，即溶解度隨溫度升高而顯著減小的場(chǎng)合宜應(yīng)采用降溫結(jié)晶。由于該法基本不除去溶劑，而是使溶液冷卻降溫，也稱之為等溶劑結(jié)晶。

例：L-脯氨酸的濃縮液降至4℃，放置4h，就會(huì)大量結(jié)晶析出。若溶解度隨溫度的升高而降低，則采用升溫結(jié)晶法。如紅霉素結(jié)晶。②部分溶劑蒸發(fā)

蒸發(fā)法是借蒸發(fā)除去部分溶解劑的結(jié)晶方法，也稱等溫結(jié)晶法，它使溶液在加壓，常壓或減壓下加熱蒸發(fā)達(dá)到過飽和。此法主要適用于溶解度隨溫度的降低而變化不大的物系或隨溫度升高溶解度降低的物系。蒸發(fā)法結(jié)晶消耗熱能最多，加熱面結(jié)垢問題使操作遇到困難，一般不常采用。如真空濃縮赤霉素的乙酸乙酯萃取劑。過飽和溶液形成的方法

17（四）結(jié)晶法③化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法

化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法是加入反應(yīng)劑或調(diào)節(jié)pH值使新物質(zhì)產(chǎn)生的方法，當(dāng)其濃度超過溶解度時(shí)，就有結(jié)晶析出。例：紅霉素乙酸丁酯提取液中加入硫氰酸鹽，并調(diào)節(jié)pH為5左右，可生成紅霉素硫氰酸鹽結(jié)晶。④

解析法

解析法是向物系中加入某些物質(zhì)，從而使溶質(zhì)在溶劑中的溶解度降低而析出。這些物質(zhì)被稱為沉淀劑，它們既可以是固體，也可以是液體或氣體。沉淀劑最大的特點(diǎn)是極易溶解于原溶液的溶劑中。

這種結(jié)晶的方法也叫做鹽析反應(yīng)結(jié)晶法，常用沉淀劑有中性鹽、甲醇、乙醇和丙酮等。

如在卡那霉素脫色的水溶液中加入95%的乙醇，加入量為脫色液的60%-80%，攪拌6h，卡那霉素硫酸鹽結(jié)晶析晶核的生成18（四）結(jié)晶法晶核的形成根據(jù)機(jī)理不同，可以分為兩種，即初級(jí)成核和二次成核。兩者的區(qū)別在于有沒有晶種的存在。前者為當(dāng)無晶種存在時(shí)，而后者則為有晶種存在時(shí)產(chǎn)生。初級(jí)成核分為均相成核和非均相成核。

均相成核是指溶液在較高過飽和度下自發(fā)生成晶核的過程。(容易形成晶核泛濫)

非均相成核是指溶液在外來干擾（如顆粒、攪拌）的誘導(dǎo)下生成晶核的過程。二次成核：過飽和溶液以較大流速流過正在生長(zhǎng)的晶體表面是，液體邊界層出現(xiàn)剪切力，將晶體表面的粒子掃落，大的作晶核，小的溶解（流體剪切力成核）；晶體與攪拌器等外部物體碰撞（碰撞成核）時(shí)導(dǎo)致晶體破碎產(chǎn)生的微小晶體過程★

工業(yè)結(jié)晶主要采用二次成核作為晶核主要來源晶體的生長(zhǎng)19（四）結(jié)晶法晶核一旦從溶液中形成后，便不斷吸收溶質(zhì)分子，并在空間按一定的晶格而排列，晶體得以成長(zhǎng)。

如晶核形成速率大大超過其生長(zhǎng)速率，則過飽和度主要用來生成新的晶核，因而得到細(xì)小的晶體，甚至呈無定形狀態(tài)。反之如果晶體生長(zhǎng)速率大于成核速率，則得到粗大的晶體。晶體的生長(zhǎng)速度影響因素20（四）結(jié)晶法雜質(zhì)改變晶體和溶液之間界面的滯留層特性，影響溶質(zhì)長(zhǎng)入晶體、改變晶體外形、因雜質(zhì)吸附導(dǎo)致的晶體生長(zhǎng)緩慢；過飽和度增高，結(jié)晶速率增大，但同時(shí)引起黏度增加，結(jié)晶速率增大受阻。適當(dāng)加強(qiáng)攪拌，加速晶體生長(zhǎng)、加速晶核的生成；適當(dāng)提高溫度，促進(jìn)表面化學(xué)反應(yīng)速度的提高，增加結(jié)晶速度。04030201生產(chǎn)前準(zhǔn)備等電點(diǎn)沉淀法除雜離心分離清場(chǎng)任務(wù)實(shí)施21細(xì)胞色素C提取液的中和1.確認(rèn)與填寫檢查記錄確認(rèn)是否有前批清場(chǎng)合格證副本，確認(rèn)生產(chǎn)環(huán)境、衛(wèi)生和設(shè)備器具是否符合要求；填寫《細(xì)胞色素C提取液的中和產(chǎn)前檢查記錄》2.領(lǐng)料與溶液配制領(lǐng)取生產(chǎn)用試劑耗材物料并配液：（1）細(xì)胞色素C提取液（2）1mol/L氨水溶液配制標(biāo)準(zhǔn)：取25%氨水74.97mL，用純化水稀釋至1L（一）生產(chǎn)前準(zhǔn)備22（二）等電點(diǎn)沉淀法除雜2.調(diào)節(jié)pH1.配制氨水23配制1mol/L氨水溶液將提取液置于2000mL燒杯中，開啟攪拌，用1mol/L氨水將提取液的pH調(diào)節(jié)至7.2，關(guān)閉攪拌，靜置離心結(jié)束后收集上清液量取上清液體積（三）離心分離2.收集上清液前述提取液靜置至無新固體析出后，用離心機(jī)在4℃，以5000rpm離心30min處理混合液1.低溫離心24（四）清場(chǎng)

檢查、整理各項(xiàng)記錄。規(guī)范地存放生產(chǎn)用試劑，清洗器具，維護(hù)設(shè)備，處置廢物和廢液，清潔、消毒工作臺(tái)和潔凈室。最后，填寫清場(chǎng)合格證。注意：請(qǐng)?jiān)谌蝿?wù)實(shí)施過程中規(guī)范填寫《細(xì)胞色素C提取液的中和操作記錄》，不可補(bǔ)填和篡改！25知識(shí)學(xué)習(xí)反思與反饋學(xué)習(xí)成果實(shí)踐操作考核與評(píng)價(jià)26拓展任務(wù)味精的結(jié)晶制備——等電點(diǎn)沉淀結(jié)晶法提取谷氨酸27查閱資料，了解谷氨酸（又名麩酸）的性質(zhì)，理解任務(wù)中pH參數(shù)設(shè)置的依據(jù)查閱設(shè)計(jì)《等電點(diǎn)沉淀結(jié)晶法提取谷氨酸操作記錄》，在任務(wù)實(shí)施過程中同步填寫根據(jù)實(shí)訓(xùn)操作具體步驟，使用等電點(diǎn)結(jié)晶法完成提取谷氨酸的操作設(shè)計(jì)實(shí)操設(shè)計(jì)（一）任務(wù)描述28（二）實(shí)訓(xùn)材料1.材料、試劑谷氨酸發(fā)酵液（谷氨酸含量為8%～10%，如沒有發(fā)酵液，可配制8%～10%味精溶液替代）、硫酸。2.儀器設(shè)備磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、pH試紙、100mL容量瓶。29（三）實(shí)訓(xùn)操作0504030201配制溶液起晶前調(diào)酸起晶和育晶調(diào)至等電點(diǎn)育晶谷氨酸分離硫酸(3mol/L)：取16mL硫酸，緩緩注入水中，冷卻至室溫，加水稀釋至100mL降溫至30℃加硫酸（3mol/L）調(diào)節(jié)pH至4.0～4.5（起晶中和點(diǎn)），pH調(diào)節(jié)至5.0之前加酸速度可以快些，控制調(diào)酸操作在1～2h內(nèi)完成。在23～25℃，pH4.4～4.8條件下，晶核析出，停止加酸，投入α-型晶種0.1%～0.3%，攪拌育晶1～2h溫